rAAV5阴离子交换层析工艺的开发

建立一种有效提高重组5型腺相关病毒(rAAV5)实心载体比率的阴离子交换层析的纯化方法。对亲和层析捕获的rAAV5样品,使用多种阴离子交换层析柱进行离子强度线性梯度洗脱,CIMmultus QA(CIMQ)层析柱能够有效分离不含目的基因组的病毒(病毒空颗粒)和含目的基因组的病毒(实心载体)。基于CIMQ层析柱,进行纯化缓冲液体系、紫外目标峰收集范围的优化。通过qPCR检测病毒基因组(Vg)含量计算回收率,高效液相色谱法(HPLC)或体积排阻色谱-多角度静态光散射技术(SEC-MALS)测定实心载体比率。使用Tris,Na_(2) HPO_(4),pH 8.0缓冲体系,洗脱时收集紫外吸收值UV_(260)/UV_(280)比值大于1的部分,收集的样品实心载体比率达到80.3%。成功建立一种简单方便的阴离子交换层析方法,能去除rAAV5样品中的病毒空颗粒,使实心载体比率达到基因治疗临床产品要求。

rAAV5基因组滴度测定的数字PCR方法研究

目的:建立并验证重组5型腺相关病毒(recombinant adeno-associated virus type 5,rAAV5)基因组滴度测定的数字PCR方法,并对微滴数字PCR方法和芯片数字PCR方法进行比较。方法:分别用不同浓度的SDS和EDTA前处理r AAV5样品,用微滴数字PCR测其基因组滴度,对病毒样品前处理试剂进行优化;在其他试验条件不变的情况下,分别设置微滴数字PCR的退火温度为60、58、54、52℃,以WPRE引物扩增,比较扩增效果,对数字PCR的退火温度进行优化;分别采用微滴数字PCR和芯片数字PCR测定rAAV5的基因组滴度并比较。结果:终浓度为1%SDS和62.5 mmol·L^(-1)EDTA按1∶1(v/v)的比例混合后前处理rAAV5,测定的基因组拷贝数较高,前处理液裂解效果较好;当退火温度为54℃时,微滴数字PCR中阳性微滴和阴性微滴分离效果最好,扩增特异性最强;2种测定结果的试验室内精密度和回收率接近,测定同一裂解样本的结果较为接近(在1个数量级)。结论:初步建立了数字PCR方法并验证,为后续的进一步验证奠定基础。

腺伴随病毒载体介导Kringle5-GFP基因在眼组织中的表达

目的:探寻腺伴随病毒载体介导Kringle5基因注入玻璃体腔后,在眼球组织中的分布规律,为基因治疗视网膜病变提供实验依据。方法:将已经构建包装好的rAAV-Kringle5-GFP,滴度为2.5×1012vg/mL10μL注入SD大鼠玻璃体腔后,分别在1,5,10,20,40,60,90d处死SD大鼠,在荧光显微镜下观察GFP在玻璃体、视网膜、脉络膜、虹膜等眼组织分布及表达情况。根据表达强度从无表达到强表达分别记为-,+,++,+++,++++。结果:在注射后第1d,玻璃体中有轻度表达,随着时间的推移表达缓慢增强,分布较广泛;在玻璃体注射后第5d视网膜有表达,分布范围从视盘到周边部视网膜组织均出现且随着时间的推移表达增强;在虹膜、脉络膜组织表达也有较强表达;甚至在角膜内皮及晶状体组织也有表达。结论:选用腺伴随病毒载体介导目的基因能够在视网膜组织和色素膜组织有较强表达,腺伴随病毒载体介导目的基因是治疗ROP视网膜新生血管较为理想的载体。

重组5型腺相关病毒基因组滴度测定用国家标准品的研制

目的研制重组5型腺相关病毒(recombinant type 5 adeno-associated virus,rAAV5)基因组滴度测定用国家标准品。方法对三质粒系统制备的rAAV5-GFP原液,按《中国药典》三部(2020版)相关要求进行鉴别、外观、pH、无菌、基因组滴度、纯度、感染滴度等检定,根据结果稀释、分装,制备成候选标准品;采用热加速试验对候选标准品进行稳定性考察;组织3家实验室,采用微滴式数字PCR(droplet digital PCR,ddPCR)法对候选标准品进行协作标定。结果候选标准品原液及候选标准品的各项检测指标均符合相关要求;在25、4、-20、-40、-80℃条件下,1、3、4、6个月基因组滴度均无明显下降;经3家实验室协作标定,候选标准品赋值为2.56×10^(12)copies/mL,95%置信区间为2.48×1012~2.64×10^(12)copies/mL。结论研制的rAAV5基因组滴度测定用国家标准品具有良好的稳定性,可用于rAAV5相关产品的质量评价。