豌豆蚜实时荧光定量PCR内参基因的评估

【目的】本研究旨在通过对豌豆蚜Acyrthosiphon pisum内参基因在不同实验条件下的表达稳定性进行评估,为豌豆蚜基因表达分析奠定基础。【方法】利用qPCR测定昆虫常用14种候选内参基因(EF1α,Tubulin,NADH,RPL12,SDHB, 18S rRNA, 28S rRNA, 16S rRNA,ATPase,Actin,TATA,RPL32,GAPDH和RPL7)在豌豆蚜不同发育阶段(1-4龄若蚜和成蚜)、有翅和无翅孤雌成蚜、孤雌无翅成蚜不同组织(头、胸和腹)、不同地理种群(美国种群、甘肃种群、云南种群和德令哈种群)的孤雌无翅成蚜、不同寄主植物(苜蓿、三叶草和蚕豆)饲养的孤雌无翅成蚜、不同光周期(24L∶0D, 0L∶24D和16L∶8D)下饲养的孤雌无翅成蚜、不同温度(4, 18和35℃)下饲养的孤雌无翅成蚜和吡虫啉(200 g/L)处理下孤雌无翅成蚜中的表达量;利用RefFinder,ΔCt法,GeNorm, NormFinder和BestKeeper对上述14种内参基因表达稳定性进行分析;以CYP6CY3为靶标基因,探究不同内参基因对其在吡虫啉(200 g/L)处理下孤雌无翅成蚜中表达量分析的影响。【结果】依据qPCR检测结果,通过RefFinder对ΔCt法,GeNorm, NormFinder和BestKeeper结果的综合分析显示,在不同生物条件下(发育阶段、翅型、组织、地理种群和寄主植物),18S rRNA和GAPDH是表达最稳定的内参基因,而16S rRNA和Actin的表达稳定性最差。在非生物条件下(光周期、温度和杀虫剂),18S rRNA和EF1α的表达最稳定,而Tubulin和TATA的表达稳定性最差。基于GeNorm最佳内参基因数分析和不同内参基因对靶标基因CYP6CY3表达影响的分析,推荐使用2个表达最稳定内参基因18S rRNA和EF1α用于豌豆蚜的进一步研究。【结论】在豌豆蚜qPCR分析中,推荐同时使用18S rRNA和EF1α作为内参基因。

砂糖橘红鼻子果与韧皮部杆菌侵染相关性研究

利用TaqMan实时荧光定量PCR技术对广东清远、四会、云浮地区砂糖橘90个红鼻子果样品进行检测。结果表明,韧皮部杆菌(Candidatus Liberibacter asiaticus)阳性检出率高达100%。分别对病树上无症状果实、斑驳叶片以及黄化叶片样品进行实时荧光定量PCR检测,阳性检出率分别为27.3%、91.8%、52.0%,因此,可将砂糖橘红鼻子果作为田间诊断黄龙病的典型症状。红鼻子果的果柄和果轴均可检测到病原,且果柄部位病原浓度明显高于果轴。对红鼻子果果柄韧皮部扫描电镜观察,发现果柄筛管中有大量淀粉粒沉积,且韧皮部筛管明显缢缩,阻碍了植株体内糖分和有机质向果实运输。

一株猪细小病毒7群的鉴定和分离

猪细小病毒7群(Porcine parvovirus 7,PPV-7)是2016年首次从美国猪群发现和鉴定的新的猪细小病毒。为弄清我国猪群中是否存在PPV-7,本文用PPV-7特异性的实时荧光定量PCR和常规PCR方法对采集的10份猪流产胎儿和10份保育仔猪病料分别进行检测,结果发现其中1份保育仔猪样品的常规PCR和实时荧光定量PCR检测结果均为阳性,常规PCR扩增出的246 bp特异性条带测序和分子遗传演化时发现,该序列与PPV-7参考毒株KU5637332和KY996757的同源性分别为99.6%和98.0%,表明该样品中含有PPV-7,进一步用PK-15细胞分离病毒,连续传代5次后PK-15细胞都没有出现典型的细胞病变,但其上清液用实时荧光定量PCR方法都可以检测到该病毒。本研究结果证实我国猪群中存在PPV-7的感染,且检测到的PPV-7毒株能在PK15细胞中增殖。

甜菜夜蛾生物钟基因Per和Tim的分子克隆及昼夜表达动态

针对重要农业害虫甜菜夜蛾,通过序列相似性分析从转录组数据获得2个生物钟基因片段,利用RACE技术进一步克隆了cDNA全序列,分别命名为SexiPer和SexiTim。2个基因编码的氨基酸序列和已报道的昆虫同源序列具有较高的相似性,其中SexiPer和海灰翅夜蛾、甘蓝夜蛾的相似性最高,分别为71%和52%;SexiTim和家蚕、柞蚕的相似性最高,分别为65%和52%。进化分析表明,Per基因的氨基酸序列相似性与昆虫间的亲缘关系非常一致,但Tim基因不太一致。进一步利用qRT-PCR技术,对雄蛾触角中2个基因的昼夜表达动态进行了测定,发现2个基因表达量的变化同步,均在光期前期较低,光期后期开始升高,至光期末期达到最高,并在整个暗期保持较高水平。研究认为,甜菜夜蛾触角中可能存在着生物钟,用于调控性信息素通讯的昼夜节律。

蛹虫草类胡萝卜素双加氧裂解酶基因的克隆及表达分析

目的:类胡萝卜素双加氧裂解酶(CCD)是类胡萝卜素生物合成途径中的一个关键酶。旨在鉴定并克隆蛹虫草中的CCD酶,通过相关生物信息学分析和荧光定量PCR探究其结构、功能聚类以及表达调控。方法:用GenBank登录的CCD酶基因序列与蛹虫草基因组比对,在保守区域设计1对引物,以蛹虫草基因组的DNA为模板对CCD酶基因进行扩增,扩增产物命名为car-TC。car-TC基因连接载体后由生物公司测序;序列通过多种生物信息学软件和在线工具分析;表达量随生长情况的变化关系通过实时荧光定量PCR进行测定。结果:克隆了car-TC基因,该基因长1784bp,编码一个577aa的蛋白质,该蛋白质含有CCD酶活性必需的4个组氨酸残基,系统发育进化分析表明该蛋白和棒束菌、白僵菌的同源蛋白聚在同一簇,实时荧光定量PCR结果表明该蛋白的表达量随生长时间的延长而减少。结论:获得一个类胡萝卜素合成途径中的关键酶——双加氧裂解酶基因car-TC,该基因的表达主要受时序调控,随生活周期的进行有逐渐降低的趋势。

两种不同抗旱能力的豇豆根系水通道蛋白基因的克隆与分析

水分对于植物的生长代谢非常重要,植物水通道蛋白(Aquaporins)是一类能快速促进植物水分运输的蛋白质。豇豆拥有顽强的耐旱品质,但在豇豆在水通道蛋白方面的研究还是空白。根据水通道蛋白进化的保守性,本研究从豇豆的表达标签序列(ESTs)中筛选并利用c DNA末端快速扩增技术(RACR)成功从两种豇豆根系中克隆到五个细胞质膜水通道蛋白基因。使用Prot Param、MEGA、Antheprot等生物信息学软件分析了他们的序列的理化性质、进化关系和蛋白二级结构等。利用定量PCR技术首先分析了正常水培下五个基因在两种豇豆根中的表达量,并重点关注了4%浓度的聚乙二醇6000处理24 h后两个表达量高的基因在两种豇豆根中的响应。结果表明,五个水通道蛋白基因编码284~287个氨基酸,理论等电点在7.63~9.08之间,主要定位于质膜上,属于跨膜蛋白。五个水通道蛋白均由无规则卷曲α螺旋、延伸链、和β转角组成。正常水培下两种豇豆根中均以Vu PIP1-1和Vu PIP2-3表达量最高,Vu PIP2-2其次,以Vu PIP1-2和Vu PIP2-1表达量最低。PEG处理下,Vu PIP1-1和Vu PIP2-3在抗旱品种根中无显著变化,而在非抗旱品种根中的表达显著下调。本研究认为,豇豆在应对聚乙二醇诱导的渗透胁迫时,Vu PIP1-1和Vu PIP2-3两个水通道蛋白基因有重要的作用。