铜绿假单胞菌 prtN 突变引起甲氧苄啶耐药

耐药铜绿假单胞菌(PAO1)在临床感染过程中造成非常棘手的问题,研究其耐药机制有助于临床的治疗。研究结果表明,相对于野生型,ΔprtN表现出明显的甲氧苄啶(Tmp)抗性。为了了解其抗性出现的机理,测定了Tmp作用靶点folA的表达情况。相比于PAO1,folA在ΔprtN中的表达并未升高,反而有所下降。进一步研究发现,PrtN调控的S型绿脓杆菌素基因和prtN的双突变体对Tmp的抗性稍有降低,而脂多糖缺陷菌株ΔwbpL对Tmp的抗性略有升高。在ΔprtN中活性氧(ROS)相关基因(oxyR,katA,ahpC)的表达水平、生物被膜及外排泵相关抗生素抗性检测结果都显示与野生型无显著性差异。综上,prtN基因突变引起的Tmp抗性可能是通过PrtN调控S型绿脓杆菌素及脂多糖相关靶标作用的结果。

血清型、绿脓素分型法对天津市院内感染绿脓杆菌的分型研究

应用IATS血清及plyl～18绿脓标准株,对天津市分离的医院内感染株进行血清型、绿脓素的分型研究。82株中血清型2、6、11型分别为17、22、11株占61％。50株中绿脓素888878、112418、686713分别为12、10和5株,三型共占54％。而两所医院的两个医疗中心分离株型别呈高度集中趋势,预示其存在交叉感染的可能。

重组转化生长因子α-绿脓杆菌外毒素融合蛋白对人膀胱癌细胞生长的抑制作用

目的探讨重组转化生长因子α绿脓杆菌外毒素融合蛋白(TP40)对膀胱癌细胞生长的抑制作用。方法采用蛋白印迹(Westernblot)法检测人膀胱癌T24细胞表皮生长因子受体(EGFR)的表达。用浓度为5～1000μg/L的TP40处理T24细胞,甲基噻唑基四唑(MTT)法检测细胞生长24、48、72和96h时的生长情况。氚胸腺嘧啶核苷([3H]TdR)掺入法检测TP40对T24细胞蛋白质合成的抑制作用。用浓度为1～7500μg/L的表皮生长因子(EGF)竞争拮抗TP40的细胞毒作用。结果T24细胞表达EGFR强阳性。浓度为5、50、100、250、500、750和1000μg/L的TP40处理T24细胞96h,细胞生长抑制率分别为10%、19%、27%、41%、47%、53%和61%。用750μg/L的TP40处理T24细胞24、48、72和96h,[3H]TdR掺入率分别为80%,69%,48%和51%。浓度为1～7500μg/L的EGF对TP40有竞争抑制作用。结论人膀胱癌T24细胞能高水平地表达EGFR;重组TP40对T24细胞的生长具有剂量、时间依赖性抑制作用,该作用是通过EGFR进行的。

prtR严紧调控的分子基础及对绿脓杆菌素表达的影响

[目的]阐明铜绿假单胞菌prtR严紧调控的分子基础及对绿脓杆菌素表达的影响。[方法]通过5'RACE确定prtR和ptrB的转录起始位点;通过RT-PCR的方法研究prtR的相对表达水平和对绿脓杆菌素表达的影响。[结果]prtR和ptrB的转录起始位点分别位于已预测的结构基因上游-1 bp和-322 bp;另外,PrtR除了通过抑制prtN来抑制绿脓杆菌素的表达之外,它的本底水平的表达对绿脓杆菌素还有一个间接或直接的抑制作用。[结论]造成prtR极低表达水平的原因,除自我抑制外,还存在ptrB对其的转录竞争抑制。此外,prtR独立对绿脓杆菌素的表达有抑制作用。

prtR在铜绿假单胞菌抵抗外源性氧化压力中的作用

[目的]研究prtR在铜绿假单胞菌抵抗外源性氧化压力时的作用。[方法]通过对双氧水处理后的生物膜残留量及其菌株存活率的定量来研究铜绿假单胞菌中prtR对双氧水抗性的影响;通过RT-PCR的方法研究在双氧水处理后,绿脓杆菌素在含有空载体或过表达prtR载体的PAK中mRNA水平与抗双氧水能力变化的关系。[结果]过表达prtR能显著提高双氧水处理时,铜绿假单胞菌生物膜状态下的存活率;存活率的提高是由绿脓杆菌素的表达被抑制实现的,而由prtR调控的一定水平的绿脓杆菌素表达对铜绿假单胞菌抗双氧水是必要的。[结论]prtR能够通过影响绿脓杆菌素的表达,提高铜绿假单胞菌抵抗外源性氧化压力的能力。

靶向破坏铜绿假单胞菌生物被膜的定向蛋白投放技术

【目的】随着合成生物学的发展,通过在细菌体内设计合成复杂、多功能的基因线路进行靶向治疗已经取得巨大进展。虽然这种使用细菌作为治疗传递系统,选择性地在体内释放有效治疗成分的方式具有极大优势,但是如何使细菌在代谢负荷增加较低的情况下有效地分泌功能蛋白并发挥作用依旧是一个难题。【方法】针对这一难题,本研究提供了一种新的策略,即以细菌中广泛存在的蛋白类杀菌素和丝状噬菌体等相关编码基因作为生物模块,通过对铜绿假单胞菌的这些内源生物模块的重新编排和组装,构建了一种能在特定条件下裂解并投放功能蛋白的工程菌。为了评价工程菌中构建的生物模块能否工作,本研究选择胞外多糖水解酶PelA和PslG作为工程菌投放的功能蛋白,以此构建了工程菌PAO1102。通过对铜绿假单胞菌生物被膜的破坏实验、抑制形成实验以及抗生素耐药性实验,检验PAO1102对铜绿假单胞菌生物被膜的破坏和预防效果。【结果】与对照组相比,工程菌PAO1102的处理可以显著破坏已形成的生物被膜并抑制生物被膜的形成,同时还可显著增强生物被膜中的细菌对妥布霉素的敏感性,且这些功能主要通过外界Pf4丝状噬菌体侵染并使工程菌裂解而释放功能蛋白这一途径实现的。【结论】本研究所构建的工程菌可以作为一种微生物工具,用于靶向破坏铜绿假单胞菌生物被膜。在后续的研究中可根据不同的需求,在工程菌中表达不同的功能基因并实现功能蛋白的定向投放,从而执行不同的生物学功能。

铜绿假单胞菌中S型绿脓杆菌素与荧光嗜铁素的功能协同性分析

在铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)中,S型绿脓杆菌素S2和S4与细菌中的铁载体荧光嗜铁素(pyoverdine)使用相同的摄取通道,表明二者之间存在某些联系。本研究表征了细菌中3个S型绿脓杆菌素(Pys2、PA3866、PyoS5)的单细菌基因表达分布,并研究了S2型绿脓杆菌素对细菌摄取荧光嗜铁素的影响。结果表明,在DNA损伤压力下,S型绿脓杆菌素基因的表达在细菌种群中呈现出高度分化,外源加入S2型绿脓杆菌素会减少细菌对荧光嗜铁素的摄取,因此S2型绿脓杆菌素的存在会阻止不合成荧光嗜铁素的“欺骗者”摄取环境中荧光嗜铁素,进而减弱其对活性氧(reactive oxygen species,ROS)压力的抵抗能力。另外我们发现,在细菌中过表达SOS响应(SOS response)调节因子PrtN时,荧光嗜铁素相关合成基因的表达量显著降低,进而导致荧光嗜铁素的总合成量和外分泌量显著降低。以上结果表明细菌中SOS压力响应系统与铁摄取系统的功能是存在相互联系的。