大鼠膝关节给药rAAV2/TNFR:Fc毒性研究

目的给大鼠膝关节腔注射rAAV2/TNFR:Fc,观察供试品对机体产生的毒性反应及其严重程度、主要毒性靶器官及损害的可逆程度。方法设PBS对照组、人源低剂量组、人源中剂量组、人源高剂量组、鼠源低剂量组、鼠源高剂量组、PBS对照卫星组、人源低剂量卫星组和人源高剂量卫星组,共9个组,分别给予PBS、人源1×1012vg/ml、2×1012vg/ml、3×1012vg/ml、鼠源1×1012vg/ml、3×1012vg/ml、PBS、人源1×1012vg/ml及人源3×1012vg/ml的药物。试验采用膝关节腔注射,每次注射50μl,连续给药8d,每次注射单侧膝关节,左右侧膝关节交替注射,末次给药后连续观察3个月。结果动物的临床症状、尿生化、体温、血液学、血清生化学、脏器重量等均未见生物学意义的改变,病理学检查也未发现与供试品相关的组织病理学改变。关节腔注射后的主要分布组织为:关节腔滑膜、脾脏和淋巴结,随时间延长,供试品在各组织脏器的分布浓度有下降的趋势。大鼠膝关节腔注射给药rAAV2/hTNFR:Fc,动物体内会产生抗AA2结合抗体、抗hTNFR抗体和中和抗体。结论给大鼠关节腔注射rAAV2/TNFR:Fc,连续给药8d的无明显毒副反应剂量为1.5×1011vg/只。

恒河猴膝关节给药rAAV2/hTNFR:Fc毒性研究

目的给恒河猴膝关节腔注射rAAV2/hTNFR:Fc,观察rAAV2/hTNFR:Fc对机体产生的毒性反应及其严重程度、主要毒性靶器官以及损害的可逆程度。方法设PBS对照组、rAAV2/hTNFR:Fc低剂量组和rAAV2/hTNFR:Fc高剂量组,除PBS对照组给予等体积PBS外,rAAV2/hTNFR:Fc低剂量组和高剂量组分别给予1×1012vg/ml、3×1012vg/ml的供试品。均按1ml/只关节腔注射,连续8d,随后观察6个月。结果心电图、尿生化、体温、血液学和血清生化学指标等均未见有明显改变,病理学检查也未发现供试品相关的大体病理学改变和组织病理学改变。给恒河猴膝关节腔注射供试品rAAV2/hTNFR:Fc的主要分布组织为:关节腔滑膜、脾脏和淋巴结,高剂量在肝脏和肺脏有非常低浓度的分布,随时间延长,供试品在各组织的分布浓度有缓慢下降的趋势。结论给恒河猴膝关节腔注射供试品rAAV2/hTNFR:Fc,连续给药8d,无明显毒副反应剂量大于3×1012vg/只。

共表达2个独立的抗关节炎分子TNFR-Fc和CTLA4-FasL重组表达系统的建立与鉴定

目的构建能同时独立表达双抗关节炎分子TNFR-Fc和CTLA4-FasL的重组腺相关病毒(AAV)载体,并对蛋白表达进行鉴定。方法应用furin-2A新型剪切策略,构建TNFR-Fc和CTLA4-FasL双融合基因重组AAV载体,体外转染293T细胞,收集转染上清,以ELISA和Western blot等方法检测目的蛋白的表达。结果成功构建双抗炎分子重组表达载体TFCF,在转染细胞上清中检测到目的蛋白TNFR-Fc和CTLA4-FasL的独立共表达。结论获得了可同时拮抗TNF和T细胞的新型双抗关节炎分子共表达系统,为今后动物体内研究奠定了基础。

大鼠TNFR-Fc重组腺相关病毒载体的构建、表达及中和活性鉴定

目的构建携带大鼠肿瘤坏死因子II型受体胞外区(TNFR)融合大鼠IgG Fc片段的重组2型腺相关病毒载体(pAAV2/TNFR-Fc),并对目的蛋白TNFR-Fc的表达和生物学活性进行初步鉴定,为后续的类风湿关节炎基因治疗研究做准备。方法构建大鼠TNFR-Fc融合基因重组腺相关病毒(AAV)载体,体外转染293T细胞,收集转染上清,以ELISA和Western blot等方法检测目的蛋白的表达,并应用L929细胞测定重组表达产物的TNF-α细胞毒中和活性。结果成功构建重组表达载体pAAV2/TNFR-Fc,在转染细胞上清中检测到目的蛋白TNFR-Fc的表达,其可有效中和大鼠TNF-α的L929细胞毒活性。结论成功构建了大鼠TNFR-Fc融合基因,并验证了其在2型AAV载体上的分泌性表达,为进一步病毒包装及动物实验奠定了基础。

重组人TNFR-Fc基因水稻种子特异表达载体构建

重组人Ⅱ型肿瘤坏死因子受体-抗体融合蛋白(TNFR-Fc)在治疗系统性自身免疫疾病中有很好的功效。目前TNFR-Fc主要通过动物细胞系生产,高昂的成本限制了其大规模应用。使用水稻种子作为生物反应器有望大幅度降低TNFR-Fc的生产成本,提供优质足量的目标产品。为使TNFR-Fc基因能够在水稻中高效表达,该研究拟构建经水稻偏好密码优化的TNFR-Fc基因的种子特异表达载体。通过对水稻和人全基因组密码子使用偏好性进行比较分析并按照水稻最优密码对TNFR-Fc氨基酸序列进行逐一优化,命名为Rf TNFRFc,通过全基因合成法制备该基因片段;同时采用PCR法扩增水稻种子特异表达启动子Glu-4,构建种子特异表达启动子驱动的Rf TNFR-Fc基因表达载体。结果表明:水稻与人多数氨基酸中密码子使用偏好性较为一致,但在L、S、P、R这4种氨基酸的密码子使用偏好性差异较大,优化时对这些密码子进行逐一替换,优化后30.8%的氨基酸密码子发生了变化;PCR扩增获得种子特异启动子,并连接至p CAMBIA1381载体,同时将全基因合成法制备的Rf TNFR-Fc基因连入该载体,PCR、双酶切验证及测序分析表明载体成功构建。该研究构建的Rf TNFR-Fc基因种子特异表达载体,为在水稻种子中大规模生产TNFR-Fc奠定了基础。

表达rhTNFR-Fc的CHO细胞的氨基酸代谢特征及氨基酸流加培养工艺研究

为提高表达重组人肿瘤坏死因子受体-Fc融合蛋白(rhTNFR-Fc)的CHO工程细胞的培养密度和目的蛋白表达,研究了葡萄糖和谷氨酰胺流加-批式培养工艺的细胞氨基酸代谢特征及游离氨基酸和大豆蛋白水解物的补加策略。通过补加葡萄糖和谷氨酰胺浓缩液分别维持其浓度为10 mmol/L和2 mmol/L左右,在不同阶段定期补加特定的氨基酸浓缩液或大豆蛋白水解物补充氨基酸消耗,检测细胞培养上清中rhTNFR-Fc的表达。谷氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、脯氨酸等4种非必需氨基酸快速消耗,是CHO工程细胞增殖和目的蛋白表达的限制性底物。以游离氨基酸、游离氨基酸合并大豆蛋白水解物补充氨基酸消耗可分别使细胞生长密度提高50%、100%,目的蛋白表达增加60%、125%,培养时程延长44%、66%,同时葡萄糖比消耗率、乳酸比生成率降低,谷氨酰胺的利用效率提高。

不同肿瘤坏死因子受体-Fc融合蛋白N-糖基化修饰糖链的初步分析

目的建立基于LC-MS的N-糖基化修饰糖链的分析方法,并比较不同肿瘤坏死因子受体(TNFR)-Fc融合蛋白N-糖基化修饰差异。方法用肽-N-糖苷酶F释放糖蛋白中的修饰糖链,有机溶剂沉淀蛋白后,利用还原胺化反应将2-氨基苯甲酰胺标记至糖链上,并通过亲水作用萃取柱除去过量标记试剂,所得糖链采用ZIC-HILIC亲水作用色谱柱结合离子阱质谱进行分析。以市售TNFR-Fc融合蛋白为标准品,优化影响标记效率的各种因素后,对A和B两种TNFR-Fc融合蛋白制品的N-糖基化修饰糖链进行了分析和比较。结果 TNFR-Fc融合蛋白A和B中的修饰糖链主要含有岩藻糖、末端唾液酸、末端半乳糖、末端N-乙酰葡糖胺等糖型,且末端唾液酸含量相近,但融合蛋白A的岩藻糖和末端N-乙酰基葡萄糖的含量显著高于融合蛋白B,而融合蛋白B末端半乳糖含量高于融合蛋白A。结论成功建立了基于LC-MS的N-糖基化修饰糖链的分析方法,该方法可有效分析糖蛋白中的修饰糖链类型和含量比例,对于详细表征糖蛋白药物结构及性质具有参考价值,并为进一步研究糖基化对糖蛋白药物药理活性以及药代动力学研究奠定了良好基础。

肌内注射rAAV2/rTNFR：Fc对大鼠胶原性类风湿关节炎模型的治疗作用

目的观察肌肉注射2型重组腺相关病毒/肿瘤坏死因子受体:IgG1FC融合基因(rAAV2/rTNFR:Fc)对大鼠类风湿关节炎模型的治疗作用。方法皮内注射Ⅱ型胶原乳剂,诱发胶原性大鼠类风湿关节炎模型。将大鼠随机分为5组,每组10只,包括:正常对照组、模型对照组、载体对照组、地塞米松对照组和rAAV2/rTNFR:Fc肌肉注射给药组。观察各组大鼠的关节炎指数(AI)、关节肿胀程度、踝关节的X线变化、组织病理改变与动物血清肿瘤坏死因子(TNF)-α及其受体(TNFR)水平。结果与模型对照和载体对照组比较,肌肉注射rAAV2/rTNFR:Fc可使关节炎症明显减轻,AI降低、关节肿胀程度减轻;X线检查显示rAAV2/rTNFR:Fc给药组关节结构清晰,无明显骨质破坏。组织病理检查结果也表明,给药组关节腔内滑膜增生和炎性细胞浸润程度减轻,增生的血管翳肉芽组织减少;此外,与模型对照组和载体对照组比较,给药组血清中TNF-α水平显著下降(P<0.05),而TNFR水平明显上升(P<0.05)。结论肌肉注射给予rAAV2/rTNFR:Fc对大鼠胶原性类风湿关节炎模型具有明显的抗炎作用。

表达TNFR-Fc融合蛋白的GS-CHO细胞动态流加培养过程的设计

人肿瘤坏死因子受体Ⅱ-Fc融合蛋白在治疗风湿性、类风湿性关节炎方面拥有广阔的市场前景和巨大的经济价值。本实验以表达TNFR-Fc融合蛋白的GS-CHO细胞为研究对象,结合细胞生长代谢特性和动力学参数分析,以葡萄糖为关键控制参数,通过测定培养上清的葡萄糖浓度对培养过程中的葡萄糖消耗进行及时的预测,调整流加速率,形成了以满足细胞生长代谢需要为基本原则的动态流加培养过程设计模型。在此控制模型指导下,建立了高效的流加培养过程。使最大活细胞密度和最大融合蛋白浓度分别达9.4×106cells/mL和207mg/L,较批次培养分别提高了3.4倍和3倍。本研究所采用的研究方法和控制策略为优化GS-CHO细胞培养过程和TNFR-Fc融合蛋白成功迈向产业化奠定了基础。

N-糖基化对TNFR-Fc融合蛋白结构稳定性和生物活性的影响

目的:探究糖基化对TNFR-Fc融合蛋白结构、稳定性和生物活性的影响。方法:经N-糖酰胺酶F(PNGase F)切除TNFR-Fc融合蛋白所连的糖链,用SEC-HPLC、傅里叶变换红外光谱法和荧光光谱法等方法分析N-糖基化和去糖基化后重组蛋白的结构变化,通过加速稳定性实验和毛细管电泳检测对比其酶切前后稳定性变化,其生物活性的差异经细胞杀伤实验进行比较。结果:去糖基化后TNFR-Fc融合蛋白质分子质量略有降低,其构象、荷电性质及生物活性没有明显差异;然而切除N-糖链,TNFR-Fc二聚体的稳定性降低,蛋白质降解物明显增加。结论:去N-糖基化对TNFR-Fc的构象、荷电性质和生物活性的影响并不显著,但会影响TNFR-Fc融合蛋白的稳定性。

肿瘤坏死因子受体-抗体融合蛋白对佐剂性关节炎大鼠滑膜中TNF-α、TGF-β1和VEGF表达的影响

目的探讨肿瘤坏死因子受体-抗体融合蛋白对佐剂性关节炎大鼠滑膜中肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、转化生长因子-β1(TGF-β1)血管内皮生长因子(VEGF)表达的影响。方法将成年雄性Wistar大鼠随机分为5组,Ⅱ～Ⅴ组建立佐剂性关节炎大鼠(AA)模型,于造模后第12天开始Ⅲ组给予甲氨喋呤灌胃治疗,Ⅳ～Ⅴ组给予益赛普皮下注射治疗。第28天取膝关节滑膜,常规HE染色,计算滑膜病理积分,免疫组织化学染色检测TNF-α、TGF-β1和VEGF在膝关节滑膜的表达。结果正常对照组大鼠滑膜组织均有少量TNF-α、TGF-β1和VEGF的表达,Ⅱ～Ⅴ组较Ⅰ组均明显增高(P<0.05)。Ⅳ、Ⅴ组滑膜组织TNF-α表达较Ⅱ组明显减低(P<0.05),而Ⅲ组与Ⅱ组无统计学意义(P>0.05)。Ⅲ～Ⅴ组滑膜组织TGF-β1、VEGF的表达均明显低于Ⅱ组,差异有统计学意义(P<0.05)。结论可溶性重组人肿瘤坏死因子受体-抗体融合蛋白可明显降低AA大鼠滑膜组织TNF-α、TGF-β1和VEGF表达,对AA大鼠的关节炎症有明显的治疗作用,可能抑制局部组织血管新生。

重组人Ⅱ型肿瘤坏死因子受体-抗体融合蛋白联合芍药苷对人滑膜细胞增殖的影响及部分机制

目的观察重组人Ⅱ型肿瘤坏死因子受体-抗体融合蛋白(rhTNFR:Fc)与芍药苷(Pae)联合应用对人成纤维样滑膜细胞(FLS)增殖的影响,探讨其对肿瘤坏死因子受体(TNFR)信号通路的调节作用。方法经知情同意,收集行髋关节置换术患者正常滑膜组织,采用组织块培养法对人滑膜细胞进行培养。取第3代人FLS,用肿瘤坏死因子α(TNF-α,20μg/L)刺激,分别用rhTNFR:Fc(10 mg/L)、Pae(10-5mol/L)及二者联合干预。MTT法检测人FLS的增殖反应,免疫组化法半定量分析肿瘤坏死因子受体1(TNFR1)、肿瘤坏死因子受体相关因子2(TRAF2)、肿瘤坏死因子受体相关死亡结构蛋白(TRADD)在FLS中的表达情况。结果 rhTNFR:Fc与Pae联合用药对FLS增殖的抑制作用优于rhTNFR:Fc和Pae单独给药组。rhTNFR:Fc、Pae及联合用药均能明显下调FLS中TNFR1和TRAF2表达,上调TRADD表达;与单独用药相比,联合用药能进一步上调TRADD表达,而对TNFR1和TRAF2的表达无明显影响。结论 rhTNFR:Fc和Pae联合用药对人FLS增殖的抑制作用优于单独给药,其作用机制可能与调节TRADD有关。

脊髓损伤后延迟给予腹腔注射依那西普的疗效

目的:观察大鼠在脊髓损伤后延迟给予依那西普的后肢运动功能恢复和脊髓组织凋亡相关基因表达情况,并观察脊髓组织的病理改变。方法:72只成年雄性SPF级SD大鼠,随机分为6组(实验组为E1组、E2组、E3组,对照组为C1组、C2组、C3组),每组12只,采用70 g动脉瘤夹钳夹脊髓1 min制作钳夹型损伤模型,分别在损伤后即刻、1 h、8 h对实验组(E1组、E2组、E3组)予以腹腔注射依那西普1.25 mg/kg,对照组(C1组、C2组、C3组)同样时间点予以腹腔注射生理盐水1 mL,每组取6只大鼠在损伤24 h后处死取脊髓组织,用Western blot法测定损伤处Bax和Bcl-2表达情况,其余大鼠饲养14 d,期间每日予以Basso Beattie Bresnahan(BBB)运动功能评分,并在第14天处死取脊髓组织制成HE染色切片,光镜下观察。结果:(1)Bax和Bcl-2表达情况:E1组Bax表达灰度值为165.423±2.946,E2组为135.391±3.045,E3组为108.543±6.999,对照组为69.054±0.774;E1组Bcl-2表达的灰度值为58.854±3.592,E2组为84.315±2.138,E3组为125.091±2.699,对照组为156.304±2.490,以上各组数据差异均具有统计学意义(P<0.01)。(2)BBB评分结果:损伤后即刻或1 h给予依那西普可以明显改善大鼠BBB评分的恢复情况,进一步比较第14天BBB评分数据,E1组评分平均值为13.000±1.095,C1组为7.167±0.753,E2组为9.833±1.472,C2组为7.000±0.632,以上各组数据差异均有统计学意义(P<0.05),而E3组为7.333±0.516,C3组为6.833±0.753,两组差异无统计学意义(P>0.05)。(3)病理切片结果:光镜下观察E1组和E2组大鼠脊髓病理切片可见散在神经元细胞体,淋巴细胞、成纤维细胞浸润较少,组织坏死程度轻,而E3组和对照组可见大量淋巴细胞和成纤维细胞浸润,组织坏死严重。结论:脊髓损伤后注射依那西普可能会起到抑制脊髓组织凋亡的作用,但给药时间延迟超过8 h会显著降低其凋亡抑制作用,无法显著改善大鼠脊髓病理改变和促进后肢功能的恢复,依那西普用于脊髓损伤的实际临床价值仍有待进一步验证。

肿瘤坏死因子受体-抗体融合蛋白对佐剂性关节炎大鼠滑膜中TNF-α、HIF-1α和VEGF表达的影响

目的探讨肿瘤坏死因子受体-抗体融合蛋白(益赛普)对佐剂性关节炎大鼠滑膜中肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、缺氧诱导因子-1α(HIF-1α)、血管内皮生长因子(VEGF)表达的影响。方法将成年雄性Wistar大鼠随机分为5组,Ⅱ～Ⅴ组建立佐剂性关节炎大鼠(AA)模型,于造模后第12天开始Ⅲ组给予甲氨喋呤灌胃治疗,Ⅳ～Ⅴ组给予益赛普皮下注射治疗。第28天取膝关节滑膜,常规HE染色,计算滑膜病理积分,免疫组织化学染色检测TNF-α、HIF-1α和VEGF在膝关节滑膜的表达。结果Ⅰ组大鼠滑膜组织均有少量TNF-α、HIF-1α和VEGF的表达,Ⅱ～Ⅴ组较Ⅰ组均明显增高。Ⅳ、Ⅴ组滑膜组织TNF-α表达较Ⅱ组明显减低(P<0.01)而Ⅲ组与Ⅱ组差异无统计学意义。Ⅲ～Ⅴ组滑膜组织HIF-1α、VEGF的表达均明显低于Ⅱ组,差异有统计学意义(P<0.01)。结论益赛普可明显降低AA大鼠滑膜组织TNF-α、HIF-1α和VEGF表达。益赛普可以降低AA大鼠的关节炎指数、足体积,减轻足肿胀程度,对AA大鼠的关节炎症有明显的治疗作用。

重组人Ⅱ型肿瘤坏死因子受体-抗体融合蛋白生物仿制药对大鼠类风湿性关节炎的治疗作用

目的:评价重组人Ⅱ型肿瘤坏死因子受体-抗体融合蛋白(TNFR-Fc)生物仿制药对大鼠佐剂性关节炎的治疗作用.方法:将大鼠随机分成6组:阴性对照组(生理盐水)、阳性药物组(Enbrel)和TNFR-Fc高、中、低质量分数组,空白组(无炎症),每组6只,弗氏完全佐剂(CFA)建立类风湿性关节炎模型.给药13 d后,分别测量大鼠体重、后足足垫厚度,关节炎指数评分,ELISA法测量细胞因子水平.结果:与阴性对照组相比,Enbrel组和TNFR-Fc大、中、小质量分数组的大鼠体质量明显增加(P<0.05)、继发性足肿胀减弱(P<0.05)、关节炎评分分值、IL-1β、TNF-α、IL-6含量均减小(P<0.05),IL-10含量升高(P<0.05).结论:TNFR-Fc通过降低炎性细胞因子IL-1β、IL-6、TNF-α水平以及升高IL-10水平来发挥治疗类风湿性关节炎的作用.

大型反应器内pH不均一性对CHO细胞流加培养过程的影响

为了研究大型反应器中p H不均一性对CHO细胞流加培养过程的影响,并将培养过程顺利地放大到生产规模,根据大型反应器的混合特性,构建了搅拌式反应器与平推流反应器串联的规模缩小装置用于模拟大型反应器中的p H不均一性。结果表明停留时间为30 s时,整个培养过程和对照相比并无显著的差异,这表明此时补碱所导致的p H不均一性并未对流加培养工艺造成影响。而随着停留时间的延长,反应器内p H不均一的程度越大,细胞生长和产物表达受到抑制越明显;与此同时,乳酸和氨的累积显著增加,而关键质量属性唾液酸和生物学活性也随之降低。

MG-132提高TNFR-Fc融合蛋白在CHO细胞中表达的研究

目的:在不影响细胞活力的前提下,通过抑制人肿瘤坏死因子受体-Fc(TNFR-Fc)融合蛋白的降解,提高其在中国仓鼠卵巢(CHO)细胞中的产量和质量。方法:通过在细胞培养过程中加入全蛋白质合成抑制剂Cycloheximide、溶酶体抑制剂Leupeptin、蛋白酶体抑制剂MG-132,验证TNFR-Fc融合蛋白在CHO细胞的降解途径;免疫印迹(Western blot)方法检测在细胞内TNFR-Fc融合蛋白的变化,酶联免疫吸附试验(ELISA)方法检测分泌表达的TNFR-Fc融合蛋白的含量。Protein A亲和层析纯化细胞培养液上清,高效液相色谱(HPLC)检测重组蛋白的纯度,并通过阻断肿瘤坏死因子α(TNFα)诱导的L929细胞毒作用来检测纯化的TNFR-Fc蛋白的活性。结果:TNFR-Fc在CHO细胞内,经泛素蛋白酶体途径降解,稳定表达TNFR-Fc的CHO细胞培养过程中添加50μmol/L MG-132,可以使TNFR-Fc融合蛋白的分泌表达量提高42.35%,纯化后,二聚体比例提高28.60%,并且纯化后目的蛋白的比活性也增加。结论:在不影响细胞活力、蛋白质生物学活性的前提下,添加蛋白酶体抑制剂MG-132提高TNFR-Fc融合蛋白在CHO细胞中的表达量,为进一步研究从抑制蛋白质降解途径来提高重组蛋白在CHO细胞中的表达量提供了现实依据。

注射用重组人Ⅱ型肿瘤坏死因子受体-抗体融合蛋白联合甲氨蝶呤、来氟米特治疗类风湿性关节炎的队列研究

目的比较单独应用注射用重组人Ⅱ型肿瘤坏死因子受体-抗体融合蛋白(益赛普)或该药联合甲氨蝶呤、来氟米特治疗类风湿性关节炎的疗效及安全性。方法将30例符合入选标准的类风湿性关节炎患者随机分为试验组与对照组,试验组予以益赛普联合甲氨蝶呤、来氟米特治疗12周后,停用益赛普,甲氨蝶呤、来氟米特继续维持;对照组始终单用益赛普。在2、4、8、12、36、52周评价疗效,记录治疗过程中的不良事件。结果两组疗效及不良反应发生率并无明显差异(P>0.05),两组均未发生严重不良反应。结论短期益赛普续以甲氨蝶呤、来氟米特联合治疗类风湿性关节炎,与单用益赛普疗效相当,可减少益赛普用量,但长期疗效及安全性还需观察。

重组人肿瘤坏死因子受体Ⅱ-Fc融合蛋白联合甲氨蝶呤治疗中重度活动性类风湿关节炎的临床和放射学疗效评估

目的评价重组人肿瘤坏死因子受体Ⅱ-Fc融合蛋白（TNFRⅡ-Fc，商品名：安佰诺）治疗中重度活动性类风湿关节炎（RA）的临床和影像学疗效。方法396例RA患者随机分为联合用药组、TNFRⅡ-Fc组和甲氨蝶呤组，疗程均为24周，单因素方差分析美国风湿病学会（ACR）-N、ACR20、ACR50、ACR70、疾病活动指数（DAS）28和治疗前后双手的X线sharⅡ评分（SHS）等疗效和安全性指标。结果治疗24周后，ACR—N的年改善率联合组为（12．79±9．24）％，TNFRⅡ-Fc组为（9．56±11．16）％，甲氨蝶呤组为（5．08±11．10）％，联合用药组优于TNFRⅡ-Fc组和甲氨蝶呤组（P〈0．05），TNFRⅡ-Fc组优于甲氨蝶呤组（P〈0．05）。ACR20的达标率联合组（80．4％）优于TNFRⅡ-Fc组（71．1％）和甲氨蝶呤组（56．7％），差异有统计学意义（P〈0．05或P〈0．01）。治疗24周后，联合组ACR50和ACR70的达标率分别为53．6％和27．7％，TNFRⅡ-Fc组为41．2％和15．8％，甲氨蝶呤组为30．8％和7．7％，联合组ACR50达标率优于甲氨蝶呤组（P〈0．01），联合组ACR70达标率优于TNFRⅡ-Fc组和甲氨蝶呤组（P〈0．05或P〈0．01）。联合组的DAS28-红细胞沉降率（ESR）改善优于TNFRⅡ-Fc组和甲氨蝶呤组，差异有统计学意义（P〈0．05）。双手SHS评分治疗前后差值联合组（-11．7±11．2）较甲氨蝶呤组（2．1±11．5）显著下降（P=0．03）。联合组不良反应发生率（40．9％）高于甲氨蝶呤组（28．8％），差异有统计学意义（P〈0．05）。结论本研究显示TNFRⅡ-Fc联合甲氨蝶呤较单独使用TNFRⅡ-Fc或甲氨蝶呤能更有效控制RA的活动性和影像学进展。

表达人肿瘤坏死因子受体Ⅱ-Fc的CHO-DG44细胞的培养温度优化研究

目的优化表达人肿瘤坏死因子受体Ⅱ-Fc(TNFR-Fc)融合蛋白的重组CHO-DG44细胞的培养温度,并考察该细胞株在最佳温度放大培养下纯化后的产物纯度及活性。方法采用批次培养方式,将重组中国仓鼠卵巢细胞培养于37℃、37℃转31℃、31℃3种不同的温度下,每日取样检测细胞密度、细胞活率、葡萄糖浓度、乳酸浓度、人肿瘤坏死因子受体Ⅱ-Fc融合蛋白浓度,并选择最佳的培养温度对重组中国仓鼠卵巢细胞进行放大(10、50、200 mL、2 L)培养,所得培养上清经Protein A亲和色谱柱纯化,并采用SDS-PAGE,SE-HPLC,WST-8对人肿瘤坏死因子受体Ⅱ-Fc融合蛋白进行相对分子质量,纯度和生物活性检测。结果研究发现,37℃转31℃的转温度培养条件可在保持高密度活细胞的同时维持细胞活率,延长培养周期,显著提高人肿瘤坏死因子受体Ⅱ-Fc融合蛋白产量,并且该转温度培养工艺可成功地应用于重组CHO细胞的规模放大培养中。纯化后的人肿瘤坏死因子受体Ⅱ-Fc融合蛋白相对分子质量约为150×103,纯度在93%以上,生物活性检测显示其可中和重组人肿瘤坏死因子α的细胞毒效应。结论相比单一的37℃培养条件,37℃转31℃的转温度培养工艺可明显提高重组CHO-DG44细胞的人肿瘤坏死因子受体Ⅱ-Fc融合蛋白表达量,且该工艺具有可放大性,这为该工艺的更大规模应用奠定了基础。