结外NK/T细胞淋巴瘤检测EB病毒与疗效关系的研究

目的：探讨血浆中EB病毒阳性在评价结外NK/T细胞淋巴瘤近期疗效和远期疗效中的临床意义。方法：收集2011年1月至2014年4月郑州大学第一附属医院经病理及免疫组化确诊为结外NK/T细胞淋巴瘤的患者109例，应用qRT-PCR方法检测其血浆中EBV-DNA拷贝数，比较EBV阴性和EBV阳性患者对治疗疗效与预后的差异。结果：109例结外NK/T细胞淋巴瘤患者，53例阳性患者中有34例（64.2%）为晚期（Ⅲ～Ⅳ期），56例阴性患者中22例（39.3%）为晚期（Ⅲ～Ⅳ期），EBV阳性组中伴有B症状33例（62.3%），阴性组患者21例（37.5%），EBV阴性患者与EBV阳性患者在分期及B症状方面均具有统计学意义（P〈0.05）。34例（60.7%）EBV阴性结外NK/T细胞淋巴瘤患者达到客观缓解率，显著高于EBV阳性患者的客观缓解率（22例，41.5%）（P〈0.05）。EBV阴性组与EBV阳性组相比，其2年无进展生存期更高（P〈0.05）。结论：检测结外NK/T细胞淋巴瘤患者血浆中EB病毒对评价其近期疗效及2年无进展生存期具有重要的临床意义。

小鼠仙台病毒TaqMan-MGB探针荧光定量RT-PCR检测方法的建立

仙台病毒(Sendai virus, SeV)能够引起啮齿类动物呼吸道疾病,引起免疫应答,严重影响SPF级动物模型实验结果,实验动物质量国家标准T/CALAS49-2017也将其作为SPF级大小鼠质量检测必检项目之一。为了开发用于快速检测及日常监测SeV的分子生物学诊断方法,本研究基于TaqMan-MGB探针荧光技术,根据GenBank中SeV的L基因的保守区段(8 556-15 242)序列,设计了1对特异性引物与1条5‵端携带羧基荧光素(FAM)与3‵端为淬灭基团(Eclipse)标记的TaqMan探针,标准品进行稀释建立标准曲线,并经反应条件优化,建立了TaqMan-MGB探针荧光定量RT-PCR检测方法,并对其特异性、敏感性与重复性进行评估。结果显示,最佳优化反应条件为:反应体系,20μmol/L;引物和探针浓度,10μmol/L和15μmol/L;退火温度,54℃;在特异性试验中,除SeV检测出现特异性曲线外,其他鼠类常见病毒均未出现特异性曲线;在敏感性试验中,Sev最低检测限为5.29×10^(1)拷贝/μL。在重复性试验中,其批内变异系数为0.44%~0.77%,批间变异系数为0.44%~1.03%。对临床样本进行检测,检出率高于常规的RT-PCR方法。因此,以SeV L基因保守序列为靶基因建立的TaqMan探针荧光定量RT-PCR方法具有敏感性高、特异性强、良好的重复性等优点,适用于对SPF级实验动物的SeV定期监测以及对野生鼠类的SeV日常监测和流行病学调查,为相关研究提供了良好的技术支持。

蜜蜂残翼病毒TaqMan-MGB探针荧光定量RT-PCR检测方法的建立

蜜蜂残翅病毒(Deform wing virus,DWV)已成为世界上最著名、分布最广、研究最为深入的昆虫病原。虽然DWV以前存在于蜜蜂种群中,但一种新的媒介—外寄生螨Varroa破坏体的到来和全球传播,极大地促进了DWV的流行病学。为了建立快速、准确且能定量分析的蜜蜂残翅病毒,DWV检测方法,本研究参照GenBank中已登录的DWV高度保守的3C-RdRp基因区域,设计了1对特异性引物和带有羧基荧光素(Fast Auxiliary Memory,FAM)与淬灭基团(Eclipse)标记的TaqMan探针,并对反应条件进行优化,建立了检测DWV的TaqMan-MGB探针荧光定量RT-PCR检测方法(TaqMan qRT-PCR),同时对该检测方法的特异性、敏感性、重复性进行了试验,并对临床样品进行检测。结果显示:该方法最佳上下游引物和探针浓度分别为12.5μmol/L和10μmol/L,最佳退火温度为59℃;敏感性试验中,对DWV质粒标准品检测下限为2.58×10^(1)拷贝/μL;本方法特异性较好,对蜜蜂常见病毒—蜜蜂慢性麻痹病毒(Chronic bee paralysis virus,CBPV)、蜜蜂急性麻痹病毒(Acute paralysis virus,ABPV)、黑蜂王台病毒(Black queen cell virus,BQCV)、囊状幼虫病毒(Sacbrood virus,SBV)、以色列急性麻痹病毒(Israeli acute paralysis virus,IAPV)和中蜂囊状幼虫病毒(Chinese sacbrood virus,CSBV)无交叉反应;且批内变异系数和批间变异系数均小于2%。利用该方法对49份临床疑似样本进行检测,其中DWV阳性样本为35份,检出率高于常规RTPCR方法,且病毒载量大于1×10^(7)拷贝/只样本数共24份,表明辽宁和河北部分地区感染DWV蜂群中病毒载量较高,流行情况比较严重。因此,本研究建立的TaqMan探针荧光定量RT-PCR方法具有灵敏度高、特异性强、重复性好等特点,能够用于DWV病原监测、流行病学调查和病毒定量分析等相关研究。