r-PA真核表达载体的构建与鉴定

用SV40和CaMV35S两种启动子分别启动瑞替普酶(reteplase,rPA)和标记基因bar基因,构建能在海带中表达外源基因的重组表达载体。通过PCR方法扩增CaMV35S启动子、bar基因和rPA基因,将扩增的3个片段分别克隆到pGEMTEasyVector上。将CaMV片段亚克隆到pCAT3control载体上得到重组质粒pCAT/CaMV;再将bar基因切下插入到CAT/CaMV上得到重组质粒pCAT/CB,最后将rPA基因片段切下后插入到pCAT/CB上获得重组质粒pSVrPA/CB。PCR、酶切及测序结果均表明已成功扩增出CaMV35S、rPA和bar基因片段,并已顺次正确插入到真核表达载体PCAT3control上,最终成功构建了能在海带中表达rPA的真核表达载体,用基因枪法转入海带中表达,FAPA法测定得到有体外纤溶活性的阳性海带,为后续研究工作打下坚实的基础。

急性心肌梗死CPR后早期r-PA溶栓的临床观察

目的:探讨ST段抬高型急性心肌梗塞(AMI)心肺复苏(CPR)后早期应用重组人纤溶酶原激活剂瑞替普酶(r-PA)静脉溶栓的临床效果。方法:对24例接受心肺复苏(CPR)后r-PA静脉溶栓的ST段抬高型AMI患者,对CPR的发生时间、CPR所需时间、r-PA静脉溶栓结果、CPR并发症进行回顾性分析。结果:CPR发生于症状开始后1～6小时,平均3.5小时。CPR所需时间2～18分钟,平均5.6分钟。22例患者再通,再通率91.66%,脑复苏不全1例,消化道出血2例,无死亡病例。结论:STEMICRP后急诊r-PA静脉溶栓治疗是一种安全、有效的方法。

r-PA与尿激酶在急性ST段抬高型心肌梗死的疗效比较

目的对重组人组织型纤维酶原激活酶衍生物(r-PA)和尿激酶(UK)在急性ST段抬高型心肌梗死患者溶栓的疗效的比较。方法收集住院患者86例,随机分为2组,为r-PA组和UK组,比较两组溶栓再通率及安全性情况。结果 r-PA组12h内溶栓成功率为76.7%,UK组12h内溶栓成功率为55.8%,并发症r-PA比UK组更小。结论 r-PA在溶栓成功率及安全性方面均优于UK组。

单核细胞来源的微颗粒通过PPAR-α-SR-BI途径促进RAW264.7泡沫细胞形成的研究

目的研究单核细胞来源微颗粒对泡沫细胞形成的影响。方法用氧化低密度脂蛋白或者低密度脂蛋白刺激RAW264.7细胞形成泡沫细胞,采用油红染色法对阳性的泡沫细胞进行染色,通过real-time PCR和Western印迹法测定微颗粒对RAW264.7细胞的受体或酶CD36、SR-A、ACAT1、nCEH、ABCA1、ABCG1、SR-BI的影响。结果单核细胞来源的微颗粒影响RAW264.7细胞的活力;单核细胞来源的微颗粒可促进RAW264.7细胞的泡沫化形成;低浓度(20μl/ml)微颗粒可轻微促进巨噬细胞对低密度脂蛋白的吞噬,但对氧化低密度脂蛋白的吞噬却没有影响;过氧化物酶体增殖物激活受体-α(PPAR-α)的激动剂可增强泡沫细胞形成,拮抗剂作用相反。单核细胞来源微颗粒可下调SR-BI在mRNA和蛋白质水平的表达。PPAR-α激动剂可下调单核细胞来源微颗粒对RAW264.7巨噬细胞中SR-BI蛋白表达,PPAR-α拮抗剂没有影响。结论单核细胞来源的微颗粒通过引起过氧化物酶体增殖物激活受体-α的表达,进而使巨噬细胞表面SR-BI的表达降低,从而促进RAW264.7泡沫细胞形成。

乳酸片球菌R-4细菌素PA-1原核表达及其理化特性

为实现原核表达产出细菌素并检测其理化特性,作者将乳酸片球菌R-4细菌素pedA基因进行扩增回收,与pMD19-T载体连接后转入E.coli DH5α感受态细胞进行克隆。提取克隆后的pedA基因与表达载体pET-32a(+)连接,形成重组质粒pET-32a-pedA并转入E.coli BL21(DE3)感受态细胞,经异丙基硫代半乳糖苷诱导,乳酸片球菌R-4细菌素PA-1在大肠杆菌细胞进行表达。表达蛋白质经Ni-NTA柱纯化后,以金黄色葡萄球菌为指示菌检测其理化特性。结果表明,在E.coli BL21(DE3)细胞中成功表达相对分子质量为26000的乳酸片球菌R-4细菌素PA-1并完成纯化。纯化后的乳酸片球菌R-4细菌素PA-1在40~121℃作用20 min、在pH 2~12、紫外线照射0~10 h、过氧化氢酶作用2 h后,其抑菌范围分别为14.7~15.6 mm、14.0~16.5 mm、15.1~15.8 mm和14.9 mm,而分别经胃蛋白酶和胰蛋白酶作用2 h均失去抑菌作用。这表明乳酸片球菌R-4细菌素PA-1对高温、强酸强碱、紫外线和过氧化氢酶均具有较好的稳定性,而胃蛋白酶和胰蛋白酶会使其失活。

肺动脉置管灌注r-PA治疗肺动脉栓塞的疗效观察

目的:观察重组人组织型纤溶酶原激酶衍生物(瑞通立r-PA)肺动脉灌注治疗肺动脉栓塞的疗效及安全性。方法:在数字减影血管造影(DSA)下采用瑞通立肺动脉置管灌注治疗肺动脉栓塞26例,观察处理前后肺动脉压、动脉血氧分压、收缩压变化。结果:26例患者术前肺动脉压、动脉血氧分压和收缩压分别为(64.45±7.62)、(75.38±15.87)、(86.53±12.87)mmHg;术后分别为(26.13±9.26)、(90.43±9.27)、(112.73±13.81)mmHg,治疗前后比较均有统计学差异(P<0.01)。结论:瑞通立溶栓可快速缓解肺动脉栓塞临床症状,是一种疗效肯定且安全的方法。

510MPa级汽车大梁钢带冷弯P字型管R角开裂原因分析

从化学成分、金相组织、生产工艺等方面对冷弯P字管R角开裂原因进行分析,找到影响开裂的主要因素,进而开展优化工作,为冷成型用汽车用钢工艺制度奠定基础,提高热轧原料卷冷加工成型性。

瑞替普酶(reteplase)在海带中表达的鉴定分析

为验证本实验室构建的瑞替普酶(reteplase,r-PA)基因是否成功转入海带,本文通过FAPA、PCR、Southern blotting和Western blotting等方法分别从体外纤溶活性、DNA的整合以及目的蛋白的表达等三个方面进行鉴定,并运用固定化金属离子亲和层析对表达的蛋白进行了初步分离纯化。FAPA结果表明转基因海带蛋白具有溶栓活性,PCR和Southern Blotting显示在1 100 bp处有特异性条带,Western blotting在39 ku处有蛋白条带,证明r-PA基因已成功转入海带而且获得稳定表达,海带中表达的r-PA不需复性就具有溶栓活性,同时说明在r-PA N端设计的(His)6有助于我们利用亲和层析分离纯化目的蛋白。

Reteplase基因的克隆及在甲醇毕赤酵母中的表达

进行了组织型纤溶酶原激活剂(t-PA)突变体Reteplase(r-PA)基因的克隆,并在甲醇毕赤酵母(Pichia methanolica)中实现了胞外表达。以基因工程菌株里氏木霉(Trichoderma reesei)306染色体DNA为模板,通过PCR技术克隆了r-PA基因,将扩增产物克隆到pMD18-T载体上并进行了序列测定。测序结果表明:克隆到的基因序列长1.1 kb,与已发表的Reteplase基因同源性达99.91%,其编码的氨基酸顺序一致。文中还构建了甲醇毕赤酵母分泌性表达载体pMETαA-r-PA,用PacⅠ单酶切将pMETαA-r-PA线性化后,采用电转化的方法将其导入甲醇毕赤酵母PMAD16中,PCR和表型鉴定表明,筛选到Reteplase基因已经整合到甲醇毕赤酵母染色体上的阳性克隆。经摇瓶初步培养及以甲醇为唯一碳源诱导表达,胞外Reteplase表达水平最高达27.93mol/(s.L)。

20(R)-人参皂苷Rg_3抗血小板活化因子诱导血管内皮细胞损伤的保护作用

目的探讨20(R)-人参皂苷Rg3抗血小板活化因子(PAF)损伤人脐静脉血管内皮细胞(HUVEC)的保护作用及其机制.方法采用MTT法测定PAF诱导HUVEC活性;用双波长荧光分光光度法测定HUVEC细胞内游离钙离子浓度;用ELISA法测定培养的细胞上清液中t-PA、PAI-1含量.结果 1μmol/LPAF刺激HUVEC 2 h后,可明显降低HUVEC的吸光度值,细胞内钙离子浓度升高,上清液中PAI-1含量明显升高,而t-PA含量无明显变化;20～80μmo/L 20(R)-人参皂苷Rg3可升高HUVEC吸光度值,并呈浓度依赖性显著降低HUVEC内游离钙浓度;20(R)-人参皂苷Rg3降低上清液中PAI-1含量,对t-PA含量无明显影响.结论 20(R)-人参皂苷Rg3对PAF诱导损伤的HUVEC具有抗损伤保护作用,其机理可能与降低细胞内钙离子浓度,抑制PAI-1产生和调节t-PA/PAI-1平衡作用有关.

应用原位PCR技术检测宫颈癌和宫颈上皮内瘤变组织中人乳头瘤病毒DNA

目的 探讨原位PCR(isPCR)技术的敏感性及人乳头瘤病毒 (HPV)与宫颈癌和宫颈上皮内瘤变 (CIN)的关系。方法 采用isPCR技术对 66例宫颈癌和 2 5例CIN组织中的人乳头瘤病毒 (HPV)DNA进行检测。结果 5 2例宫颈癌检测到了HPVDNA ( 78.8% ) ,其中HPV16DNA阳性 4 5例( 78.8% ) ,HPV18DNA阳性 10例 ( 15 .2 % ) ,HPV16、18的DNA均阳性 3例 ,HPV18DNA阳性而HPV16DNA阴性 7例 ,CIN中HPVDNA阳性 13例。结论 isPCR是一种敏感性高、特异性强的方法 ;宫颈癌和CIN的发生与HPV16和HPV 18感染有密切关系。

刺桐胰蛋白酶抑制剂基因的构建及表达研究

刺桐胰蛋白酶抑制剂是胰蛋白酶、组织型纤溶酶原激活剂及瑞替普酶特异性的抑制剂 ,可作为配基制成亲合填料用于纯化上述酶。通过化学合成和PCR结合法合成了ETI基因 ,经过序列分析后将其克隆到大肠杆菌表达载体质粒pET32a中 ,并在大肠杆菌中进行诱导表达。表达蛋白分子量同理论值一致 ,生物活性检测表明复性后的ETI对胰蛋白酶及瑞替普酶具有特异抑制作用。

基于属性多级化的认知诊断计算机化自适应测验设计与实现

本研究在传统CD-CAT的基础上进行拓展,开发设计了可以处理属性多级化的CD-CAT(记为p CD-CAT),而且当测验所有属性的水平数Lk=2时则p CD-CAT可简化为CD-CAT,因此传统CD-CAT是本研究设计开发p CD-CAT的一个特例。Monte Carlo模拟实验结果表明:基于属性多级化框架下设计的p CD-CAT具有较好的诊断正确率、题库安全性和较高的测验效率,弥补了传统CD-CAT不足;当属性多级化时,若采用传统CD-CAT方法,则诊断正确率很不理想(属性模式判准不到30%),表明传统CD-CAT在属性多级化测验情景时不适宜,而本文设计的p CD-CAT是一种不错的选择(属性模式判准高达80%以上)。总之,本研究对于进一步拓展CD-CAT在实践中的应用提供了新方法和新技术支持。

刺桐胰蛋白酶抑制剂的高效表达、纯化、亲和介质的制备及其在r-PA纯化中的应用

刺桐胰蛋白酶抑制剂(ETI)是一种丝氨酸蛋白酶抑制剂,能够特异性结合胰蛋白酶及组织型纤溶酶原激活剂,抑制其活性。因此ETI可以作为配体与固定相偶联制备亲和层析介质,用于tPA(组织型纤溶酶原激活剂)及其突变体的纯化。利用基因工程方法构建了ETI的高表达工程菌株,诱导表达后目的蛋白占总蛋白的39.6%,经包涵体变性、复性、纯化,制备了纯度高于96%的ETI样品,收率达到了63.5%。利用纯化的ETI,偶联制备了亲和层析介质,偶联率达到99%。用制备的ETI亲和层析介质纯化瑞替普酶(r-PA),获得的r-PA样品纯度高于95%,生物学活性高于5×105U/mg。本研究为ETI的进一步生产及应用奠定了基础。

瑞替普酶与尿激酶溶栓治疗急性心肌梗死的疗效分析

目的对比观察瑞替普酶（r—PA）与尿激酶（UK）静脉溶栓治疗急性心肌梗死的效果和安全性。方法观察2005年以来收治的78例急性心肌梗死患者，其中尿激酶治疗组40例，瑞替普酶治疗组38例，观察溶栓再通时间、再通率、不良反应发生率、病死率等。结果r-PA组〈6h组再通率88．9％，6～12h组再通率为72．7％：UK治疗组〈6h组再通率为65．5％，6～12h组再通率为45．5％，两组比较差异有显著性意义（P〈0．05％）。两组之间的不良反应发生率和死亡率、平均住院天数均无统计学差异。结论r—PA对急性心肌梗死的溶栓效果优于UK，而其出血等不良反应发生率与UK相当，且r—PA具有给药方便的优点，是一种比较安全有效的溶栓药物。

瑞替普酶联合丁苯肽胶囊改善急性进展性大脑中动脉缺血性脑卒中患者的临床预后

目的研究瑞替普酶(R-PA)联合丁苯肽胶囊在治疗进展性大脑中动脉急性缺血性脑卒中患者临床预后改善情况。方法通过倾向性匹配法选取2015年1月1日~2017年5月31日在我科接受治疗的急性进展性大脑中动脉缺血性脑卒中患者87例,根据治疗方法不同分为两组:观察组44例,采用R-PA联合丁苯肽胶囊进行治疗;对照组43例,采用阿替普酶(rt-PA)联合丁苯肽胶囊进行治疗,其他治疗及康复两组患者保持一致。比较评价两组患者不同阶段的近期临床预后(NIHSS评分)和远期临床预后(GOS和ADL评分)情况。结果观察组和对照组患者在性别构成、平均年龄、发病距开始治疗时间、脑梗死范围、入院时GCS评分等病情信息的差异均无统计学意义(P>0.05),具有较好的一致性;观察组和对照组患者在溶栓治疗后2h、24h、7d3个时间点的神经功能缺失情况差异无统计学意义(P>0.05),但是在第1月时观察组组患者的NIHSS评分均值更低,差异有统计学意义(P<0.05);观察组较对照组在第3、6、9月时GOS、ADL评分均更高,在第3月时差异无统计学意义(P>0.05),在第6、9月时差异有统计学意义(P<0.05)。以GOS评分在4分以上、ADL评分在75分以上为临床预后恢复良好,两组临床预后良好率差异虽无统计学意义(P>0.05),但观察组较对照组良好率更高,GOS评分两组良好率分别为70.45%、53.49%,ADL评分两组良好率分别为70.45%、60.47%。结论R-PA联合丁苯肽相比较rt-PA联合丁苯肽治疗急性进展性大脑中动脉缺血性脑卒中患者的远期临床预后更好,作为rt-PA的衍生物,R-PA在急性进展性大脑中动脉缺血性脑卒中的治疗表现出一定的治疗优势。

深圳虚拟大学园知识创新网络关系研究

深圳虚拟大学园作为"飞地"型国家级大学科技园,在具有一般大学科技园普遍性特征的同时,成功走出了一条新型科技园发展道路。该发展道路不再局限于促进大学母体科技成果转化这一基本功能,还包括知识转移、知识共享、知识创造等多种知识活动,并逐渐形成以各成员院校的深圳研究院为核心组织的知识创新网络。由此,引入知识网络分析视角,考察虚拟大学园各类知识活动中不同组织间的知识创新网络关系特征,并分析其未来发展趋势。

瑞替普酶在大肠杆菌中的表达与活性测定

目的构建带组氨酸标签(His_6·Tag)的瑞替普酶(Reteplase,r-PA)的表达载体,并在大肠杆菌中表达和活性检测。方法通过引物设计在r-PA基因5’端加上组氨酸标签(His_6·Tag)。克隆到pET23a原核表达载体中,转化E．coli BL21 (DE3),进行IPTG诱导表达。表达产物经亲和层析纯化后,用FAPA法测定其纤溶活性。结果构建的原核表达载体经PCR、酶切鉴定、测序后正确。表达产物分子质量39kDa,为r-PA特异性条带,纯化产物具有纤溶活性。结论成功地在大肠杆菌表达了带有标签的r-PA,简化了下游分离纯化和复性步骤。

后向平滑平方根容积卡尔曼滤波算法及其应用

针对单站无源定位精度低、收敛速度慢和滤波性能不稳定甚至不能工作的问题,提出了后向平滑平方根容积卡尔曼滤波算法。该算法采用Q-R分解的形式,使用误差协方差的平方根进行递推运算,同时其通过后向平滑与量测更新为二次前向滤波提供更为精确的初始值,改善了算法的总体性能。仿真实验表明,该算法在满足实时性要求的基础上,提高了单站无源定位的精度、收敛速度以及稳定性。

半湿润半干旱地区降雨径流关系的区域规律

以陕西地区汉江流域、渭河流域、北洛河和延河流域等15个典型的半湿润半干旱流域为例,分析了各流域的P+P_a-R相关关系,并对其产流规律的区域性进行探讨。研究结果表明,陕西地区汉江、渭河、北洛河和延河流域的P+P_a-R相关图后半部分与45°直线的夹角总体上呈逐渐增大的趋势,且大多数子流域为混合产流,大部分流域的P+P_a-R相关图的后半部分与45°直线有一定的夹角,其中志丹流域和杏河流域超渗产流占主导,P+P_a-R相关图较一致,但均严重偏离45°线。