结核分枝杆菌重组Bb-MPT64疫苗的构建、鉴定及表达

目的:构建和鉴定结核分枝杆菌重组双歧杆菌(Bifidobacteria bifidum,Bb)-MPT64疫苗。方法:以结核分枝杆菌H37Rv标准株基因组DNA为模板,通过PCR扩增得到MPT64抗原编码基因序列,定向克隆入大肠埃希菌-双歧杆菌穿梭表达载体pGEX-1λT中,构建重组质粒pGEX-MPT64;用电穿孔法将该质粒导入Bb及BL21(DE3),构建结核分枝杆菌重组双歧杆菌-MPT64疫苗。用IPTG诱导重组BL21(DE3)菌表达MPT64/GST融合蛋白;SDS-PAGE及Westernblot对表达产物进行鉴定。结果:PCR成功扩增出688bp的MPT64目的基因;双酶切证实MPT64目的基因成功插入pGEX-1λT中;PCR证实rBb-MPT64疫苗构建成功。免疫印迹分析发现重组质粒pGEX-MPT64的表达产物在相对分子量(50ku)处有明显的蛋白表达条带,且能被活动性结核病人血清特异识别。结论:成功构建了结核分枝杆菌rBb-MPT64疫苗,为发展新型结核病疫苗奠定了基础。

结核分枝杆菌Ag85B-MPT64融合基因疫苗的免疫效果观察

目的:研究并比较结核分枝杆菌(H37Rv)Ag85B、MPT64DNA.以及两者的融合基因(AM)的免疫原性。方法:雌性C57BL/6小鼠25只,随机分为5组,即A组(PBS)、B组(peDNA3.1)、C组(pcDNA/Ag85B)、D组(pcDNA/MPT64)和E组(pcDNA/AM)。分别于胫前肌注射7.5 g/L利多卡因和质粒混合物(1:4,100μL,含质粒70μg/次),间隔2 wk免疫 1次,共3次。末次免疫后4 wk取血分离血清测定总IgG,同时分离脾淋巴细胞,用PPD刺激后分别做脾淋巴细胞增殖实验(MTT比色法)和测定脾淋巴细胞培养上清中IFN-γ的水平。结果:Ag85B、MPT64和AM质粒DNA,均能诱导小鼠产生较高水平的PPD特异性IgG。免疫小鼠脾淋巴细胞体外经PPD刺激后,能产生特异性淋巴细胞增殖和分泌IFN-γ。peDNA/AM组IFN-γ的分泌水平明显高于pcDNA/Ag85B和pcDNA/MPT64免疫组(P<0.05)。结论:结核分枝杆菌Ag85B-MPT64融合基因疫苗,能在小鼠体内诱导特异性细胞和体液免疫。

结核分枝杆菌Ag85B和MPT64基因疫苗的免疫原性比较

目的 :研究并比较结核分枝杆菌 (H37Rv)Ag85B和MPT6 4DNA疫苗免疫学特性 .方法 :雌性C5 7/6小鼠 2 0只 ,随机分为 4组 .A组 (PBS)、B组 (pcDNA3.1)、C组 (pcDNA/Ag85B)、D组 (pcDNA/MPT6 4 ) ;分别于胫前肌注射 7.5g·L-1利多卡因和质粒混合物 (1∶4 ,5 0 μL) ,含质粒 70 μg/次 ,末次免疫后 4wk收集血清测总IgG ,分离脾淋巴细胞用PPD刺激后分别作脾淋巴细胞增殖实验 (MTT法 )和测上清中IFN γ 含量 .结果 :Ag85B和MPT6 4基因疫苗均能诱导小鼠产生特异性的IgG(平均滴度为 1∶80和 1∶6 0 )、脾淋巴细胞增殖 (比值≥ 2 )和IFN γ 的分泌 (Ag85B 176 2ng·L-1;MPT6 4 15 2 3ng·L-1) ,其淋巴细胞增殖和IFN γ 的分泌水平 ,Ag85B优于MPT6 4 .结论 :Ag85B和MPT6 4DNA疫苗均能诱导小鼠产生特异性细胞免疫和体液免疫 .

结核分支杆菌MPT64 DNA疫苗的纯化及免疫效果

目的：研究结核分支杆菌 MPT64 DNA 疫苗经肌肉注射免疫小鼠的效果。方法：通过 Qiagen 质粒纯化试剂盒纯化质粒 DNA；将 25 只 BALB/c 小鼠随机分为四组，生理盐水组、载体质粒组和重组质粒组于第 0 周、第 3 周、第 6 周经肌肉注射免疫小鼠各 1 次，卡介苗组只在 0 周时于皮内注射卡介苗 1 次；通过 ELISA 方法检测小鼠血清中抗 MPT64 抗体。结果：纯化后的 JW4303 和 JW4303-MPT64 质粒 DNA 经电泳证实无 RNA 污染，OD260/OD280大于 1.8，每 2 000 ml 培养菌可获得 2 mg 左右的质粒 DNA。以三个对照组 15 只小鼠的血清抗 MPT64 抗体 OD值x＋2s为正常界限值，免疫 4 周时重组质粒组 10 只小鼠中只有 4 只血清中抗 MPT64 抗体阳性；免疫 7 周时有 5 只小鼠抗体阳性，抗体水平较前略微增高。结论：结核分支杆菌 MPT64 DNA 疫苗经肌肉注射免疫小鼠只能诱导部分小鼠产生特异的体液免疫应答，免疫效果存在明显的个体差异。

预防性MPT64和ESAT6疫苗保护力的评价

目的利用BACTEC-960仪分析动物试验模型主要脏器的结核分枝杆菌生长情况,分析结核分枝杆菌MPT64和ESAT6 DNA疫苗预防结核病的效力。方法将BALB/C小鼠随机分成五组,分别用A组生理盐水、B组载体质粒、C组卡介苗、D组重组质粒JW4303-MPT64DNA、E组JW4303-ESAT6DNA免疫9周后,用H37RV结核分枝杆菌强毒株攻击小鼠。分别在攻击一个月后和二个月后观察结果。结果 C、D、E组比B组生长天数总体向后推迟,生长时间明显集中,生长曲峰强度比B组明显减弱,C组肝脏中的感染率比D、E组有所下降。D组肺脏中感染率下降明显。D、E组鼠脾淋巴细胞转化率较C组高,B组明显降低。结论与B组比,小鼠免疫力的短期预防是有所增强,其中卡介苗前期效果明显;MPT64、ESAT6是持续效果好。

遍在蛋白质-结核MPT64融合基因DNA疫苗的构建及免疫效应

目的:用遍在蛋白质调节结核杆菌单一抗原DNA疫苗,以期获得更强的免疫保护。方法:构建结核杆菌MPT64抗原DNA疫苗(pM)和遍在蛋白质基因与MPT64抗原基因融合的DNA疫苗(pUM)。分别将构建的两种DNA疫苗肌内注射免疫BALB/c雌性小鼠,检测小鼠的血清抗体(IgG、IgG1、IgG2a)、细胞因子(IFN-γ、IL-4)和细胞毒性T淋巴细胞(CTL)反应,比较融合基因DNA疫苗和单基因DNA疫苗诱导的免疫应答强度。结果:pM组小鼠血清IgG水平高于pUM组(P<0.01),但IgG2a/IgG1比值低于pUM组(P<0.05)。与pM组相比,pUM组小鼠IFN-γ分泌水平增高(P<0.01),IL-4分泌水平下降(P<0.01);pUM组的CTL活性高于pM组。提示融合基因DNA疫苗诱导的抗原特异性体液免疫应答不及单基因DNA疫苗,但其能诱导更强的细胞免疫应答。结论:遍在蛋白质-MPT64融合基因DNA疫苗对于防治结核病可能比单基因DNA疫苗更为有效。

结核分支杆菌MPT64 DNA疫苗研究进展

结核分支杆菌引起的结核病是一种人、兽共患的慢性传染病,短程督导化疗是治疗该病的主要措施,卡介苗是预防该病的唯一疫苗,但其免疫效果极不稳定。现介绍结核分支杆菌MPT64DNA疫苗构建及其免疫机制等方面的研究进展。

MPT64 DNA疫苗对鼠结核分枝杆菌感染的保护作用

目的 :研究MPT6 4DNA疫苗对鼠结核杆菌感染的免疫保护效果 .方法 :C5 7BL/ 6小鼠 36只 ,随机分为 4组 .A组 (PBS)、B组 (pcDNA3.1)、C组 (BCG )、D组 (pcDNA/MPT6 4 ) ;分别于胫前肌注射质粒DNA免疫 ,70 μg/次 ,1次 /2wk ,共 3次 .末次免疫后 5wk用 10 6CFUH37Rv经尾静脉攻击 ,攻击后 6wk处死小鼠 ,测血清总IgG ,特异性脾淋巴细胞增殖实验、IFN γ 及IL 4分泌水平 .作脾、肺组织荷菌量和病理学检查以及观察小鼠存活时间 .结果 :MPT6 4基因疫苗诱导小鼠特异性IgG的产生、脾淋巴细胞增殖以及IFN γ 的分泌 .MPT6 4DNA免疫组肺、脾组织荷菌量 ,病理学改变和小鼠存活时间明显优于阴性对照组 .结论 :MPT6 4DNA疫苗在抗结核分枝杆菌 (Mtb)感染过程中具有一定免疫保护作用 .

结核分枝杆菌MPT64-ESAT6融合蛋白在小鼠体内诱导的免疫应答及其保护力

目的:测定MPT64与ESAT6融合蛋白在小鼠体内诱导的免疫应答及保护力.方法:将MPT64与ESAT6的融合蛋白皮下免疫小鼠3次,每次间隔2wk,ELISA测定免疫小鼠血清特异性抗体的滴度.最后一次免疫完成后4wk,分离部分免疫小鼠脾淋巴细胞,MTT法检测淋巴细胞刺激指数,ELISA检测悬液中IFNγ水平.另一部分免疫的BALB/c小鼠经尾静脉感染MTB毒株H37Rv,4wk后计数脾脏细菌负荷数.结果:MPT64ESAT6融合蛋白免疫小鼠血清特异性抗体滴度1∶1500,免疫小鼠后淋巴细胞刺激增殖指数为2.23,而生理盐水免疫组只有0.88;脾淋巴细胞悬液中诱发的IFNγ为(4.28±0.27)μg/L,显著高于生理盐水免疫组[(0.48±0.17)μg/L,P<0.05],但不及BCG免疫组[(5.18±0.31)μg/L].与生理盐水免疫组(细菌负荷6.45±0.17)相比较,融合蛋白免疫的小鼠,对攻击感染后抗MTB在脾脏中增殖有显著作用,细菌负荷为5.04±0.11,但与BCG免疫组相比脾脏细菌负荷减少甚微(细菌负荷4.38±0.22).结论:MPT64与ESAT6融合蛋白可作为新型结核疫苗的候选组分.

结核分支杆菌MPT64质粒DNA的免疫原性和保护效力

目的 研究结核分支杆菌 (Mycobacteriumtuberculosis,MTB)MPT64质粒DNA的免疫原性和保护效力。方法 分别用生理盐水 (A)、载体质粒 (B)、卡介苗 (C)和MPT64重组质粒 (D)免疫小鼠 ,通过ELISA方法检测小鼠血清中抗MPT64抗体 ,免疫 8周后以MTB腹腔内攻击小鼠 ,攻击 4或 9周后 ,分别取肺、肝和脾脏观察病理改变、称取重量、作菌落计数及脾淋巴细胞转化试验。结果 D组1 0只小鼠中只有 4只血清中检测出抗MPT64抗体。MTB攻击 4周后 ,D组鼠脾淋巴细胞转化率显著高于其它 3组 ,A、B、D组肺、肝和脾重量明显高于C组 ,A组脾菌落数较其它 3组明显增多 ,其余脏器菌落数各组无明显区别 ,A、B组可见肺部严重病变 ,C组未见明显病变 ,D组存在个体差异。MTB攻击 9周后 ,A、B组鼠脾淋巴细胞转化率较C组显著降低 ,D组显著增高 ,各组肺、肝和脾重量无显著差别 ,C组肝菌落数明显低于其它 3组 ,其余脏器各组间无显著差别 ,各组鼠肺表面均可见不同程度的病变。所有鼠肝、脾均未见明显病变。结论 MTBMPT64DNA疫苗经肌肉注射免疫小鼠能诱发特异的体液和细胞免疫应答 ,对小鼠抗MTB感染具有一定的免疫保护效力 。

结核分枝杆菌MPT64重组母牛分枝杆菌免疫学特性

目的:研究结核分枝杆菌MPT64重组母牛分枝杆菌疫苗免疫学特性。方法:用分泌表达MPT64的重组母牛分枝杆菌疫苗免疫BALB/c小鼠,ELISA法检测免疫小鼠的特异性抗体滴度和抗体亚类。分离免疫小鼠脾淋巴细胞,检测淋巴细胞增殖、IFN-γ和IL-12产生水平、CD4+细胞和CD8+细胞数、脾淋巴细胞特异性CTL杀伤效应。毒株攻击后对脾脏细菌负荷计数。结果:MPT64重组母牛分枝杆菌疫苗免疫可诱导小鼠高水平的体液免疫应答,免疫小鼠脾淋巴增殖明显,IFN-γ和IL-12含量增加,CD4+和CD8+细胞百分比明显增加,CTL杀伤效应明显,对MTBH37Rv攻击后有一定的保护作用。结论:MPT64重组母牛分枝杆菌疫苗可诱导小鼠有效的体液和细胞免疫应答,有可能作为新型TB疫苗候选。

利用转基因胡萝卜表达肺结核疫苗

利用转基因植物生产研制疫苗 ,不但可以改变传统的疫苗生产方式和接种手段 ,而且会大大降低疫苗的生产成本。以胡萝卜 (DaucuscarotaL .var.sativa)无菌幼苗的子叶和下胚轴为外植体 ,通过携带有 35S启动子驱动的结核杆菌 (Mycobacteriumtuberculosis (Zopf)LehmannetNeumann)分泌蛋白MPT6 4基因的根癌土壤杆菌 (Agrobacteriumtumefaciens (SmithetTownsend)Conn)LBA44 0 4的介导进行转化 ,在筛选培养基上诱导形成抗性愈伤组织 ,经胚状体发生途径分化得到抗性苗 ,植株移栽后生长情况正常。经PCR和Southern等方法鉴定 ,确认结核杆菌分泌蛋白MPT6 4基因已整合到胡萝卜的染色体中。Western检测结果表明 ,在转基因胡萝卜的蛋白质中含有MPT6 4分泌蛋白 ,为进一步研究利用转基因植物研制口服疫苗和防治肺结核的新型疫苗提供了新材料。

结核分枝杆菌三价DNA疫苗在奶牛体内诱导的免疫应答

【目的】研究结核分枝杆菌Ag85B、MPB64和MPT83抗原DNA疫苗在奶牛体内诱导的免疫应答。【方法】以PJW4303为载体,构建上述3种抗原基因的三价DNA疫苗,免疫6月龄荷斯坦奶牛3次。ELISA法检测免疫奶牛的特异性抗体滴度。利用双抗夹心ELISA定量测定免疫奶牛各月IFN-γ浓度。【结果】免疫前奶牛体内特异性抗体为阴性,1免2、免后抗体效价上升较缓,3免后抗体效价上升快。MPT83特异性抗体上升最快,抗体效价1∶3 200持续6个月;Ag85B特异性抗体效价1∶3 200持续2个月;MPT64特异性抗体效价较低。免疫奶牛中MPT83、Ag85B、MPT64三种蛋白诱导产生IFN-γ在3免后6个月到达最高,浓度分别为(1 098.95±165.03)(、711.45±110.43)(、355.06±72.76)pg/mL,阴性对照组PBS刺激IFN-γ浓度为(114.5±27.46)pg/mL。阴性对照与三种抗原相比,差异均极显著(P<0.01)。【结论】多价核酸疫苗能同时诱导机体产生细胞免疫应答和体液免疫应答,可能有利于增强疫苗对抗结核病的抗性。

Ag85B与MPT64DNA疫苗联合免疫对鼠结核分枝杆菌感染的保护作用

目的 研究Ag85B与MPT6 4DNA疫苗联合免疫对鼠结核分枝杆菌感染的免疫保护效果。方法 C5 7BL/ 6小鼠 5 4只 ,采用随机数字表法随机分为 6组 ,分别用磷酸盐缓冲液 (PBS)、pcDNA3 1(+)、卡介苗 (BCG)、pcDNA/Ag85B、pcDNA/MPT6 4、pcDNA/Ag85B +pcDNA/MPT6 4经肌肉注射法免疫小鼠 ,0、3、6周各 1次 ,即PBS组、pcDNA3 1组、BCG组、pcDNA/Ag85B组、pcDNA/MPT6 4组及pcDNA/Ag85B +pcDNA/MPT6 4组。BCG组只在 0周予皮内注射卡介苗 1次。末次免疫后第 5周用 1×10 6CFU的H3 7Rv经尾静脉实施攻击 ,攻击后 6周处死部分小鼠 ,用酶联免疫吸附测定 (ELISA)法检测血清总IgG、纯化蛋白衍生物 (PPD)特异性脾淋巴细胞干扰素γ(IFN γ)和白细胞介素 4 (IL 4 )分泌水平 ,四甲基偶氮唑盐 (MTT)法测定特异性脾淋巴细胞增殖 ;作脾、肺组织荷菌量和病理学检查 ,并观察小鼠存活时间。结果 PBS组肺和脾器官荷菌量分别为lg-1(7 85 4± 0 0 0 3)CFU/g和lg-1(7 190±0 0 16 )CFU/g、pcDNA3.1组分别为lg-1(7 70 0± 0 0 16 )CFU/g和lg-1(7 0 72± 0 0 6 8)CFU/g、BCG组分别为lg-1(6 4 4 9± 0 0 0 2 )CFU/g和lg-1(5 4 36± 0 0 4 2 )CFU/g、pcDNA/Ag85B组分别为lg-1(7 370± 0 0 0 2 )CFU/g和lg-1(6 4 2 96± 0 0 0 9)

结核分枝杆菌抗原MPT83和MPT64二价基因疫苗的研究

目的探讨结核杆菌两种抗原MPT83和MPT64基因疫苗的免疫原性和免疫保护性。方法用成对引物扩增MPT83和MPT64两种抗原基因,构建到同一载体pJW4303中,测序正确和体外表达验证后免疫小鼠,间接酶联免疫吸附试验(ELISA)方法测定3次免疫后小鼠的抗体滴度。对3次免疫后的小鼠脾细胞进行培养,抗原刺激,用夹心ELISA方法测定细胞因子IFN-γ和IL-4的含量。免疫小鼠攻毒,进行细菌培养,检测肺脏和脾脏的载菌量。结果每次免疫后抗原的滴度分别为1∶200、1∶800、1∶6400,而卡介苗(BCG)组的抗体滴度为1∶800,空载体组未检测到抗体滴度。融合的二价基因疫苗免疫小鼠,主要诱发Th1型细胞因子,IFN-γ占优势,二价组中的含量为7520pg/ml,IL-4的含量仅为ng级。H37Rv攻毒后,二价组小鼠的肺脏载菌量为(2.21±0.03)×105,比空载体免疫小鼠低103倍,比BCG免疫小鼠低10倍。结论抗原MPT83和MPT64二价基因疫苗有效提高了机体保护效力,对于结核病的防治具有一定的借鉴价值。