黄河裸裂尻鱼人工繁殖技术在生产实践中的应用

立足生产实践,具体阐述黄河裸裂尻鱼(Schigoygopsis pylzovi)人工繁殖技术的具体方法步骤、优缺点以及提高黄河裸裂尻鱼人工繁殖效率的措施。

不同养殖环境对黄河裸裂尻鱼苗生长及成活率的影响

黄河裸裂尻鱼是我国特有的黄河上游珍稀物种,近年黄河上游生态环境日益恶化,为挽救黄河裸裂尻鱼,而异地人工繁殖保种和提高繁殖成活率,是最为有效的技术途径。本试验通过加强黄河裸裂尻鱼鱼苗培育管理技术,探索不同养殖环境下的培育管理技术,投喂饵料及养殖环境的过渡技术,提高鱼苗成活率,优化黄河裸裂尻鱼鱼苗培育管理技术。试验结果表明:刚上浮鱼苗前期在池塘培育更有利于鱼苗开口摄食,体长相对增长率为68.6%、体重相对增长率为77.6%,肥满度为22.48,均比水族缸培育期间高;在池塘培育30 d后过渡到水族缸培育,水族缸培育阶段成活率为83.2%、89.5%、94.1%、93.1%,均比池塘培育阶段成活率高。

黄河裸裂尻鱼肌肉生长抑制素基因克隆及表达分析

肌肉生长抑制素(myostatin,MSTN)属于转化生长因子β(TGF-β)超家族中的一个成员,是骨骼肌生长发育的负调控因子。该文以黄河裸裂尻鱼肌肉总RNA为模板,采用RT-PCT、5'-RACE和3'-RACE法获得MSTN基因全长cDNA序列为2180bp,包含长为1128bp的开放阅读框,编码375个氨基酸。以肌肉总DNA为模板,通过PCR法进一步获得了MSTN基因的2个内含子序列,分析表明,黄河裸裂尻鱼MSTN基因与其他脊椎动物具有相似的基因结构(包括3个外显子和2个内含子)。黄河裸裂尻鱼MSTN具有脊椎动物MSTN的共同序列特征,含有1个蛋白酶水解位点RXXR和8个位于TGF-β功能区域保守的半胱氨酸残基。氨基酸序列同源性分析表明,黄河裸裂尻鱼MSTN序列与其他鲤科鱼类MSTN具有较高的同源性;而与哺乳动物和禽类的MSTN同源性较低。系统发育分析表明,黄河裸裂尻鱼MSTN与其他鲤科鱼类聚于同一进化支。RT-PCR分析表明,该基因在黄河裸裂尻鱼9个被检组织中均有表达,但在心、肾、肠、精巢中表达量较高。Real-TimePCR分析显示,MSTN基因在胚胎中的相对表达量,随胚胎发育阶段的不同而有所差异,暗示MSTN的功能可能并不局限在对肌肉生长发育的负调控作用,可能还有其他功能。

黄河裸裂尻鱼五种群mtDNA控制区的遗传结构

黄河裸裂尻鱼(Schizopygopsis pylzovi)主要分布于青藏高原东北部兰州以上黄河干支流水系和高原北部柴达木内流水系,由于其对高原特殊生境表现出独特的适应性而受研究者关注。本文采用聚合酶链式反应(PCR)和直接测序的方法获得了一个分布于柴达木内流水系种群和四个黄河支流种群共99条个体的线粒体DNA(mtDNA)控制区(D-loop)821bp核苷酸的序列,探讨了其种群遗传结构和分化。99条个体的序列经比对后,发现77个(9.37%)多态性位点,共定义了53个单倍型,其中有一个单倍型(DT12)为两个种群(大通种群和互助种群)所共享,其余52个单倍型均为某个种群所特有。遗传多样性分析表明,柴达木种群的单倍型多样度(h=0.79±0.06)和核苷酸多样度(π=0.0027±0.0017)均略低于黄河支流各种群。AMOVA分析结果显示,遗传差异主要发生在种群之内,占75.39%,而不同水系的种群间只有24.61%,各种群间成对的Fst及遗传距离均表明种群间出现了一定程度的种群分化,但系统进化树显示出一种混杂的单倍型分布格局,提示青藏高原东北部地质事件所造成的水系间的隔离形成较晚。单倍型歧点分布呈现为单峰以及中性检验Tajima的D(-1.497,P=0.058)和Fu的Fs(-24.741,P=0.001)结果综合表明,黄河裸裂尻鱼在青藏高原隆升过程中曾经历过近期的种群扩张事件。

黄河裸裂尻鱼染色体核型的初步研究

采用活体PHA—秋水仙素注射法,研究黄河裸裂尻鱼的染色体核型。试验结果表明,黄河裸裂尻鱼二倍体染色体数目为2n=92,核型式为24m+24 sm+22 st+22 t,NF=130。黄河裸裂尻鱼可能是二倍化了的四倍体,可能起源于鲃亚科中某些原始类型。

黄河裸裂尻鱼乳酸脱氢酶同工酶研究

采用聚丙烯酰胺凝胶垂直板电泳技术,对黄河裸裂尻鱼的血清、鳃、肝脏、性腺、心脏、鳔、肾脏、眼、脑和肌肉组织的乳酸脱氢酶同工酶(LDH同工酶)进行了研究。试验结果表明,各种组织均表现出明显的组织特异性。黄河裸裂尻鱼是二倍化了的四倍体,可能起源于鲃亚科。

黄河裸裂尻鱼MSTN基因RNA干扰研究

目的利用反义寡合甘酸技术抑制肌肉生长抑制素(myostatin,MSTN)的表达,评估MSTN基因的沉默效果,并检测RNA干扰后对下游基因的影响。方法通过构建黄河裸裂尻鱼(Schizopygopsis pylzovi)MSTN基因RNA干扰(RNAi)重组腺病毒载体1P3(DSP MSTN 273+250+1737)和1P2(DSP MSTN 195+1670),并将其注射黄河裸裂尻鱼肌肉组织,进行活体RNA干扰;利用real-time PCR和Western blotting评估MSTN基因的沉默效果,并检测MSTN基因RNA干扰后肌肉肌酸激酶(muscle-type creatine kinase,M-CK)基因转录水平的调控作用。结果real-time PCR分析结果表明,与HK组(病毒通用阴性对照组)和N组(空白对照组)相比,重组腺病毒载体1P3对黄河裸裂尻鱼肌肉MSTN基因的转录具有明显的干扰作用(P<0.05),抑制率达53.5%;而重组腺病毒载体1P2对MSTN基因的转录无明显干扰作用(P>0.05)。Western-blotting分析结果与real-time PCR结果相一致。同时,经1P3干扰后随着MSTN基因转录水平的下降,其肌肉肌酸激酶M-CK基因表达水平显著上升。结论通过RNAi技术能够有效的抑制MSTN基因的表达,并能够上调M-CK基因的表达量。因此,证明了在黄河裸裂尻鱼中MSTN能够抑制M-CK的转录。揭示高原土著鱼类MSTN基因的对肌肉的生长发育起到调控作用。

黄河裸裂尻鱼无乳链球菌的分离鉴定与多位点序列分型

2015年10月四川省雅安市某养殖场的黄河裸裂尻鱼(Schizopygopsis pylzovi Kessler)暴发传染病,临床表现为神经症状,眼球、下颌和鳃盖等出血或无明显临床表现而突然死亡,内脏涂片见革兰氏阳性球菌。从病鱼的肝、脾和肾组织中分离到2株病原菌(ZYW151011,ZYW151012),通过人工感染、无乳链球菌种属特异性cfb基因(GBS-specific gene cfb,CAMP factor)的PCR检测和16S r RNA基因序列分析等方法对病原菌进行鉴定,发现2株病原菌均为无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)。2株病原菌16S r RNA序列(Gen Bank登录号:KU308396和KU308397)与Gen Bank中无乳链球菌16S r RNA序列同源性达99.8%。药敏试验结果表明,2株病原菌对头孢类和喹诺酮类药物敏感,而对强力霉素、氟苯尼考和阿莫西林等耐药。进一步通过荚膜多糖血清分型和多位点序列分型技术对病原菌进行分子特征分析,结果表明2株病原菌荚膜多糖血清型均为致病性Ia型;2株病原菌多位点序列分型均被鉴定为新的序列型ZST-1,与序列型为ST-261的亲缘关系最近,此新型ZST-1在gln A位点发生变异,提交序列到MLST数据库获得新的等位基因编号81(登录ID:BIGSdb_20151110 081850_13025_35759)。

黄河裸裂尻鱼消化道与肝胰脏淀粉酶的分布与特性研究

[目的]探究黄河裸裂尻鱼胃肠道及肝胰脏淀粉酶的分布与特性。[方法]采用碘—淀粉比色法,测定黄河裸裂尻鱼胃、肠道、肝胰脏淀粉酶的活性及其最适反应pH和温度。[结果]黄河裸裂尻鱼淀粉酶活性的大小依次为后肠、前肠、胃、中肠、肝胰脏;胃、肝胰脏、肠道淀粉酶最适pH分别为6.0、7.0、6.0,最适反应温度均为20.0℃。[结论]黄河裸裂尻鱼整个消化道都对淀粉表现出较强的消化能力,尤其是后肠。与其他鱼类相比,黄河裸裂尻鱼淀粉酶最适反应温度偏低,这与黄河裸裂尻鱼所处的生态环境相适应。

青海湖裸鲤和黄河裸裂尻鱼感染多子小瓜虫的病理学比较研究

为探讨不同裂腹鱼类感染多子小瓜虫后的病理学差异,利用多子小瓜虫对青海湖裸鲤指名亚种(Gymnocypris przewalskii przewalskii)和黄河裸裂尻鱼(Schizopygopsis pylzovi Kessler)实施感染实验,并对2种鱼进行了深入的病理学研究。研究结果显示:(1)2种鱼的死亡量均呈现先激增后明显回落的趋势,青海湖裸鲤死亡高峰在感染后第3至第4天,黄河裸裂尻鱼死亡高峰在第3至第5天,青海湖裸鲤的死亡比黄河裸裂尻鱼急剧。(2)感染后2种鱼体表均出现大量肉眼可见的白点。青海湖裸鲤皮肤黏液分泌量明显增加,体表形成胶状黏液层,黏液层中见不同细胞期小瓜虫包囊。黄河裸裂尻鱼鳍出现蛀鳍现象,皮肤出现细菌感染样溃烂。(3)解剖发现,感染组青海湖裸鲤和黄河裸裂尻鱼肝脏发生病理改变呈淡黄色,胆有不同程度肿大。(4)组织切片和电镜观察显示,小瓜虫在鳃部位的寄生导致青海湖裸鲤和黄河裸裂尻鱼鳃丝黏连,鳃小片和鳃丝上皮细胞萎缩、脱落,鳃丝结构被严重破坏。小瓜虫在2种鱼皮肤的寄生使寄生部位组织突起,周围组织塌陷。青海湖裸鲤表皮下层出现空隙,表皮结构被严重破坏。黄河裸裂尻鱼皮肤表皮细胞出现空泡化病理改变,失去原有紧密结构,表皮层和固有层间界限变模糊。综上所述,小瓜虫的感染对青海湖裸鲤和黄河裸裂尻鱼的鳃和皮肤组织造成严重损伤,但2种鱼表现的症状和造成的组织损伤类型有明显差异,这与2种鱼长期适应不同水体环境密切相关。

黄河裸裂尻鱼肥胖基因克隆及其对青藏高原季节性冷环境的适应性表达

目的克隆黄河裸裂尻鱼肥胖基因(obese gene,ob),分析编码蛋白leptin的序列特征,检测ob mR-NA的组织特异性表达和不同环境温度下肝胰脏和白肌ob mRNA的相对表达水平,为探究黄河裸裂尻鱼在青藏高原季节性寒冷环境下的生态适应机制提供科学数据。方法利用RT-PCT、5'-RACE和3'-RACE法获得ob基因全长cDNA序列。通过已知cDNA序列设计半定量RT-PCR和real-time PCR引物,进行表达研究。结果黄河裸裂尻鱼ob基因序列全长为1 337 bp,其中开放阅读框(ORF)长513 bp,编码170个氨基酸。黄河裸裂尻鱼ob mRNA在心脏、肾脏、脂肪、肠、精巢、肝胰脏、鳃、脑和肌肉9个被检组织中均有表达,其中在心脏中表达最强,肌肉组织中表达最弱。栖息水域环境温度下降,将显著抑制黄河裸裂尻鱼肝胰脏和白肌ob mRNA的表达。结论黄河裸裂尻鱼ob基因特殊的组织表达特征可能与其特定组织的能量代谢及其特殊的生物学功能有关。Leptin在黄河裸裂尻鱼能量代谢调节和季节性环境适应方面发挥着重要作用。

硬骨鱼类血红蛋白转换表达的新模式——以黄河裸裂尻鱼胚胎型血红蛋白研究为例

为了探讨高原硬骨鱼类胚胎型血红蛋白的转换表达模式,研究利用转录组数据和克隆方法研究了黄河裸裂尻鱼(Schizopygopsis pylzovi)胚胎型血红蛋白的组成和基因结构,并通过qRT-PCR和整胚原位杂交方法确定了胚胎发育过程中血红蛋白基因的表达情况。结果表明,黄河裸裂尻鱼胚胎型血红蛋白基因由hbae1、hbae4、hbbe1和hbbe3组成,均包含3个外显子和2个内含子,其中hbbe1/hbae1以“头对头”(3′-5′—5′-3′)转录方式串联在一起,hbbe3/hbae4则以“尾对尾”(5′-3′—3-5′)的转录方式串联在一起。进一步的研究初步判断hbae3、hbae5和hbbe2基因在裂腹鱼亚科鱼类进化过程中可能发生了丢失。qRT-PCR和整胚原位杂交结果均表明在早期胚胎发育过程中4个胚胎型血红蛋白基因的表达都是从受精后第5天(120 hpf)开始明显上升,但是hbae4和hbbe3基因的高表达只维持在受精后第5天(120 hpf)至破膜期(216 hpf),随后急剧下降,而hbae1和hbbe1基因表达从破膜(216 hpf)开始急剧上升。研究揭示了硬骨鱼类一种全新的血红蛋白转换表达模式,这可能与黄河裸裂尻鱼特殊的进化历程和高原环境的适应有关,研究结果将为进一步深入研究硬鱼类血红蛋白的时序转换表达和环境适应机制奠定基础。

黄河上游2种裂腹鱼感应流速及其与体长的关系

为了探究鱼类感应流速随体长因素的变化,以黄河上游2种裂腹鱼为研究对象,利用环形水槽实验装置,采用递增流速法,测试并分析了不同体长鱼类的感应流速。结果表明,体长(BL, 20.67±3.65) cm的花斑裸鲤(Gymnocypris eckloni)和BL (14.50±2.24) cm的黄河裸裂尻鱼(Schizopygopsis pylzovi)的绝对感应流速分别为(4.97±1.22) cm·s^-1和(4.52±0.92) cm·s^-1,相对感应流速分别为(0.24±0.045) BL·s^-1和(0.31±0.052) BL·s^-1;绝对感应流速与体长呈正相关关系,相对感应流速与体长呈负相关关系,相对感应流速与体长呈现负相关关系是由于绝对感应流速的增加速率小于体长的增加速率;2种裂腹鱼类的绝对感应流速差异不显著(P>0.05);构建的绝对感应流速与体长的非线性回归模型能够有效地解释鱼类感应流速对体长的响应。该研究对其他较难捕获测试样本区域的鱼类游泳特性的定性预测研究具有一定指导作用,也可为过鱼设施的设计提供基础数据支撑。

黄河裸裂尻鱼MSTN多克隆抗体的制备

肌肉生长抑制素(myostatin,MSTN)属于转化生长因子β(TGF-β)超家族中的一个成员,是骨骼肌生长发育的负调控因子。为了研究MSTN对黄河裸裂尻鱼(Schizopygopsis pylzovi)肌肉生长和发育的影响,构建MSTN成熟肽重组表达质粒p GEX-4T-MSTN,运用p GEX-4T-MSTN为免疫原制备弗氏佐剂疫苗,主动免疫健壮的青年家兔制备抗血清。ELISA方法检测抗MSTN血清的效价,分析结果表明当MSTN抗体浓度分别为4.12 mg/ml(标记为MSTNK343)和2.79 mg/ml(标记为MSTNK344)时,抗体稀释度为1:1000时,反应结果检测得到的值最大。经Western-blotting检测,MSTN多克隆抗体能与融合蛋白特异性结合。制备了高特异性MSTN多克隆抗体,为深入探讨黄河裸裂尻鱼MSTN基因的生物学功能奠定了基础,也为黄河裸裂尻鱼的繁育工作积累科学数据。

黄河裸裂尻鱼细胞色素C氧化酶Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ亚基基因的克隆及序列特征分析

采用RT-PCR技术克隆获得了黄河裸裂尻鱼(Schizopygopsis pylzovi)COⅠ、Ⅱ、Ⅲ基因的编码序列,并对此进行了初步分析。结果表明,黄河裸裂尻鱼COⅠ基因全长为1 551 bp,开放阅读框(ORF)由基因全长组成,编码516个氨基酸;COⅡ基因全长为691 bp,开放阅读框为690 bp,编码230个氨基酸;COⅢ基因全长为786 bp,其开放阅读框也是由基因全长组成,编码261个氨基酸。序列同源性分析显示,黄河裸裂尻鱼与其他9种鲤科鱼类3个亚基在基因和氨基酸序列上均有较高的同源性,虽然不同物种亚基基因间存在序列差异,但是所编码的氨基酸序列却趋于一致,揭示了鲤科鱼类细胞色素C氧化酶在线粒体呼吸链电子传递中的功能稳定性。黄河裸裂尻鱼与滇池金线鲃(Sinocyclocheilus grahami)在COⅠ和COⅡ亚基上均存在相同位置、相同种类和相同数量的功能位点,而且在基于COⅠ亚基基因和氨基酸序列、COⅡ及COⅢ亚基基因序列的系统发育树中聚在同一支上,表明两者具有较近的亲缘关系,该结论与裂腹鱼亚科鱼类起源于晚第三纪广泛分布于青藏地区的喜温性原始鲃类的观点相一致。

黄河裸裂尻鱼肌酸激酶M-CK cDNA的克隆及组织表达分析

肌酸激酶(CK)能够催化磷酸基在二磷酸腺苷(ADP)和磷酸肌酸之间的可逆性转移,在细胞能量代谢过程中发挥重要作用。本研究利用RT-PCR和RACE方法克隆了黄河裸裂尻鱼(Schizopygopsis pylzovi)肌酸激酶基因全长c DNA序列,并进行了生物信息学分析和系统发育关系研究。黄河裸裂尻鱼肌酸激酶c DNA全长1 599 bp,开放阅读框(ORF)1 143 bp,编码380个氨基酸,具有典型的N-端结构域和C-端催化结构域。氨基酸序列同源性分析表明,黄河裸裂尻鱼肌酸激酶与斑马鱼(Danio rerio)和鲤(Cyprinus carpio)M3-CK有较高的同源性,其序列一致度达94%以上。系统发育分析显示,黄河裸裂尻鱼肌酸激酶与斑马鱼和鲤的M3-CK聚在一支,形成一个单系群,初步判定克隆获得的黄河裸裂尻鱼肌酸激酶基因可能与鲤和斑马鱼M3-CK是直系同源基因。利用Real-time PCR方法检测和分析了黄河裸裂尻鱼主要组织肌酸激酶m RNA表达水平,肌肉、肠、眼、心中肌酸激酶转录本表达较高,在肝胰脏和脑中表达微弱。肌酸激酶在肌肉、肠、和心中高表达与其能量代谢功能相适应,而在眼组织中的高表达是否与肌酸激酶的其他功能相关,有待于进一步研究。

黄河裸裂尻生长激素(GH)基因的PCR扩增和克隆

为了克隆黄河裸裂尻生长激素(GH)基因并获得表达产物,试验采用异硫氰酸胍法提取黄河裸裂尻脑组织总RNA,以分离的RNA为模板,采用RT-PCR扩增获得GH基因cDNA,将cDNA插入质粒pQE30中,并在大肠杆菌RB791中表达,经异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)诱导后,SDS-PAGE电泳检测蛋白的表达情况。结果表明:扩增后黄河裸裂尻GH基因长度为508 bp,黄河裸裂尻GH基因与青海湖裸鲤的同源性很高,电泳显示出1条新的分子质量约为14.4 ku的特异性条带。

黄河裸裂尻鱼垂体显微结构

运用组织学、组织化学和显微技术对黄河裸裂尻鱼(Schizopygopsis pylzovi)垂体的组织结构进行了研究.结果表明:黄河裸裂尻鱼垂体为心形,背腹型垂体,由神经垂体和腺垂体两部分组成.腺垂体分为前外侧部(RPD)、中外侧部(PPD)和中间部(PI).神经垂体由神经分泌纤维和垂体细胞组成,垂体细胞分为纤维垂体细胞和颗粒垂体细胞,神经垂体中微血管发达.腺垂体可区分7种分泌细胞类型,即位于RPD的ACTH细胞和PRL细胞,PPD的GTH细胞、GH细胞和TSH细胞,PI的SL细胞和MSH细胞.