肠杆菌科细菌喹诺酮耐药基因qnrB的研究

目的对2005年10月～2006年4月临床分离的120株肠杆菌科细菌检测qnrB的分布,同时研究qnr阳性菌株与blaSHV、blaCTX-M或质粒型AmpCβ-内酰胺酶基因的关系,为进一步研究质粒介导的喹诺酮类耐药机制(PM QR)提供实验依据。方法采用碱裂解变性法提纯质粒DNA,PCR法检测qnrA和qnrB的存在,接合实验验证qnr的转移性。扩增qnrB全序列、测序。对所有qnr阳性菌株,采用nitrocefin法检测qnr阳性菌产β-内酰胺酶情况,多重PCR法检测blaSHV、blaCTX-M及多种质粒型AmpCβ-内酰胺酶基因。结果120株肠杆菌科细菌中,qnrA和qnrB的检出率分别为30.8%与27.5%,其中13株细菌同时检出qnrA和qnrB;肠杆菌属、克雷伯菌属细菌及大肠埃希菌qnr的检出率分别为52.9%、59.3%和50.0%。17株细菌可扩增出681bp的全序列片段。测序结果显示,部分菌株包含qnrB1;另有4株细菌的qnrB序列相同,但与qnrB3相比存在3个位点核苷酸序列突变(201位A→T,271位T→G,498位G→A)而导致编码蛋白的氨基酸存在2个位点差异,为新的qnrB亚型(qnrB6),GenBank注册号为:EF520349。所有qnr阳性菌均可使nitrocefin纸片变红色。qnr阳性菌中,49株(89.1%)包含blaSHV或blaCTX-M;约70.0%可检测到质粒型AmpC相关的β-内酰胺酶基因,分别有18和16株细菌可扩增到blaDHA及blaEBC。结论我院临床存在qnr阳性菌株的流行,发现一种新的qnrB亚型(qnrB6)。

健康鸡源肺炎克雷伯菌检测到质粒介导喹诺酮耐药qnrA基因

通过PCR技术检测195株健康动物肠杆菌中qnrA基因的流行情况;琼脂稀释法对qnrA阳性菌株进行8种抗菌药物的药物敏感性试验;质粒接合转移试验研究qnrA的可转移性;Southern杂交对qnrA基因进行定位;PCR检测qnrA阳性菌中Ⅰ类整合酶intI基因的携带情况.结果表明,195株肠杆菌中检出1株qnrA阳性的肺炎克雷伯菌Klebsiella pneumoniae GDKA1,经Blast鉴定为qnrA1.药物敏感性试验表明GDKA1对磺胺甲恶唑、氨苄西林、大观霉素、氯霉素、四环素耐药,对环丙沙星(MIC=0.019 mg·L-1),头孢噻肟(MIC=0.047 mg·L-1)表现敏感,对萘啶酸(MIC=12 mg·L-1)表现为部分敏感.接合试验表明qnrA1位于可转移的质粒上,且可以通过接合试验水平传播.接合子TGDKA1对喹诺酮类药物的敏感性比大肠埃希菌Escherichia coli J53 AzR稍高,但远低于GDKA1·South-ern杂交进一步证实了qnrA1基因位于质粒上.TGDKA1的质粒扩增出intI1,表明qnrA1阳性菌株携带I类整合子.可见,qnrA1基因已在健康鸡源肺炎克雷伯菌中出现且同时携带I类整合子位于质粒上,整合子灵活多样的存在方式和传播方式为qnrA基因的传播提供了便利条件,整合子可能携带qnrA基因通过食物链传播给人,因此健康动物共生菌携带qnrA1基因值得注意.

产超广谱β-内酰胺酶肺炎克雷伯菌与大肠埃希菌qnrB基因的检测

目的:了解临床分离的产超广谱β-内酰胺酶(ESBLs)肺炎克雷伯菌和大肠埃希菌株qnrB基因的存在情况及与细菌耐药的关系。方法:收集福建省福州市三家"三甲"医院临床分离的菌株,菌株药敏试验检测采用K-B法,聚合酶链反应对42株产ESBLs肺炎克雷伯菌和44株产ESBLs大肠埃希菌进行qnrB基因筛查。结果:42株产ESBLs肺炎克雷伯菌有5株检出qnrB基因,检出率为11.90%,44株产ESBLs大肠埃希菌中有7株检出qnrB基因,检出率为15.91%。检出qnrB基因的5株肺炎克雷伯菌和7株大肠埃希菌对两种喹诺酮药物均耐药。结论:在福州地区产ESBLs的肺炎克雷伯菌和大肠埃希菌中存在qnrB基因,携带qnrB基因的12株细菌对左氟沙星和环丙沙星均耐药。

大肠埃希菌qnrA基因的检测

[目的]了解大连地区耐环丙沙星的大肠埃希菌中qnrA基因的流行情况并研究其耐药机制。[方法]收集临床分离的耐环丙沙星的大肠埃希菌213株,通过PCR法扩增qnrA基因,对qnrA基因阳性株,KB纸片法检测抗菌药的体外抗菌活性,琼脂稀释法测MIC,并进行质粒结合试验。[结果]213株菌中查到2株qnrA阳性菌株,测序结果与Genbank中qnrA基因比对吻合率达100%。其中一株对多种抗菌药耐药,另一株则比较敏感。[结论]大连地区检测到了qnrA基因阳性的菌株,耐药机制复杂,应引起临床重视。

猪场环境大肠杆菌qnrA和aac(6’)-Ib基因检测

为了解质粒介导的喹诺酮类抗生素耐药基因qnrA、aac(6’)-Ib-cr在猪场环境大肠杆菌的流行分布及变异情况,从贵州省规模养猪场空气、污水、粪便和土壤样本中分离、鉴定大肠杆菌57株,PCR检测qnrA和aac(6’)-Ib基因,测序分析aac(6’)-Ib-cr基因变异体,并用药敏纸片琼脂扩散法测其对喹诺酮类和氨基糖苷类的耐药性。结果表明:57株大肠杆菌均未携带qnrA基因;8株检出aac(6’)-Ib基因,分别来自污水、粪便和土壤样本,且介导对喹诺酮类和氨基糖苷类抗生素的广泛耐药性。E.coli3和E.coli4在第75(A)、76(G)或488位(A)碱基缺失;E.coli5在第222位(A→T)变异,E.coli1、E.coli2、E.coli3、E.coli4、E.coli5、E.coli7和E.coli8在223位(T→C)和454位(G→T)变异;E.coli3、E.coli4在第492位有A、C碱基增添。说明贵州省规模养猪场肠杆菌科细菌qnrA基因携带率较低,但存在aac(6’)-Ib-cr基因。

新质粒介导喹诺酮耐药基因qnrB24的基因分析

目的 对新的质粒介导喹诺酮耐药基因（qnrB24）进行相关研究和分析。方法 对新发现的qnrB24基因阳性菌株进行转移接合实验,了解qnrB24对喹诺酮类药物的耐药性,碱裂解法提取接合子质粒,Southern blot明确质粒大小。采用热不对称交错聚合酶链反应（PCR）技术研究基因5′端以及3′端未知侧翼碱基序列。结果 这个突变基因命名为qnrB24（Genbank登录号HM192542）。药敏试验结果显示携带qnrB24基因接合子对环丙沙星的最小抑菌浓度（MIC）值为0.125μg/mL,左氧氟沙星MIC值为0.190μg/mL。接合子对常见氟喹诺酮类抗菌药物的敏感性较大肠杆菌J53受体菌下降约8~11倍,接合子耐药水平低于临床分离菌株。Southern杂交显示该基因位于约60.0Kb质粒上。热不对称交错PCR结果显示,qnrB24基因5′端为假定的转座酶。结论 qnrB24通过质粒介导引起细菌对喹诺酮类药物的耐药性上升,容易发展成高水平耐药,因此需要监测其在细菌中的流行性。

环丙沙星浓度对大肠埃希菌qnrA基因的影响

[目的]研究携带qnrA基因的大肠埃希菌在环丙沙星压力下gyrA基因的突变情况及防耐药变异浓度(MPC)。[方法]采用质粒结合实验构建出携带qnrA基因且gyrA基因未发生突变的结合子。在不同浓度环丙沙星药物平皿上观察gyrA基因突变情况及对防耐药变异浓度的影响。[结果]结合子(菌株4E、5E)的突变选择指数(MPC/M IC)分别为24.0和35.0,平均突变率分别为0.6852和0.5500;阴性对照大肠埃希菌ATCC25922的突变选择指数为6.25,平均突变率为0.2078,与结合子比较差异有显著性意义(P<0.05)。[结论]携带qnrA基因的菌株在环丙沙星压力下,更容易发生gyrA基因突变,导致产生对环丙沙星的高水平耐药和高MPC。

大肠埃希菌中质粒介导的喹诺酮耐药基因qnrB的检测

目的了解本地大肠埃希菌中质粒介导的喹诺酮耐药基因qnrB的流行情况。方法对2009年8月～2010年8月临床分离的154株大肠埃希菌用Kirby-Bauer琼脂扩散法对13种抗生素做药物敏感试验,并采用PCR检测qnrB基因。结果 154株大肠埃希菌中共检出耐左氧氟沙星菌76株(49.35%),qnrB基因阳性菌10株(6.49%),qnrB基因阳性菌株均对左氧氟沙星耐药。结论自贡地区存在qnrB基因流行,且qnrB基因阳性菌株均对左氧氟沙星耐药,故应加强耐药监控。

广州地区大肠埃希菌qnrB耐药基因与细菌耐药的研究

目的了解广州地区大肠埃希菌株qnrB基因的存在情况及其与细菌耐药的关系。方法收集广州地区临床分离的300株大肠埃希菌，PCR法对300株菌进行qnrB基因检测，K—B法进行药敏试验检测，X^2检验进行统计学分析，P〈0．05被认为有差异。接合试验验证qnrB的转移性。结果300株大肠埃希菌有16株检出qnrB基因，拴出率为5．33％，阳性菌对两种喹诺酮药物均耐药且有14株同时为ESBLs阳性。结论大肠埃希菌中存在qnrB基因的流行，携带qnrB基因的16株细菌对左氧氟沙星和环丙沙星均耐药，且多数与ESBLs基因共存。

广东省中医院阴沟肠杆菌qnrA基因的检测及耐药机制的研究

目的了解广东省中医院临床分离的阴沟肠杆菌qnrA基因的分布及其耐药机制。方法应用VITEK32全自动细菌鉴定仪鉴定400株阴沟肠杆菌,采用纸片K-B法检测耐药情况,PCR法检测qnrA基因阳性菌,质粒接合试验验证qnrA基因可发生水平传播。结果 qnrA基因阳性的阴沟肠杆菌共检出65株,检出率为16.3%,阳性菌对两种喹诺酮药物均产生耐药且多数还伴产ESBLs,呈多重耐药性。结论广东省中医院分离的阴沟肠杆菌中存在qnrA耐药基因的流行,多数与ESBLs基因共同存在,且可发生水平传播。

大肠埃希菌qnrB耐药基因与细菌耐药的关系探讨

目的了解大肠埃希菌qnrB基因的流行状况及其与细菌耐药的关系。方法收集250株大肠埃希菌作为检测对象,qnrB阳性对照菌由某医科大学提供。分别进行qnrB基因扩增及序列测定、药敏试验和质粒结合试验。结果共有14株(5.6%)检出存在qnrB基因。而ESBLs阳性菌的检出株数为117株(46.8%),且14株阳性株中有13株为ESBLs阳性。阳性质粒接合试验均接合成功,且可于选择平板或丙环沙星TSA琼脂上生长,表明qneB具有转移性。选取2例qnrB阳性扩增产物进行DNA测序,发现qnrB扩增片段为469bp,与GenBank数据库中qnrB基因的同源性为100%。结论 qnrB基因在本市存在流行情况,且原因推测为抗生素的滥用。因此,应制定临床用药规范,杜绝抗生素的滥用。

中国部分地区产超广谱-β内酰胺酶大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌qnrA基因的检测

目的明确我国部分地区产超广谱-β内酰胺酶(ESBL)大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌中qnrA基因的存在状况。方法PCR扩增产ESBL菌株,包括263株大肠埃希菌和99株肺炎克雷伯菌的qnrA基因;测序分析其基因序列。琼脂稀释法测定10种抗菌药物对qnrA基因阳性菌株的最低抑菌浓度(MIC)。接合实验和Southern杂交进行基因定位。脉冲场凝胶电泳(PFGE)分析qnrA基因阳性株的同源性。结果263株大肠埃希菌中有5株检出qnrA基因,占1.9%;99株肺炎克雷伯菌中有8株检出qnrA基因,占8.1%。13株qnrA阳性株中qnrA基因均位于可接合性质粒上。13株菌株同时携带CTX-M基因(1株CTX-M-9、5株CTX-M-14和7株CTX-M-24)。qnrA基因阳性的接合菌与受体菌J53相比,环丙沙星对前者的MIC较后者提高了4～133倍。11株环丙沙星耐药株(MIC≥4 mg/L)均存在GyrA亚基的83位氨基酸和(或)87位氨基酸改变,其中8株对环丙沙星高水平耐药株(MIC≥16 mg/L)同时存在ParC亚基的80位氨基酸改变。2株MIC分别为4 mg/L和2 mg/L的菌株GyrA和ParC两亚基均未发生改变。结论肺炎克雷伯菌中qnrA基因的携带率高于大肠埃希菌。qnrA基因单独作用仅导致低水平喹诺酮类耐药,合并gyrA和(或)parC突变导致喹诺酮类高水平耐药。

1株携带qnrB4及aac(6′)-Ⅰb-suzhou型基因同时产ESBLs、AmpC酶多药耐药大肠埃希菌的调查

目的了解1株产ESBLs、AmpC酶大肠埃希菌的耐药机制。方法采用纸片扩散法检测1株大肠埃希菌对19种抗菌药物的敏感性,采用聚合酶链反应(PCR)检测6种耐药基因:qnrA、qnrB、qnrC、qnrS、qepA、aac(6′)-Ⅰb,并对qnrB、aac(6′)-Ⅰb基因测序后进行BLAST比对分析。结果该菌株除对碳青霉烯类、酶抑制剂复合抗菌药物类敏感外,对其余药物均耐药;PCR发现该菌株同时携带qnrB和aac(6′)-Ⅰb,经测序并分别与已在美国国立信息中心登录的DQ303921(qnrB4)和EF375621[aac(6′)-Ⅰb-suzhou]型比对,同源性均>99.0%。结论该菌株多药耐药的机制与产ESBLs、AmpC酶及携带qnrB4和aac(6′)-Ⅰb基因有关;该研究是第一篇从1株产ESBLs、AmpC酶大肠埃希菌中检出同时携带qnrB4和aac(6′)-Ⅰb-suzhou型基因的报道。

大肠埃希氏菌的qnrB基因检测与耐药机制研究

目的探索本地区医院大肠埃希氏菌喹诺酮耐药基因的分布及耐药机制。方法采用PCR扩增与测序、基因初步定位、质粒接合转移实验等方法确定喹诺酮耐药的大肠埃希氏菌qnr的基因类型,以分析研究有关的耐药特点与机制。结果各大肠埃希氏菌株中仅qnrB基因阳性,qnrA、qnrS、qnrC、qnrD、qepA、aac(6’)-Ib-cr基因均阴性;并且qnrB基因包括qnrB2、qnrB5、qnrB9、qnrB16、qnrB18、qnrB19和qnrB31等位基因;在这些qnrB等位基因中,qnrB31与qnrB16、qnrB2与qnrB9同源性较高;各qnrB等位基因分别位于约21.0 kb至28.0 kb长的质粒上。结论在本地区医院存在不同的qnrB等位基因流行;实验菌株的喹诺酮耐药与qnrB等位基因结构中LexA-蛋白结合位点共有序列缺失有关。

宋内志贺菌对喹诺酮类抗菌药物的耐药性研究

目的检测宋内志贺菌对喹诺酮类抗菌药物的耐药情况,探讨染色体介导DNA旋转酶A亚单位(gyrA)和拓扑异构酶ⅣC亚单位(parC)基因突变或(和)质粒介导qnrA基因存在与宋内志贺菌耐喹诺酮类药物的相关性。方法用K-B纸片扩散法对58株宋内志贺菌进行耐药性检测;PCR法检测宋内志贺菌喹诺酮耐药决定区(QRDR)相关gyrA、parC基因,并根据药敏结果挑选5株菌扩增片段进行DNA测序;PCR法扩增qnrA基因片段。分析宋内志贺菌gyrA、parC基因突变或(和)qnrA基因存在与喹诺酮类药物耐药性的关系。结果宋内志贺菌对萘啶酸的耐药率高达94.8%。58株宋内志贺菌中,8株检出qnrA基因,5株测序gyrA、parC基因的菌株中,4株萘啶酸耐药菌株均在gyrA83位发生有义突变TCG(Ser)→TTG(Leu),但未发生parC基因突变,gyrA基因突变菌株对萘啶酸全耐药。qnrA基因阳性菌株对5种喹诺酮类药物抑菌圈中位数比较都缩小;对NAL、氧氟沙星的耐药率高于qnrA基因阴性菌株(P<0.05),差异有统计学意义。结论gyrASer83→Leu突变是导致宋内志贺菌临床分离株对喹诺酮类药物耐药的关键突变,宋内志贺菌若携带质粒介导qnrA基因则会导致对喹诺酮类药物的敏感性下降,若两者同存也可引起喹诺酮类药物耐药增强,除萘啶酸耐药外对其他喹诺酮类药物也可呈中介。

大肠埃希菌染色体、质粒介导的喹诺酮类药物耐药机制研究

目的探讨我院ICU病区临床分离大肠埃希菌(Escherichia Coli. ECO)的耐喹诺酮类抗菌素耐药机制。方法收集2007年12月～2008年6月期间20株分离自我院ICU病区患者临床标本的ECO菌,采用纸片扩散法测定30种抗菌药物的敏感性,微量琼脂稀释法测定环丙沙星、左氧沙星的MIC值;采用PCR法联合检测细菌染色体介导DNA解旋酶gyrA和质粒介导的qnrA、qnrB、qnrS以及aac(6’)-Ⅰb-Cr变异体和与喹诺酮类外排有关的qepA等6种基因。结果20株ECO菌gyrA基因均存在突变,其中13、15号株gyrA基因经比对与美国NCBI中已登录的gyrA基因序列均不相同,为新亚型;检出aac(6’)-Ⅰb基因3株,经比对分别为aac(6’)-Ⅰb(2株)和aac(6’)-Ⅰb-Cr(1株);qnrA基因检出1株,经比对为qnrA1。结论本组ECO菌对环丙沙星等喹诺酮类耐药主要为gyrA基因突变所致,但也有aac(6’)-Ⅰb-Cr、qnrA1的因素。

阴沟肠杆菌质粒介导耐喹诺酮类药物的机制研究

目的 了解深圳地区阴沟肠杆菌中qnrA基因的流行情况、基因定位及其介导喹诺酮耐药性产生的机制。方法 收集临床分离的阴沟肠杆菌45株，采用PCR法结合测序的技术筛查qnrA基因，大质粒提取技术、Southern杂交和接合传递试验进行质粒定位，琼脂对倍稀释法进行药物敏感性检测。结果45株阴沟肠杆菌中，7株PCR法及测序证实为qnrA基因。7株菌中6株菌所携质粒被成功提取并进行Southern杂交，qnrA基因定位于80～200kb大小的低拷贝数天然质粒上。4株菌成功进行接合传递试验，使接合子对环丙沙星的MIC值提高了32-64倍。结论 质粒介导的喹诺酮耐药基因qnrA在深圳地区阴沟肠杆菌中具有较高的流行率，可能是导致阴沟肠杆菌对喹诺酮类抗菌药获得性耐药的重要原因。