CRISPR/Cas9敲除pyk2基因对人脑胶质瘤细胞增殖、迁移及侵袭能力的影响

为了探讨富含脯氨酸的酪氨酸激酶(proline rich tyrosine kinase2,Pyk2)对人脑胶质瘤U251细胞增殖及侵袭能力的影响,设计了2对以pyk2为靶基因的sgRNA片段,以px335质粒为载体,构建CRISPR/Cas9重组质粒,转染至人脑胶质瘤U251细胞中,同时设置野生型U251细胞作为对照组。通过酶切鉴定及Western blot分析筛选阳性单克隆细胞,并测序揭示突变位点。筛选出的阳性单克隆细胞作为实验组,经RTCA法比较后,发现实验组细胞的增殖能力较对照组明显下降,且具有统计学意义(P<0.05);Transwell小室法及划痕实验的结果均证实,较对照组,实验组细胞的体外侵袭及迁移能力受到明显的抑制,差异显著(P<0.05)。作为验证侵袭能力的代表,基质金属蛋白酶9(matrix metalloprotein 9,MMP9)在Western blot实验中表达量较对照组也明显下降。通过上述方法成功得到目的基因敲除的稳定细胞株,并证实敲除pyk2基因能明显的抑制人脑胶质瘤细胞的增殖、迁移及侵袭能力。

PYK2靶向短发夹RNA干扰重组体的构建及鉴定

目的:本研究利用RNA干扰技术,以PYK2为靶基因,设计构建重组体,并对重组体进行鉴定,为下一步探索心肌纤维化机制的新途径奠定基础。方法:设计有小发夹结构的8条DNA序列,经退火成互补4对双链,再克隆到载体PAVU6+27中构建重组体,转化入JM109菌株,提取质粒进行酶切鉴定、测序分析。结果:酶切鉴定和测序分析均提示PYK2靶向RNA干扰重组体的构建成功。结论:PYK2靶向RNA干扰重组体的成功构建,为下一步利用该重组体沉默心脏成纤维细胞中PYK2基因的表达,探索心肌纤维化机制打下基础。