牙龈卟啉菌外膜蛋白RagB的基因克隆、原核表达及其多克隆抗体的制备

目的:克隆牙龈卟啉菌外膜蛋白RagB基因、原核表达并制备牙龈卟啉菌外膜蛋白RagB多克隆抗体。方法:根据牙龈卟啉菌外膜蛋白RagB的DNA序列,设计特异性引物并经PCR扩增其基因。扩增产物经鉴定和测序分析后,与质粒pET-32a(+)重组形成pET-32a-ragB,继而转化大肠埃希菌。IPTG诱导重组蛋白的表达,再通过Ni-NTA亲和层析柱纯化后,用SDS-PAGE电泳和Western blot鉴定;获得的重组蛋白行常规家兔免疫,以制备多克隆抗体,并应用ELISA测定抗体效价。结果:PCR扩增获得编码区全长为1506bp可编码501个氨基酸的RagB基因,测序结果与GenBank公布的序列(AJ130872)完全一致;构建了pET-32a-ragB原核表达载体,获得了高表达的融合蛋白,SDS-PAGE电泳和Western blot表明具有较高的纯度;ELISA结果显示,特异性兔抗RagB的多克隆抗体效价为1×105。结论:在成功构建牙龈卟啉菌外膜蛋白RagB原核表达载体的基础上,高效表达及纯化了RagB融合蛋白,并制备了高效价的多克隆抗体。为进一步开展牙龈卟啉菌疫苗研究、建立牙龈卟啉菌感染的实验室诊断方法奠定了基础。

牙龈卟啉菌外膜蛋白ragB-GITRL真核共表达载体的构建及免疫原性研究

目的:构建牙龈卟啉菌外膜蛋白ragB和小鼠糖皮质激素诱导的肿瘤坏死因子受体的配体(mGITRL)真核共表达载体,在体内研究其免疫原性。方法:应用PCR扩增技术,从pMD18-T-ragB中获得ragB基因编码序列片段,克隆至真核共表达载体pIRES及pIRES-mGITRL。对重组质粒进行双酶切与测序鉴定后,以脂质体介导法转染至COS7细胞,通过Western blot检测其在COS7细胞中的表达。将成功构建的重组质粒免疫小鼠,应用ELISA法检测免疫后小鼠血清中抗RagB的水平。结果:PCR扩增目的基因,酶切和测序证实重组质粒pIRES-ragB及pIRES-ragB-mGITRL成功构建,Westernblot结果显示目的基因在COS7细胞及骨骼肌细胞中均过表达。小鼠血清中检测出高滴度的抗RagB的抗体。结论:pIRES-ragB-mGITRL表达载体的构建,为牙龈卟啉菌疫苗研究、预防和牙周炎治疗提供了实验依据。

细粒棘球蚴(CE)重组抗原B(rAgB)的制备及其免疫印迹检测的初步探讨

目的 :包虫病在我区发病率相当高 ,是牧区常见的一种人畜共患寄生虫病。目前国内 ,用血清学方法诊断细粒棘球蚴病所用抗原 B均为自然抗原 ,自然抗原必需从患病动物脏器的囊液内提取 ,其不仅获得途径困难、数量有限 ,而且容易污染环境并且所获抗原成分不纯。因此 ,人工合成 r Ag B并应用于临床检测具有深远意义。方法 :( 1)构建重组体 :用基因工程的方法构建融合质粒 p Mal Ag B( r Ag B.MBP) ,p MAL - c2 X作为表达目的基因的载体 ,r Ag B.MBP为重组抗原 B及麦芽糖连接蛋白的基因 ,r Ag B基因序列为有意义片段 ,MBP基因是淀粉柱亲和纯化所必需的 ;再转染宿主菌 JM10 9,得到重组体 JM10 9- p Mal Ag B( r Ag B.MBP) ;( 2 )目的基因的诱导表达 :JM10 9-p Mal Ag B( r Ag B.MBP)接种于含氨苄青霉素和葡萄糖的 L B培养基中 37℃气浴振荡器内过夜培养 ,次日以 4%接种量转入含氨苄青霉素和葡萄糖的 L B培养基中 37℃气浴振荡器内培养至 OD60 0 为 0 .5～ 0 .7时 ,加 IPTG诱导 (终浓度为 0 .3m M) 3h,得到融合蛋白 ;( 3)采用亲合层析法纯化抗原 ,直链淀粉树脂作为亲和柱子填充料 ;( 4)免疫印迹 Western- Blot法检测血清。结果 :( 1)经过诱导表达、纯化 ,获得了人工合成的具有生物活性的蛋白质 - r Ag B;( 2 )

细粒棘球蚴重组抗原B 8-kDa亚单位1对囊型包虫病的血清学诊断价值

目的通过基因工程技术获得细粒棘球蚴抗原B8-kDa亚单位1重组蛋白(rEgAgB8/1),探讨其对囊型包虫病(CE)的血清学诊断价值。方法将构建的rEgAgB8/1原核表达质粒(pET32b-rEgAgB8/1)转化至E.coli BL-21(DE3)中,用IPTG诱导表达,经亲和层析纯化获得高纯度rEgAgB8/1,以rEgAgB8/1为抗原,应用ELISA和Immuno blotting方法对31例手术确诊的囊型包虫病病人血清进行了回顾性检测与分析。结果ELISA和Immuno blotting方法检测CE病人血清阳性率均为90.3%(28/31),3例血清学检测阴性的CE病人均为初次诊断为CE及单纯性肝脏单发感染的病人;血清抗体水平随着病人棘球蚴囊数目增加而有所增加,棘球蚴囊的数目与血清抗体水平的比较用单因素方差分析有显著性差异(F=5.06,P=0.0142),1个囊与2个囊/3个囊组间血清抗体水平有显著差异,2个囊与3个囊组间差异无统计学意义。结论rEgAgB8/1重组蛋白抗原对囊型包虫病有较高的血清学诊断价值,多囊型包虫病人血清抗体水平高于单囊型包虫病人。

细粒棘球蚴重组抗原B的表达提取及其血清学检测初探

用基因工程技术制备出的细粒棘球绦虫重组抗原 B( r Ag B)表达载体 ,经诱导表达、亲和层析纯化获得具生物活性的重组蛋白质 r Ag B,用 Western- Blot法检测病人血清。结果显示 r Ag B敏感性为 91.6% ( 4 4/48) ,特异性为 93 .8% ( 3 0 /3 2 ) ,其中 10例泡球蚴 ( AE)病人及 10例肿瘤病人血清均无交叉反应。说明 r Ag B具有较高的敏感性及特异性 ,可用于包虫病的常规血清学诊断 ,r Ag B在宿主菌 JM10 9内稳定表达 ,因此可在实验室内大量制备用于血清学诊断的 r Ag B。