PMA-qPCR方法快速检测活性E.coli O157:H7

建立将叠氮溴化丙锭(PMA)与定量PCR(qPCR)技术结合,用于检测热灭活菌背景条件下的大肠杆菌活菌的方法。结果表明:5min以上的强烈光照可以使PMA与DNA共价交联,同时完全钝化游离的PMA以避免"假阴性"结果;抑制死菌DNA扩增的最低PMA质量浓度为10μg/mL,不抑制活菌DNA扩增的最高PMA质量浓度为20μg/mL。当活菌/总菌大于1%时,经PMA预处理,可以消除热灭活菌DNA的干扰,实现对活菌的定量检测。

猪伪狂犬病病毒变异毒株与经典毒株实时荧光定量PCR鉴别诊断方法的建立和应用

为了建立猪伪狂犬病病毒(PRV)变异毒株与经典毒株的快速鉴别诊断方法,本试验根据PRV变异毒株与经典毒株的糖蛋白gC基因设计鉴别引物和探针,加入纳米金优化建立实时荧光定量聚合酶链式反应(qPCR)检测方法,验证其敏感性、特异性和重复性。利用建立的qPCR和测序分析方法同时对新疆4个不同地区采集的猪场临床样品进行检测和分析。优化后的qPCR检测结果显示,重组阳性质粒PUC57-Var标准品在1×10^(9)~1×10^(3)copies/μL范围内线性关系良好,相关系数为0.999,斜率为-3.325,最低检测限为1×10^(3)copies/μL,与其他猪源常见病毒未发生交叉反应,组内和组间重复性试验的变异系数均小于3%;该qPCR方法对临床样品的检测结果与测序分析结果一致。结果表明,本试验建立的qPCR方法可用于PRV变异毒株与经典毒株的鉴别诊断,为PRV的准确诊断和疫苗应用提供科学依据。

应用微量蛋白质定量分析评估临床样本炎性反应状态

目的比较实时荧光定量PCR(qPCR)和微量蛋白质定量分析方法在乳腺癌患者外周血单核细胞中炎性相关因子caspase-1和IL-1β表达检测中的效果差异。方法收集10例乳腺癌患者的术前、术后2 h配对外周血样本各约6 mL,分离出外周血单核细胞并通过脂多糖活化;分别用qPCR和微量蛋白质定量分析方法,检测caspase-1和IL-1β在单核细胞中的mRNA和蛋白质表达水平,并使用了β-actin进行了数据归一化,比较两种检测方法结果的异同,并评估其优缺点。结果绝大部分患者经过手术应激后外周血单核细胞数量明显增加。在mRNA水平上,与术前相比,术后caspase-1和IL-1β在50%(5/10)和40%(4/10)的患者中呈现升高趋势,其余表现为降低(分别为40%和50%)或改变甚微无统计学意义(均为10%)。而微量蛋白质定量分析结果显示,与术前相比,术后caspase-1和IL-1β蛋白在60%(6/10)和60%(6/10)的患者中呈现升高趋势,其余表现为降低(分别为30%和20%)或改变较小无统计学意义(分别为10%和20%),且80%的患者在术后出现了明显增加的caspase-1和IL-1β活性切割电泳条带。重要的是,有30%和40%的患者手术前后caspase-1和IL-1βmRNA和蛋白质水平变化不一致。结论微量蛋白质定量分析方法具有样本用量少、灵敏度高、重复性好、操作相对简单等优点,更适于临床样本的炎性反应状态评估。

环境水体中肠道病原细菌的定量PCR检测

采用通用引物,通过实时荧光定量PCR方法（QPCR）,对西安市5处地表水体中肠道病原细菌的细胞密度进行4个月的连续检测,并将QPCR检测结果与滤膜法测得的大肠菌群CFU值进行比较分析.结果显示,QPCR法可信度为94%,最小检测值为每管未稀释DNA提取物含2.7个大肠杆菌细胞.5个水体（N=60）检测结果表明,QPCR检测结果是大肠菌群CFU的2.2-5倍.病原细菌的几何平均值范围,QPCR法在25-67000 CCE/100 mL之间,MF法大肠菌群为3-45000 CFU/100 mL之间.2种方法的离散和回归分析表明,QPCR检测结果与大肠菌群CFU显著正相关,秩相关系数为r=0.983.

环境水体中肠道病原细菌定量PCR检测与膜过滤分析方法的比较

采用通用引物，通过实时荧光定量PCR方法（QPCR），对西安市5个地表水体中肠道病原细菌的细胞密度进行了分析．检测水样体积为100mL，分别于2006年3-6月取自水源水（黑河）、景观娱乐用水（大唐芙蓉园北湖和兴庆湖）、纳污河（泸河）和未消毒的二级出水（北石桥污水处理厂），并将QPCR检测结果与滤膜法（MF）测得的细菌总数、大肠菌群和粪大肠杆菌CFU结果进行了比较分析．5个水体（n=60）检测结果显示，QPCR检测结果是大肠菌群CFU的2，2-5倍，是粪大肠杆菌CFU的7-14倍．病原细菌检测的几何平均值范围，QPCR法在25-67000 CCE·100mL^-1之间，MF法大肠菌群在3-45000 CFU·100mL^-1之间，粪大肠菌群在0-3000 CFU·100mL^-1之间（n=60）．两种方法的检测结果使用Spearman秩相关法来计算，结果显示，QPCR检测结果与大肠菌群、细菌总数以及粪大肠杆菌CFU均呈现显著正相关，秩相关系数分别为r=0．983、r=0．908和r=0．948．

栉孔扇贝内参基因稳定性研究

合适的内参基因对准确定量目标基因表达水平非常重要。利用实时定量聚合酶链式反应(RT-qPCR)分析了不同发育阶段和雌激素暴露条件下栉孔扇贝性腺组织中β-actin、β-TUB、EF-lα、18SrRNA和GAPDH5个内参基因的表达水平,并利用RefFinder软件对其表达稳定性进行了分析。结果表明:在所考察的内参基因中,EF-lα在栉孔扇贝不同发育阶段和雌激素暴露下的表达均最为稳定,可作为定量目标基因表达水平的内参基因之一。

mok E基因过表达对红曲霉Monacolin K产量、菌丝及孢子形态的影响

红曲霉中mok E基因是红曲霉次级代谢产物Monacolin K生物合成的一个相关基因,mok E基因表达量与Monacolin K产量呈正相关。以mok E基因为目的基因,构建红曲霉mok E基因过表达工程菌株,通过逆转录实时荧光定量聚合酶链式反应(reverse transcription-quantitative real-time polymerase chain reaction,RT-q PCR)确定mok E基因过表达转化子,对转化子Monacolin K产量进行测定,同时利用扫描电镜,对野生型红曲霉M1及转化子菌丝、孢子进行观察。结果表明:以潮霉素抗性基因为筛选标记,成功得到240个转化子,对其中9个转化子进行mok E基因表达量测定,有3株转化子mok E基因表达量增加,分别为T2、T8、T9转化子,确定其为mok E基因过表达转化子;T2、T8、T9转化子内酯型Monacolin K产量分别为2 159.7、4 177.6、3 365.7μg/g,与野生型红曲霉Monacolin K产量(1 447.8μg/g)相比,分别提高了49.2%、188.5%及132.5%。扫描电镜结果显示,mok E基因过表达,对红曲霉的菌丝体、孢子形态及生殖方式均有影响。

清开灵注射液体外抗2型登革病毒的作用

目的研究清开灵注射液(简称清开灵)体外抗2型登革病毒(dengue virus 2,DENV2)的作用。方法 (1)稀释清开灵至不同质量浓度(72.000、63.000、54.000、45.000、22.500、11.250 mg/mL),同时稀释利巴韦林注射液(简称利巴韦林,12.500、6.250、3.125、1.563、0.781、0.391 mg/m L)作为阳性对照,生理盐水为空白对照,利用MTT比色法分别检测上述药物对人肝癌细胞HepG2株的细胞毒性作用,并确定各药物的最大无毒质量浓度;(2)分别稀释清开灵和利巴韦林并与DENV2(MOI=0.5)等体积混合孵育30 min后,接种于HepG2细胞,于2、8、24 h后取细胞上清,利用间接免疫荧光(indirect immunofluorescence assay,IFA)检测阳性细胞率和实时定量聚合酶链反应(real-time quantitative polymerase chain reaction,qPCR)检测DENV2基因组表达水平,验证清开灵对DENV2的直接灭活作用;(3)稀释清开灵或利巴韦林并与DENV2(MOI=0.5)等体积混合后接种于HepG2细胞,2 h后收获细胞,利用IFA验证清开灵对DENV2的抑制作用;(4)DENV2(MOI=0.5)感染HepG2细胞1 h后,弃上清加入含清开灵或利巴韦林的维持液,于感染后2、8、24 h收获细胞上清,利用IFA和qPCR验证清开灵直接给药的抗病毒作用;(5)用清开灵或利巴韦林预处理HepG2细胞2 h,加入DENV2(MOI=0.5)孵育1 h弃上清,再次相应加入清开灵和利巴韦林(维持治疗),于感染后2、8、24 h收获细胞上清,IFA和qPCR验证清开灵预给药联合维持治疗的抗病毒作用。结果 (1)清开灵的最大无毒质量浓度为11.250 mg/m L,利巴韦林的最大无毒质量浓度为1.563 mg/m L;(2)直接灭活:2、8、24 h,清开灵和利巴韦林检测水平均优于空白对照(P<0.01),而且清开灵在2 h和24 h的IFA检测水平均优于利巴韦林(P<0.01),以及8 h和24 h的qPCR检测水平均优于利巴韦林(P<0.01);(3)抑制病毒进入:清开灵与利巴韦林的IFA检测均优于空白对照(P<0.01);(4)直接给药:药物作用2、8、24 h后,清开灵和利巴韦林不同时相点检测水平均优于空白对照(P<0.01);(5)预给药联合维持治疗:药物作用2、8、24 h后,清开灵和利巴韦林不同时相点检测水平均优于空白对照(P<0.01),而且清开灵的不同时相点的IFA检测水平均优于利巴韦林(P<0.01)。结论清开灵具有明显的体外抗DENV2的作用,且以预给药联合维持治疗的给药方式抗病毒作用最佳。

实时荧光定量PCR技术的优化及其在恙虫病东方体诊断中的应用

目的建立一种优化的实时荧光定量PCR技术,并用于诊断粤北山区恙虫病东方体(Ot)基因型。方法采用优化实时荧光定量PCR技术对感染Ot的患者和鼠类的血液和组织标本检测Ot DNA载量并分析其基因型,并与未优化实时荧光定量PCR和巢式PCR的检测结果进行比较。结果采用优化实时荧光定量PCR技术检测660例发热患者,有224例检测到Ot,其中108例是发热5d内的早期患恙虫病患者,以及在55份鼠类的标本中有12份能检测到感染Ot,均为Gilliam型;未优化实时荧光定量PCR在患病7d以上才能检测到Ot。同时,在鼠类基因扩增片段还显示出与Gilliam、Karp、Kato3株国际参考株不同,经巢式PCR分型证实为Kawasaki型,与巢式PCR基因分型的结果相符。结论优化实时荧光定量PCR技术可作为早期诊断恙虫病的实验方法,用于快速分析Ot基因型,适合在基层医院推广应用。

两种实时定量RT-PCR方法检测miRNAs表达的技术分析

目的比较两种实时定量反转录聚合酶链反应(RT-qPCR)方法检测microRNAs(miRNAs)表达含量的技术差异,优化不同实验目的和条件下研究miRNAs表达的技术方法。方法取21d和42d两个时间点的SD大鼠关节软骨组织,采用Trizol法提取总RNA备用。选取rno-miR-15b、rno-miR-16、rno-miR-195、rno-miR-497作为研究对象,分别用茎环引物和试剂公司提供的试剂盒方法反转录总RNA,并应用实时定量PCR方法检测这些miRNAs的表达量。提取人血浆中总RNA,用上述两种RT-qPCR方法实时定量检测has-miR-16的表达量。结果两种方法检测这些miRNAs表达量,在大鼠21d和42d这两个时间点其表达量变化趋势相同,都呈现增高的趋势,这与我们前期Solexa测序结果相同。在血浆中的结果显示,其中茎环引物反转录方法灵敏度相对较高。结论茎环引物法在少量几个重要的miRNAs检测中具有优势,而试剂盒方法适用于大量miRNAs的筛查。

新型猪源H1N1流感病毒的分离鉴定及在实验条件下气源性传播的特点

新型猪源性H1N1流感病毒能引起人和猪的呼吸道传染性疾病,自2009年4月起在全球范围内暴发,引起广泛的关注和研究,本试验拟对其分离株的气源性传播特点进行研究。2011年1月,华东某地区出现流感疫情,本研究从病死猪的鼻腔棉拭子和肺脏中分离到1株新型猪源性H1N1流感病毒A/swine/Shandong/07/2011;用荧光定量PCR方法检测发病猪场舍内、外的空气样品中病毒含量;建立气溶胶传染模型来分析该株病毒在实验条件下气源性传播的特点。结果显示:猪舍内空气样品的阳性率为26.10%,病毒含量在3.14～5.72log10copies.m-3空气之间;舍外下风向10m处空气样品的阳性率为40.70%,病毒含量在2.24～3.77log10copies.m-3空气之间;在传染模型中,A/swine/Shandong/07/2011能够造成气溶胶感染组试验猪的感染,但感染率比直接接触组低。研究表明,A/swine/Shandong/07/2011株具有形成病毒气溶胶的能力,在实验条件下能够引起气源性感染。

数字PCR在食品安全检测中的应用研究进展

聚合酶链反应(PCR)在动植物源掺杂鉴别、转基因成分和致病微生物等食品安全检测领域成为日趋重要的检测技术。从传统PCR、荧光PCR到数字PCR,PCR技术逐渐从定性分析、半定量分析发展到准确定量,不仅提升了准确度和检测效率,同时也扩展了食品检测范围,使食品安全的监管更加精细化。该文总结了近5年来数字PCR在食品安全检测中的研究进展,比较了传统PCR、荧光定量PCR和数字PCR的相关标准制订情况,列举、讨论了数字PCR在不同食品安全领域检测中的技术进展和存在的问题,并对数字PCR未来发展方向进行了展望。

补中益气汤体内外对脾虚证两种特征菌数量的影响

目的前期研究发现脾虚证患者的肠道菌群发生显著变化,针对其中丰度明显改变的艾克曼菌ATCC BAA-835(Akkermansia muciniphila ATCC BAA-835,AKK)和单形拟杆菌(Bacteroides uniformis,BU)建立实时荧光定量聚合酶链式反应(Quantitative real-time polymerase chain reaction,QPCR)检测方法,通过体外孵育和体内动物实验考察补中益气汤对其的影响。方法采用模拟人体胃肠道代谢方法,将补中益气汤水煎剂与人工胃/肠液孵育后,与健康人群/脾虚证患者粪便共孵育,将粪便样品、24 h孵育样品进行微生物多样性测序;筛选AKK和BU特异性引物并建立其QPCR分析方法,检测补中益气汤与健康人群/脾虚证患者粪便共孵育后AKK和BU菌不同时间点的动态变化;采用番泻叶灌胃塑造脾虚证小鼠模型并给予补中益气汤治疗,考察补中益气汤对脾虚证小鼠体内AKK和BU菌含量的影响。结果测序结果表明,健康人群和脾虚证患者肠道菌群结构存在明显差异,补中益气汤对粪便孵育液中肠道微生物具有一定的调节作用。方法学考察结果表明,建立的AKK和BU的QPCR定量检测方法重复性、稳定性良好,定量结果可靠。补中益气汤体外与健康人群/脾虚证患者粪便共孵育,其中AKK和BU呈现动态变化过程,其对健康人群/脾虚证患者粪便中AKK和BU均具有一定影响。孵育24 h,补中益气汤对脾虚证患者粪便样本中的AKK菌无显著影响,但可显著降低脾虚证患者粪便中BU菌含量(P<0.01)并恢复至健康人的水平。体内动物实验结果表明,补中益气汤体内可显著增加脾虚证小鼠粪便样本中AKK菌含量(P<0.01)并降低BU菌含量(P<0.01)。结论补中益气汤体内外可直接调节BU菌含量,降低BU菌含量可能是其治疗脾虚证的分子作用机制之一。

莱茵衣藻APC/C复合物基因家族及CrCDC 20表达谱分析

为揭示莱茵衣藻细胞周期调控机制,提高微藻生物量,通过生物信息学方法,对莱茵衣藻参与细胞周期控制的末期促进复合物(anaphase-promoting complex/cyclosome,APC/C)基因家族的性质进行系统分析,包括基因结构、蛋白质特性和进化树分析等.结果显示,莱茵衣藻包含13个APC/C复合物编码基因,在13号染色体存在一个基因簇.除了激活因子细胞分裂周期蛋白20(cell division cycle 20,CDC20)和CDC20同系蛋白1(CDC20 homolog 1,CDH1)相对保守外,莱茵衣藻APC/C复合物的其他亚基与高等植物来源的蛋白质保守性很低.此外,利用实时荧光定量反转录聚合酶链式反应(real-time fluorescence quantitative reverse transcription polymerase chain reaction,rt-RT-q PCR)分析了莱茵衣藻Cr CDC20基因在缺氮或缺硫下表达谱,发现Cr CDC20基因在缺硫下上调表达,在缺氮下下调表达,说明Cr CDC20参与莱茵衣藻的营养缺乏胁迫应答反应.

荧光定量PCR技术在食品快速检测中的应用

荧光定量聚合酶链式反应(real-time quantitative polymerase chain reaction,qPCR)是一种将聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)扩增与实时检测相结合的技术,也是近年来食品快速检测技术的研究热点之一。与传统PCR技术相比,它具有耗时短、操作简单、灵敏度高、特异性强等优势。本文简要概述了荧光定量PCR技术的基本原理、发展历程、分类及特点,综述了荧光定量PCR技术在食源性致病菌、掺杂掺假、转基因食品、过敏原、食源性寄生虫、可食用昆虫等食品检测中的应用,并对荧光定量PCR技术及其在食品快速检测中应用的前景进行了展望。

巨噬细胞中FBW7沉默对其杀菌能力的抑制

采用小干扰核糖核酸(siRNA)介导Hela细胞、原代巨噬细胞和RAW264.7细胞中FBW7基因沉默,研究其对NF-κB信号通路、细胞因子表达、巨噬细胞吞噬和杀伤细菌能力的影响.通过流式细胞术、抗生素保护试验、实时荧光定量聚合酶链式反应和报告基因的研究方法,发现FBW7沉默不具有调控RAW264.7细胞吞噬细菌的能力,但能显著抑制原代巨噬细胞和RAW264.7细胞的杀菌能力及一氧化氮合成酶(nitric oxide synthase,iNOS)表达,抑制Hela中NF-κB报告基因活性,降低Hela细胞中TNFα、IL-1β和IL-6,以及原代巨噬细胞、RAW264.7细胞中MCP-1和IL-1β表达.结果表明,FBW7沉默可通过影响NF-κB活性抑制巨噬细胞对细菌的杀伤能力.

纳米银颗粒对膜生物反应器运行性能及硝化细菌丰度的影响

考察了0.10 mg/L纳米银对膜生物反应器(MBR)运行、氨氧化菌(AOB)和亚硝酸盐氧化细菌(NOB)丰度的影响。运行试验结果表明,在投放纳米银前后,处理系统对化学需氧量(COD)平均去除率为95.4%和94.1%,处理水中的总氮(TN)以硝态氮为主,硝态氮平均质量浓度前后分别为12.5 mg/L和13.2 mg/L,因此,在纳米银颗粒影响下,MBR仍能达到普通MBR的处理效果。实时定量聚合酶链反应(QPCR)结果表明:在整个运行周期内,AOB与NOB菌群的基因数量都处于107数量级,且硝化螺旋菌Nitrospira为优势NOB;结合银离子的变化规律可知,纳米银大部分富集到污泥中,但硝化菌群的丰度没有受到长期投放纳米银颗粒的影响。

基于ttr基因的mini-MPN-qLAMP法快速定量检测食品中沙门氏菌

该研究通过3管型微量MPN计数法(Mini Most Probable Number,mini-MPN)建立了一种快速定量检测食源性沙门氏菌的荧光定量环介导等温扩增(Quantitative Loop-Mediated Isothermal Amplification,qLAMP)方法。依据沙门菌属ttr基因设计了qLAMP和荧光定量PCR(Quantitative Polymerase Chain Reaction,qPCR)引物,结合5 h BPW增菌和MPN计数法建立了mini-MPN-qLAMP沙门氏菌快速定量检测方法;使用两种人工污染样品对mini-MPN-qLAMP法进行验证,使用Bland-Altman分析比较不同检测方法检测结果的一致性。结果表明,建立的qLAMP法与qPCR法反应特异性均良好,纯培养时qLAMP法检出限为500 CFU/mL。通过Bland-Altman分析表明所建立的mini-MPN-qLAMP法在速冻乌米饭中检测结果与mini-MPN-qPCR、mini-MPN计数法、平板计数法相比均具有较高的一致性,r^(2)≥0.994,检出限为-0.44 lg MPN/mL;而在速冻鸡胸肉中该法检测结果与mini-MPN-qPCR结果一致性最佳,r^(2)=0.990,检出限为-0.64 lg MPN/mL。肉制品中腐败杂菌会影响mini-MPN计数和平板计数结果,mini-MPN-qLAMP可排除肉制品中腐败杂菌对检测结果的影响。该研究所建立的mini-MPN-qLAMP法简单易行,准确度高,可用于食品中沙门氏菌的快速定量检测。

扬子鳄β防御素基因的血液表达谱及饲养密度对防御素基因表达的影响

为研究扬子鳄血液中β防御素基因家族的表达水平和饲养密度对群体防御素基因表达的影响,利用反转录荧光定量聚合酶链式反应(reverse transcription quantitative polymerase chain reaction,RT-qPCR)技术检测41头扬子鳄七龄鳄血液中β防御素基因的表达情况,并分析不同性别和不同饲养密度群体间防御素基因相对表达量的差异。结果表明:在扬子鳄群体血液中,表达的防御素基因有AsBD5和AsBD8,并且这2个基因的表达量之间存在显著的正相关性。AsBD5和AsBD8在雌性和雄性扬子鳄间的表达水平没有显著性差异;但是在不同饲养密度下,2个扬子鳄群体间的表达水平存在显著差异,其中饲养密度较高的扬子鳄群体,整体的防御素表达水平更高,表明饲养密度对扬子鳄圈养种群的免疫状态有一定的影响。

实时定量PCR发展概述

实时定量聚合酶链反应(real-time quantitative polymerase chain reaction,简称qPCR)是一种通过荧光信号对PCR进程进行实时监测,并对未知模板进行定量分析的一种核酸定量技术,该技术在临床诊断和生命科学等多领域发挥着重要的作用。现就生物制品领域有着重要应用价值的中介探针聚合酶链反应(mediator probe polymerase chain reaction,MP PCR)和数字聚合酶链反应(digital polymerase chain reaction,dPCR)新技术加以介绍,同时也对qPCR技术中的关键因素(如参考基因选择和核酸质量评价)以及qPCR最低限度标准(minimum information for the publication of real-time quantitative PCR,MIQE)指南作一概述。