rAAV5阴离子交换层析工艺的开发

建立一种有效提高重组5型腺相关病毒(rAAV5)实心载体比率的阴离子交换层析的纯化方法。对亲和层析捕获的rAAV5样品,使用多种阴离子交换层析柱进行离子强度线性梯度洗脱,CIMmultus QA(CIMQ)层析柱能够有效分离不含目的基因组的病毒(病毒空颗粒)和含目的基因组的病毒(实心载体)。基于CIMQ层析柱,进行纯化缓冲液体系、紫外目标峰收集范围的优化。通过qPCR检测病毒基因组(Vg)含量计算回收率,高效液相色谱法(HPLC)或体积排阻色谱-多角度静态光散射技术(SEC-MALS)测定实心载体比率。使用Tris,Na_(2) HPO_(4),pH 8.0缓冲体系,洗脱时收集紫外吸收值UV_(260)/UV_(280)比值大于1的部分,收集的样品实心载体比率达到80.3%。成功建立一种简单方便的阴离子交换层析方法,能去除rAAV5样品中的病毒空颗粒,使实心载体比率达到基因治疗临床产品要求。

Ad/rAAV杂合体病毒介导抗HBV shRNA表达框定点整合研究

目的探讨解决RNA干扰(RNA interference,RNAi)抗HBV作用时间短暂的问题。方法构建腺病毒/重组腺相关病毒(Adenovirus/recombinant adenovirus associated virus,Ad/rAAV)杂合体病毒,恢复rAAV的定点整合,并借助定点整合的rAAV持续表达shRNA(short hepair RNA),实现RNAi抗HBV的持久性。结果 Ad/rAAV杂合体病毒感染靶细胞后,Rep基因可以在HBV感染细胞中表达,hU6shRNA表达框可以定点整合于细胞基因组AAVS1(adeno-associated virus integration site,腺相关病毒整合位点)中。结论利用Ad、AAV和HBV各种元件构建Ad/rAAV杂合体病毒,作为抗HBV的shRNA表达框的载体,为解决RNAi抗HBV作用时间短暂的问题作了一些技术上的探索。

侧脑室注射rAAV-HIF-1α基因治疗AD模型大鼠的研究

目的在体观察侧脑室注射缺氧诱导因子-1α(hypoxia-inducible factor-1α,HIF-1α)腺相关病毒rAAV-HIF-1α对阿尔茨海默病(Alzheimer's disease,AD)模型大鼠海马神经细胞凋亡的影响。方法健康雄性SD大鼠32只随机分为4组,每组8只:①正常组(normal组):未作任何特殊处理;②AD模型组(AD组):右侧脑室注射2μlβ-淀粉样蛋白(β-amyloid protein,Aβ)25-35(10mg/m1);③假手术组(sham组):右侧脑室注射2μl生理盐水;④AD模型+rAAV-HIF-1a组(AD+rAAV-HIF-1a组):右侧脑室注射2μl Aβ25-35后1周右侧脑室注射10μl rAAV-HIF-1a(1×1012v.g/.m1)。以上各组动物于注射Aβ25-35或生理盐水后5周取材检测海马神经细胞HIF-1a蛋白表达及凋亡百分率。结果 Western blot检测表明rAAV-HIF-1α组海马神经细胞HIF-1α蛋白表达明显增强(P<0.05),同时可显著降低Aβ25-35诱导海马神经细胞凋亡百分率。结论侧脑室注射rAAV-HIF-1α能够在AD模型大鼠海马高效表达HIF-1α蛋白并抑制海马神经细胞凋亡。

鞘内注射rAAV/hPPE对慢性神经病理痛大鼠的镇痛作用

目的观察含人前脑啡肽原基因的腺相关病毒rAAV/hPPE转染后对慢性疼痛模型大鼠的镇痛作用。方法 48只SD大鼠随机分为3组:对照组(C组)、坐骨神经痛(CCI)+rAAV/hPPE注射组(SH组)和CCI+生理盐水注射组(SS组)。SS组和SH组大鼠先行右侧CCI术,1周后分别于蛛网膜下腔L4～L6段注射生理盐水或rAAV/hPPE 20μL。于CCI前至注射后8周内测量大鼠患侧机械痛阈和热痛阈值,并于注射8周后处死大鼠取下段脊髓组织(L4～L6段)行免疫组织化学和放射免疫荧光方法检测亮氨酸脑啡肽(L-EK)的表达及含量。结果 CCI模型建立1周后,SS组和SH组大鼠机械痛阈和热痛阈明显下降(均P<0.01),注射rAAV/hPPE或生理盐水后,SH组大鼠痛阈呈明显上升趋势,而SS组大鼠没有观察到相似现象。注射8周后大鼠下段脊髓组织中L-EK含量,SH组比C组和SS组显著增高。结论 rAAV/hPPE注射能将hPPE整合到宿主神经细胞,从而显著抑制慢性疼痛模型大鼠的痛觉过敏。

表达大鼠脑源性神经营养因子腺相关病毒(rAAV-BDNF)对体外培养海马神经元保护作用的研究

目的:研究表达大鼠脑源性神经营养因子腺相关病毒(rAAV-BDNF)对体外培养海马神经元的保护机制。方法:通过去血清培养诱导神经元凋亡后转染rAAV-BDNF,通过DAPI、PI及Actin染色来统计rAAV-BDNF对血清饥饿引起的细胞凋亡的数量及形态的影响。结果:rAAV-BDNF病毒能够有效地抑制血清饥饿引起的细胞凋亡,其保护效率在65左右,并可以有效地保护血清饥饿引起的细胞形态损伤。结论:rAAV-BDNF可通过抑制凋亡的途径保护体外培养的海马神经元。

rAAV-CD151基因在大鼠缺血后肢血管再生中的作用及血管造影评分

目的:研究肌肉转染重组腺相关病毒(recombinant adeno-associated virus,rAAV)介导的CD151基因在大鼠后肢缺血模型中促血管再生和血运重建的作用。方法:分别包装携带有CD151基因和GFP基因的重组腺相关病毒(rAAV-CD151,rAAV-GFP)。Wistar大鼠12只,随机分为实验组和对照组,每组各6只。实验组大鼠左下肢肌肉注射局部转染rAAV-CD151,对照组注射rAAV-GFP,基因转染2周后行股动脉切除术建立左侧大鼠后肢缺血模型。通过后肢血管造影和缺血肌肉组织毛细血管密度检测,观察缺血肢体血管再生和评价血运重建情况。Western blot检测两组大鼠局部缺血肢体CD151表达。结果:股动脉切除术4周(基因转染6周)后,后肢血管造影结果显示实验组缺血侧血管评分平均为2.56±0.37,对照组平均为1.57±0.39;实验组缺血后肢肌肉组织毛细血管密度为(609.00±83.89)/mm2,对照组为(517.00±70.65)/mm2;两组比较差异均有显著性意义(P<0.05)。Western blot检测结果显示实验组大鼠缺血侧肌肉组织CD151表达为对照组的2.96倍。结论:局部高表达CD151基因能够提高缺血组织的血管再生能力,促进缺血组织的血运重建;CD151将为缺血性疾病的血管再生治疗提供新的靶点。

不同途径导入rAAV-VEGF_(165)基因对大鼠脑缺血边缘区血管生成的影响

目的探讨脑池内及静脉导入重组腺病毒介导血管内皮细胞生长因子(rAAV—VEGF165)基因对大鼠脑缺血边缘区血管生成的影响。方法用线栓加环扎法建立SD大鼠持续性大脑中动脉闭塞(middle cerebral artery occlusion,MCAO)模型。SD大鼠48只,随机分为脑脊液导入组、静脉导入组、单纯梗死组和假手术组,治疗组于术后24h内将rAAV—VEGF165基因通过小脑延髓池或静脉内导入。各组分别于7d和14d断头取脑,CD31免疫组化染色检测脑组织微血管密度。结果各组脑缺血边缘区CD31阳性细胞密度(个／高倍视野,×200)分别为:7d 组:脑脊液导入组92．73±5．18、静脉导入组77．40±5．43、单纯梗死组46．50±5．33和假手术组13．90±1．49(P< 0．05);14d组:脑脊液导入组104．05±4．30、静脉导入组89．88±5．77、单纯梗死组65．33±2．31和假手术组13．90± 1．49(P<0．05)。结论 rAAV—VEGF165基因可以通过脑池内及静脉内导入转染到大鼠缺血脑组织中并表达 VEGF,促进新生血管的形成和侧支循环的建立,治疗脑缺血。

重组腺相关病毒(rAAV)介导基因SMCKA3999对Duchenne肌营养不良病理和功能的影响

目的 研究重组腺相关病毒 (rAAV)载体介导的dystrophin小基因SMCKA3999治疗DMD模型鼠mdx ,从病理和功能观察rAAVSMCKA3999治疗对DMD模型小鼠mdx的疗效。方法 以dystrophin小基因SMCK A3999为目的基因 ,将SMCKA3999克隆至rAAV并包装成rAAVSMCKA3999,以 5× 10 10 病毒颗粒单点注射于DMD模型鼠mdx腓肠肌 ,基因治疗后 4个月及 7个月 ,采用免疫荧光、光镜组织病理、肌电图等方法 ,从形态和功能观察rAAVSMCKA3999治疗对DMD模型小鼠mdx的疗效。 结果 rAAVSMCKA3999使肌膜缺失的dys trophin恢复并稳定表达持续 7个月以上 ,肌肉组织病理改变好转 ,肌病肌电图改变明显改善 ,疗效持续 4个月以上。 结论 rAAVSMCKA3999能改善mdx小鼠骨骼肌的病理及功能 ,采用rAAV介导的dystrophin小基因SMC KA3999对Duchenne肌营养不良基因治疗是有希望的治疗方法。

携带人肝癌细胞CDK2基因的rAAV载体的构建与鉴定

目的构建携带人肝癌细胞CDK2基因的重组腺相关病毒(rAAV)载体;方法设计能表达CDK2特异性的小干扰RNA(siRNA),构建pAKD-shRNA-CDK2重组质粒,采用磷酸钙共转染法将重组质粒pAKD-shRNACDK2、包装质粒pAAV-RC和辅助质粒pHelper共转染AAV-293细胞,采用定量PCR方法对病毒进行滴度测定;结果三质粒共转染AAV-293细胞48h后,荧光显微镜下检测到GFP绿色荧光,表明共转染成功,测定病毒平均滴度为3.56×1012v.g/ml。结论成功构建携带人肝癌细胞CDK2基因的重组腺相关病毒rAAV-shRNA-CDK2。

恒河猴膝关节给药rAAV2/hTNFR:Fc毒性研究

目的给恒河猴膝关节腔注射rAAV2/hTNFR:Fc,观察rAAV2/hTNFR:Fc对机体产生的毒性反应及其严重程度、主要毒性靶器官以及损害的可逆程度。方法设PBS对照组、rAAV2/hTNFR:Fc低剂量组和rAAV2/hTNFR:Fc高剂量组,除PBS对照组给予等体积PBS外,rAAV2/hTNFR:Fc低剂量组和高剂量组分别给予1×1012vg/ml、3×1012vg/ml的供试品。均按1ml/只关节腔注射,连续8d,随后观察6个月。结果心电图、尿生化、体温、血液学和血清生化学指标等均未见有明显改变,病理学检查也未发现供试品相关的大体病理学改变和组织病理学改变。给恒河猴膝关节腔注射供试品rAAV2/hTNFR:Fc的主要分布组织为:关节腔滑膜、脾脏和淋巴结,高剂量在肝脏和肺脏有非常低浓度的分布,随时间延长,供试品在各组织的分布浓度有缓慢下降的趋势。结论给恒河猴膝关节腔注射供试品rAAV2/hTNFR:Fc,连续给药8d,无明显毒副反应剂量大于3×1012vg/只。

大鼠膝关节给药rAAV2/TNFR:Fc毒性研究

目的给大鼠膝关节腔注射rAAV2/TNFR:Fc,观察供试品对机体产生的毒性反应及其严重程度、主要毒性靶器官及损害的可逆程度。方法设PBS对照组、人源低剂量组、人源中剂量组、人源高剂量组、鼠源低剂量组、鼠源高剂量组、PBS对照卫星组、人源低剂量卫星组和人源高剂量卫星组,共9个组,分别给予PBS、人源1×1012vg/ml、2×1012vg/ml、3×1012vg/ml、鼠源1×1012vg/ml、3×1012vg/ml、PBS、人源1×1012vg/ml及人源3×1012vg/ml的药物。试验采用膝关节腔注射,每次注射50μl,连续给药8d,每次注射单侧膝关节,左右侧膝关节交替注射,末次给药后连续观察3个月。结果动物的临床症状、尿生化、体温、血液学、血清生化学、脏器重量等均未见生物学意义的改变,病理学检查也未发现与供试品相关的组织病理学改变。关节腔注射后的主要分布组织为:关节腔滑膜、脾脏和淋巴结,随时间延长,供试品在各组织脏器的分布浓度有下降的趋势。大鼠膝关节腔注射给药rAAV2/hTNFR:Fc,动物体内会产生抗AA2结合抗体、抗hTNFR抗体和中和抗体。结论给大鼠关节腔注射rAAV2/TNFR:Fc,连续给药8d的无明显毒副反应剂量为1.5×1011vg/只。

用于IDDM基因治疗的rAAV2-GAD-Ig的研制

目的: 构建重组真核表达载体pSNAV- GAD -Ig[GAD- Ig融合基因是由小鼠GAD(glutamicaciddecarboxylase)基因插入到小鼠IgG3重链(Ig)基因的N端而成的 ], 制备含GAD- Ig融合基因cDNA的重组缺陷型腺相关病毒 -2 (rAAV2- GAD -Ig), 并探讨rAAV2所介导的GAD- Ig是否能诱导I型糖尿病(IDDM)动物模型 NOD(nonobesediabetic)小鼠产生特异性免疫耐受。方法: 从含GAD- Ig融合基因的中介载体BSSK(BSSK- GAD- Ig)中, 用PCR方法扩增目的基因片段, 并克隆入真核表达载体pSNAV中, 构建重组真核表达载体pSNAV- GAD Ig。以脂质体法将pSNAV GAD -Ig转染到rAAV2包装细胞BHK -21中, 产生rAAV2 -GAD- Ig。采用R-T PCR、Westernblot和ELISA法, 检测rAAV2- GAD -Ig感染的BHK- 21细胞中目的基因的表达。应用GAD抗原体外诱导特异性T细胞的二次应答, 来检测rAAV2所介导的GAD -Ig是否能诱导NOD小鼠产生特异性免疫耐受。结果: GAD- Ig目的基因已整合到靶细胞的基因组中, 并能以分泌形式表达目的蛋白GAD- Ig。将rAAV2 GAD- Ig肌注后, NOD小鼠能产生特异性免疫耐受。结论: 获得了可用于NOD小鼠治疗研究的rAAV2 GAD- Ig。

rAAV介导的HIF-1α—RNAi载体的构建

目的构建以rAAV为载体、GFP为报告基因和HIF-1α为靶基因的RNA干扰。方法提取人基因组DNA，PCR扩增人H1启动子，插入载体质粒pAAV-hrGFP的CMV启动子前方Mlu Ⅰ单克隆位点，构建成pH1—hrGFP；根据HIF-1α的有效干扰位点，合成两条分别为58bp互补的寡核苷酸链，通过体外退火形成双链，然后插入pH1-hrGFP的H1启动子尾部Xba Ⅰ和MunⅠ位点，构建成pH1—siRNA；将载体质粒pH1-siRNA和辅助质粒pRC、pHelper共转染HEK293细胞，反复冻溶后收集上清，浓缩纯化，电镜观察病毒形态和ELISA法测定病毒滴度。结果构建的pH1-hrGFP质粒，通过酶切、PCR检测以及测序鉴定均正确；构建的pH1—siRNA，通过酶切及测序鉴定也正确；包装的rAAV经电镜检测形态正常，滴度达1．2×10^12 v．p／mL。结论成功构建了rAAV介导的HIF-1α—RNAi表达载体，为今后的体内外试验奠定了基础。

rAAV-hBMP2-GFP载体感染滴度测定方法的建立

目的建立携骨形态发生蛋白2基因的重组腺相关病毒载体(rAAV-hBMP2-GFP)感染滴度测定的方法,并制备高滴度的rAAV-hBMP2-GFP病毒液,为进一步实验hBMP2诱导大鼠牙槽骨骨缺损修复的基因治疗提供有利的工具。方法通过分析腺相关病毒-HT1080(AAV-HT1080)细胞接种量、培养时间及病毒吸附时间等参数,建立应用荧光计数法测定rAAV-hBMP2-GFP病毒感染滴度的方法,并分析其精密性及检测病毒的稳定性。结果 AAV-HT1080细胞的最佳接种浓度、培养时间及病毒吸附时间分别为3×105个/孔、24h及48h,在此条件下收获的病毒液的感染滴度最高可达3.82×1011/ml,所建立的荧光计数检测方法精密性较好。制备的病毒液的平均感染滴度为3.60×1011/ml,4℃和37℃保存7d及反复冻融5次,稳定性良好。结论建立了rAAV-hBMP2-GFP感染滴度的测定方法,并制备了高滴度及滴度稳定的rAAV-hBMP2-GFP病毒液。

重组腺相关病毒载体类体内基因治疗产品临床试验申请药学研究与评价技术指导原则(一)

一、前言体内基因治疗产品一般选用适当的载体或转染方式将外源基因(或基因编辑工具)导入人体,通过替代、补偿、阻断、修正特定基因以达到治疗疾病的目的。重组腺相关病毒(recombinant adeno-associated virus,rAAV)载体因其理化性质稳定、致病性弱、整合风险低、外源基因表达持久等结构和生物学方面的优势,已成为体内基因治疗领域研究、应用最为广泛的载体之一。

重组腺相关病毒载体类体内基因治疗产品临床试验申请药学研究与评价技术指导原则(二)

二、适用范围本指导原则中的rAAV载体是指基于腺相关病毒的结构和理化特性,经设计和重组改造所形成的用于携带外源目的基因(或核酸片段)的病毒载体。本指导原则主要针对应用于体内基因治疗的rAAV载体类产品在申报临床试验时应完成和提交的药学研究信息提出建议。

重组腺相关病毒载体类体内基因治疗产品临床试验申请药学研究与评价技术指导原则(七)

六、质量研究与质量标准1.质量研究rAAV载体类产品的质量研究应根据产品的设计、作用机制和生产工艺等方面确定,一般包括(但不限于):鉴别、结构分析、一般理化特性、含量、纯度、生物学活性、杂质、污染物检测等。研究样品应具有代表性,如工艺相近或相同的非临床研究用样品、临床试验用药品等。质量研究信息应完整,包括分析方法原理介绍、研究样品、试验条件和基本步骤、数据处理和结果分析等,分析方法应能满足预期用途。

rAAV-IGF-I诱导大鼠下颌髁突生长发育的实验研究

目的评价局部注射重组腺相关病毒介导胰岛素样生长因子-I(rAAV-IGF-I)对大鼠下颌髁突生长发育的影响。方法选用5周龄Sprague-Daw ley(SD)大鼠20只,随机分为4组。在每只大鼠的左侧颞下颌关节腔内注射rAAV-IGF-I,右侧关节腔内注射生理盐水。手术后2周、4周、8周及12周后分别处死并取出下颌骨,拍摄两侧下颌骨的数码照片进行测量比较。结果实验组下颌髁突长度、髁突头宽度、髁突头中点及髁突头下点到下颌平面的距离从实验4周时出现明显差异。实验组下颌骨的长度及髁突前点到下颌平面的距离在实验8周及12周中明显长于对照组。4周及8周时实验组髁突长轴与下颌平面的夹角均大于对照组。结论局部注射rAAV-IGF-I能够促进大鼠下颌骨长度及高度的增加,为治疗下颌发育不足提供了新的方法。

重组腺相关病毒(rAAV)介导的基因转染的遗传影响研究

目的:重组腺相关病毒载体(rAAV)是治疗遗传性疾病和慢性病最有前途的基因载体,本文研究重组腺相关病毒介导的基因转染的遗传效应。方法:将成年的2月龄雄性昆明小鼠分为三组,分别自尾静脉注入rAAV-D(+)-HK、rAAV-D(+)-GFP病毒颗粒和生理盐水,两周后将其以1:1的比例与成年的雌性昆明小鼠合笼。观察各组小鼠在一周内的受孕率、各组产仔情况、第一代及其子代的主要脏器组织形态学特性、HK基因在第一代及其子代的表达情况,以及HK基因的整合情况等。结果:重组腺相关病毒对基因转染小鼠的受孕率、产仔情况无影响;重组腺相关病毒携带的目的基因可以在第一代和第二代小鼠中实现稳定表达,并可整合到第一代和第二代小鼠的基因组中,基因转染的第一代和第二代小鼠的主要脏器病理学检查均未见明显异常;重组腺相关病毒并未影响第二代小鼠的生长发育。结论:重组腺相关病毒载体可通过昆明小鼠的血-睾屏障,在第二代小鼠中实现稳定表达。且在第一代和第二代昆明小鼠中均未观测到明显的毒性反应。

不同途径导入rAAV-VEGF_(165)基因对大鼠缺血性脑保护的比较研究

目的比较不同途径(直接注射、脑脊液及静脉内)导入重组腺相关病毒介导的血管内皮细胞生长因子基因(recombinant adeno-associated virus mediated vascular endothelial growth factor165 gene,rAAV-VEGF165)治疗大鼠局灶性脑缺血的疗效,寻找出适合临床、安全、有效的基因导入方法。方法用线栓加环扎法建立SD大鼠大脑中动脉持续性闭塞(MCAO)模型。30只雄性SD大鼠随机分为直接注射组、脑脊液导入组、静脉导入组、MCAO组和假手术组,其中治疗组于术后24h内将rAAV-VEGF165基因从大鼠脑缺血边缘区、小脑延髓池或股静脉内注入。术后14d取脑,免疫组织化学染色检测脑缺血边缘区VEGF的表达和微血管的密度、HE染色观察脑组织坏死情况、4%TTC染色检测脑梗死体积。结果与单纯梗死组和假手术组相比较,治疗组脑缺血边缘区VEGF表达水平明显升高、微血管密度显著增高(P<0.01),脑组织坏死情况明显减轻,脑梗死体积明显缩小(P<0.05);其中以前2个指标在直接注射和脑脊液导入组比静脉导入组更为显著(P<0.05)。结论直接注射和脑脊液导入比静脉内导入rAAV-VEGF165基因转染到大鼠缺血脑组织的效果更优,而且通过脑脊液导入可能是较为合适有效的途径。