以rCFP10-ESAT6融合蛋白为抗原的ELISA法鉴别Mtb和BCG致敏豚鼠的实验研究

目的以rCFP10-ESAT6融合蛋白为抗原，用ELISA法评价其对Mtb和BCG致敏豚鼠的鉴别意义。方法分剐用灭活H37Rv和BEG活菌致敏豚鼠，4周后，以rCFP10-ESAT6及PPD为包被抗原，用ELISA法检测每组豚鼠血清中的结核菌IgG抗体。结果以10只NS对照豚鼠OD490＋2s为正常界限值，rCFP10-ESAT6检测Mtb致敏豚鼠的特异性和敏感性分别为95．24％（20／21）、100％（11／11），PPD检测Mtb致敏脬鼠的特异性和敏感性分别为47．62％（10／21）、100％（11／11），以rCFP10-ESAT6为抗原的阳性值（1．563±0．490）与阴性值（0．166±0．085）的差异比PPD为抗原的阳性值（0．629±0．117）与阴性值（0．206±0．053）的差异更显著。结论以rCFP10-ESAT6为包被抗原的ELISA法能特异区分豚鼠因H37Rv致敏和BCG免疫后产生的抗结核菌抗体。

结核分枝杆菌CFP10-ESAT6重组融合蛋白抗原血清学诊断价值

目的研究重组CFP10-ESAT6蛋白的抗原性,评价其在结核病血清学诊断中的价值,探寻更有效的结核病诊断试剂。方法应用基因工程技术表达、纯化rCFP10-ESAT6蛋白,通过酶联免疫吸附试验检测192例健康者和210例结核病患者血清与纯化rCFP10-ESAT6的抗体反应。结果 rCFP10-ESAT6蛋白在大肠埃希菌细胞内以包涵体形式高效表达,表达量约占菌体总蛋白的25%,分子量约为28 kD,具有良好的抗原特异性。在210例结核病患者血清中,103例菌阳患者和107例菌阴患者抗rCFP10-ESAT6抗体的阳性率分别为30.10%(31/103)和28.97%(31/107),总的灵敏度为29.52%(62/210);在192例健康者血清中,95例PPD阴性者和97例PPD阳性者抗rCFP10-ESAT6抗体的阳性率分别为2.11%(2/95)和6.19%(6/97),总的特异性为95.83%(184/192)。结论 rCFP10-ESAT6蛋白可能成为结核病血清学诊断的组合抗原之一。

重组融合蛋白CFP10-ESAT6在结核病血清学诊断中的初步应用

目的探讨结核分枝杆菌重组融合蛋白CFP 10-ESAT 6用于结核病血清学诊断的价值。方法分别用CFP 10-ESAT 6、ESAT 6和PPD检测220例确诊的结核病患者血清、30例非结核病呼吸系统疾病患者血清和50例健康人血清。结果rCFP 10-ESAT 6、rESAT 6和PPD检测的敏感性分别为45%、25%和57%;特异性分别为93%、95%和75%。rCFP 10-ESAT 6的敏感性高于rESAT 6,特异性高于PPD(P<0.05)。结论rCFP 10-ESAT 6应用于结核病血清学诊断具有较好的敏感性和很高的特异性,对于结核病的诊断有很好的应用价值。

结核分枝杆菌cfp10-esat6融合基因原核表达载体的构建及表达

构建结核分枝杆菌cfp10-esat6融合基因及其原核表达载体,在大肠杆菌中表达融合蛋白CFP10-ESAT6。用基因拼接(GeneSOEing)法扩增cfp10-esat6融合基因,并将其定向克隆至原核表达载体pGEX-4T-1,构建原核表达重组质粒pGcfp10-esat6。重组子经限制性内切酶分析、聚合酶链式反应及测序鉴定后转化宿主菌大肠杆菌BL21,IPTG(isopropy-β-D-thiogalactoside,异丙基硫代-β-D半乳糖苷)诱导表达约42kDa带谷胱苷肽硫转移酶(Glutathione-S-TransferasesGST)蛋白标签的rCFP10-ESAT6融合蛋白,经谷胱苷肽硫转移酶融合蛋白纯化试剂盒得到纯化的融合蛋白,产物进行SDS-PAGE电泳、Western-blot鉴定。重组质粒pGcfp10-esat6中目的基因测序结果与报道序列相同;在大肠杆菌中以可溶性非包涵体形式表达;表达量约占菌体总蛋白的40%,表达蛋白纯化后获得纯度为90%左右的重组蛋白;Western印迹结果证实重组蛋白与确诊的结核病患者血清发生特异免疫反应。本研究成功构建了原核表达载体pGcfp10-esat6,获得了rCFP10-ESAT6融合蛋白,为rCFP10-ESAT6融合蛋白在结核病诊断中的应用奠定了基础。

结核分枝杆菌rCFP10—ESAT6融合蛋白诱发豚鼠迟发型超敏反应的实验研究

目的探讨以rCFP10-ESAT6融合蛋白为抗原用皮试法评价其对结核分枝杆菌（Mtb）和卡介苗（BCG）致敏豚鼠的鉴别意义。 方法分别用灭活H37Rv和BCG活菌致敏豚鼠．4wk后用不同剂量的rCFP10—ESAT6对同一只豚鼠作皮试，同时设立5IU结核菌素纯蛋白衍生物（PPD）阳性对照及生理盐水（NS）阴性对照，于注射后24、48、72h测量红肿或硬结的直径。 结果以rCFP10-ESAT6为抗原的皮肤试验检测Mtb致敏豚鼠的特异性和敏感性分别为100．0％（21／21）、90．9％（10／11），以PPD为抗原的皮肤试验检测Mtb致敏豚鼠的特异性和敏感性分别为47．6％（10／21）、90．9％（10／11），以rCFP10-ESAT6为抗原的迟发型超敏反应（DTH）中，以1．0μg剂量效果最好．观察时间以皮试后24h效果最好，1．0μg重组融合蛋白在Mtb致敏豚鼠上引发的红肿、硬结比5IU PPD引发的红肿、硬结大。 结论rCFP10-ESAT6能诱导Mtb致敏豚鼠发生DTH，能特异区分Mtb致敏豚鼠及BCG免疫豚鼠，抗原剂量及反应时间是rCFP10—ESAT6诱导豚鼠DTH的主要影响因素。

结核分枝杆菌CFP10-ESAT6融合蛋白的高效表达及免疫原性研究

目的高效表达结核分枝杆菌6kDa早期分泌性抗原靶(6kDaearlysecretoryantigenictarget,ESAT6)和培养滤液蛋白10(culturefiltrateprotein10,CFP10)的融合蛋白,通过免疫动物,获得CFP10-ESAT6融合蛋白的多克隆抗体。方法以结核分枝杆菌标准株H37Rv基因组DNA为模板,扩增cfp10-esat6融合基因,将其与表达质粒pET32a(+)构建成重组质粒pET-cfp10-esat6。在大肠杆菌BL21(DE3)中表达带组氨酸标签的融合蛋白,经亲和层析得到纯化CFP10-ESAT6蛋白。用该蛋白免疫成年家兔,获得的抗CFP10-ESAT6融合蛋白的多克隆抗体,作Western-blot和ELISA分析。结果重组质粒pET-cfp10-esat6构建成功,融合蛋白CFP10-ESAT6大量表达,多克隆抗体制备成功(1∶106)。结论成功构建并表达了CFP10-ESAT6融合蛋白,制备了大量的CFP10-ESAT6融合蛋白的多克隆抗体,为发展新型结核病疫苗和临床血清学检测奠定了实验基础。

结核分枝杆菌CFP10-ESAT6融合蛋白在大肠杆菌中的高效表达

目的 在大肠杆菌中高效融合表达结核分枝杆菌分泌蛋白ESAT 6和CFP 10 ,获得纯化的重组ESAT6 CFP10 (rCFP10 ESAT6 )融合蛋白抗原。方法 通过聚合酶链反应 (polymerasechainreaction ,PCR)扩增CFP10 ESAT6融合基因 ;以质粒pET 2 8a为表达载体 ,构建重组质粒 ,转化大肠杆菌BL2 1(DE3) ;以异丙基硫代半乳糖苷 (IPTG)诱导表达目的蛋白 ,通过SDS PAGE电泳和蛋白免疫印迹法 (Westernblotting)鉴定rCFP10 ESAT6在大肠杆菌中的表达 ,确定rCFP10 ESAT6蛋白抗原在大肠杆菌中的表达形式 ;采用ChelatingSepharoseFastFlow蛋白纯化试剂纯化重组蛋白。West ernblotting及酶联免疫吸附试验 (ELISA)分析重组蛋白的免疫原性。结果 重组质粒pET2 8a CFP10 ESAT6中目的基因测序结果与报道序列相同 ;在大肠杆菌中以可溶性形式表达 ;分子量约2 8kDa ,表达量约占菌体总蛋白的 4 6 % ,纯化后的rCFP10 ESAT6样品经SDS PAGE和激光密度扫描分析表明其纯度为 90 %左右 ,每 10 0ml培养菌可获得 16mg左右的重组蛋白 ;Western印迹结果证实重组蛋白与His·tag单克隆抗体及确诊的肺结核病患者血清发生特异免疫反应。ELISA结果分析表明 ,该重组抗原能区分肺结核患者血清及正常人血清。

结核分枝杆菌cfp10-esat6融合基因重组穿梭质粒的构建及其在BCG中的融合与分泌表达研究

通过SOE法(重叠延伸,Genesplicingbyoverlapextension),扩增cfp10-esat6融合基因,与穿梭整合质粒pMV361构建成重组质粒。另将BCGα抗原(α-Ag)信号肽序列与上述重组质粒构建成另一重组质粒。将两种重组质粒分别导入BCG菌构建融合型重组卡介苗和分泌型重组卡介苗,热诱导后分析其表达产物。本研究成功构建并表达了CFP10-ESAT6融合及分泌表达的重组BCG,为发展新型结核病疫苗打下了一定的基础。

结核分枝杆菌CFP10-ESAT6融合蛋白的克隆表达及效价测定

目的在大肠杆菌中表达结核分枝杆菌RD1区CFP10-ESAT6融合蛋白,测定融合蛋白对结核分枝杆菌致敏豚鼠的效价。方法以结核分枝杆菌标准株H37Rv为模板,采用Overlap PCR方法扩增CFP10-ESAT6融合基因,并克隆入pET-30a质粒,IPTG诱导工程菌表达融合蛋白,离子层析柱分离纯化融合蛋白。以结核分枝杆菌致敏豚鼠进行皮肤变态反应(DTH)测定。结果结核分枝杆菌融合蛋白在大肠杆菌中以可溶形式表达,融合蛋白占总菌体蛋白的30%以上,经离子层析柱纯化纯度达95%以上。重组蛋白可诱导结核分枝杆菌致敏豚鼠产生迟发型超敏反应,2.5μg/ml重组蛋白诱导豚鼠皮试反应与TB-PPD(50 IU/ml)等效。结论重组融合蛋白有望成为结核感染皮试诊断用新试剂。

CFP10-ESAT6融合蛋白用于结核分枝杆菌感染诊断ELISA方法的初步研究

目的制备结核分枝杆菌CFP10-ESAT6融合蛋白,探讨CFP10-ESAT6融合蛋白在结核分枝杆菌免疫诊断中的应用价值。方法 PCR扩增得到CFP-10、ESAT6基因片断,将其先后克隆入pET-28a表达载体。优化表达条件、用镍亲和层析的方法纯化带His标签的重组CFP10-ESAT6融合蛋白(rCFP10-ESAT6)。制备兔多克隆抗体,建立rCFP10-ESAT6为抗原的酶联免疫吸附试验(ELISA)方法,以健康者血清为对照,检测170例结核患者血清的抗体。结果重组质粒pET28a-CFP10-ESAT6靶基因测序结果与预计设计完全一致。融合蛋白在E.coli BL21(DE3)工程菌中均为可溶性表达,表达量占菌体总蛋白的40%。利用金属螯合亲和层析直接纯化重组蛋白,纯度达到95%以上。Western blot分析表明,重组蛋白能与结核患者血清发生特异性免疫结合反应,与健康者血清不发生反应。CFP10-ESAT6的兔多克隆抗体的效价为1∶8 000,CFP10-ESAT6作为包被抗原的检测结核病人血清中特异性抗体的间接ELISA最佳包被浓度为0.002μg/mL,患者血清的最佳稀释度为1∶500。检测结果与临床诊断的符合率,ELISPOT>ELISA(rCFP10-ESAT6)>ELISA(kit)。结论CFP10-ESAT6融合蛋白具有较高的抗原特异性和免疫反应性,有可能成为结核病免疫学诊断的特异抗原,对结核的诊断具有重要参考价值。

筛选结核分枝杆菌CFP10-ESAT6蛋白适配子的研究

目的通过SELEX技术筛选出结核分枝杆菌CFP10-ESAT6蛋白的高亲和性适配子。方法构建一个78碱基的ssDNA文库,利用SELEX技术筛选获得CFP10-ESAT6的适配子。用DNAMAN软件对其结构进行分析,酶联寡核苷酸吸附试验(ELOSA)测定亲和力。结果经过15轮筛选,ssDNA文库与CFP10-ESAT6亲和力从0.305提高到1.356。二级结构显示,口袋和茎环结构可能是适配子与CFP10-ESAT6结合的结构基础。结论初步获得了CFP10-ESAT6的高亲和性适配子,为开发结核病诊断和治疗试剂奠定了基础。

牛分枝杆菌CFP10-ESAT6融合基因的表达纯化

为了提高牛分枝杆菌单一抗原的抗原性,试验采用重叠延伸剪接技术(SOE)将CFP10和ESAT6基因通过(Gly4Ser)3接头连接,得到融合基因CFP10-ESAT6;将其克隆入pGEX-6P-1质粒,构建重组质粒pGEX-6P-1-CFP10-ESAT6;用重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,经IPTG诱导和SDS-PAGE分析,可见相应外援蛋白带;最后应用Western-blot检测融合基因。结果表明:试验成功构建携带牛分枝杆菌CFP10-ESAT6融合基因的重组质粒,其表达的融合蛋白具有牛分枝杆菌抗原性。说明CFP10-ESAT6融合蛋白可用于牛结核病感染和免疫抗体的检测,具有良好的开发和应用前景。

结核分枝杆菌Rv3425特异性蛋白片段与CFP10-ESAT6融合蛋白在结核抗体检测中的应用价值

目的:对结核分枝杆菌Rv3425蛋白进行生物信息学分析及抗原表位预测,评价Rv342519-176重组蛋白与CFP10-ESAT6融合蛋白在结核抗体检测中的应用。方法:PCR扩增结核杆菌Rv3425蛋白19～176位的编码基因片段,原核表达并纯化Rv342519-176重组蛋白(rRv342519-176)和CFP10-ESAT6融合蛋白(rCFP10-ESAT6),建立以重组蛋白为抗原的ELISA方法,评价2种蛋白在结核抗体检测中的联合应用价值。结果:具有抗原表位的rRv342519-176与rCFP10-ESAT6在大肠杆菌中高效表达;ELISA结果显示,rRv342519-176的敏感性为39%,特异性为97.5%;rCFP10-ESAT6的敏感性为37%,特异性为95%;2种蛋白联合检测,敏感性提高到57%,特异性为95%。结论:生物信息学预测Rv3425的优势抗原表位,表达并纯化的rRv342519-176和rCFP10-ESAT6在结核抗体检测中具有一定的抗原互补性,在保持特异性的基础上可显著提高检测敏感性。

牛分支杆菌MPB70和CFP10-ESAT6基因的表达与检测

以牛分支杆菌染色体DNA为模板,分别以MPB70、CFP10-ESAT6融合蛋白基因特异性引物进行PCR扩增,获得约600 bp的DNA片段,并将其克隆入PQE30质粒,构建出原核表达载体PQE30-MPB70,PQE30-CFP10-ESAT6。将质粒转化至感受态DH5α中,经IPTG诱导和SDS-PAGE分析,可见相应外源蛋白带。纯化蛋白后作为包被抗原建立ELISA方法,为进一步研究牛结核病诊断方法奠定基础。

利用rCFP-10/ESAT-6融合蛋白刺激γ-IFN体外释放测定替代结素皮试检出结核感染的可行性

评估rCFP-10/ESAT-6融合蛋白刺激γ-IFN体外释放测定与结素皮试检出结核感染的敏感性及特异性。对疑似结核病患者共229例进行随机、双盲、平行、对照、前瞻性试验,后经细菌培养证实患结核病的病人共129人,没有结核病史的非结核病患者共100人。以某一特定的γ-IFN体外释放水平及结素皮试反应硬结直径?10 mm为阳性切割值,rCFP-10/ESAT-6融合蛋白刺激γ-IFN体外释放测定的敏感性为96%,显著高于结素皮试(89%)(χ2=4.92;0.025<P<0.05),特异性(99%)亦显著高于结素皮试(65%)(χ2=32.03;P<0.005)。rCFP-10-/ESAT6融合蛋白刺激γ-IFN体外释放测定不受BCG接种史及非结核分枝杆菌的影响。本文证实利用rCFP-10/ESAT-6融合蛋白刺激γ-IFN体外释放测定替代结素皮试检出结核感染在一定条件下是可行的。

结核分枝杆菌CFP10-ESAT6融合蛋白对不同分枝杆菌致敏动物的鉴别作用

目的探讨结核分枝杆菌CFP10-ESAT6融合蛋白对不同分枝杆菌致敏动物的鉴别作用。方法以不同分枝杆菌分别致敏豚鼠,致敏成功后,每只豚鼠皮内分别注射结核分枝杆菌CFP10-ESAT6融合蛋白和结核菌素纯蛋白衍生物(PPD)。用双盲法记录注射后24和48h注射局部硬结的纵径和横径,计算其均值。结果PPD对结核分枝杆菌活菌、死菌和卡介苗致敏豚鼠的皮肤反应均为阳性,局部硬结直径分别为(13.91±1.04)mm、(13.11±1.40)mm和(13.16±1.43)mm。结核分枝杆菌CFP10-ESAT6融合蛋白对结核分枝杆菌活菌致敏豚鼠的皮肤反应为强阳性(≥10mm),局部硬结直径为(10.53±2.66)mm;对结核分枝杆菌死菌致敏豚鼠的皮肤反应为弱阳性(≤5mm)或阴性,局部硬结直径为(1.61±1.39)mm;对卡介苗致敏豚鼠的皮肤反应为阴性,局部硬结直径为0。结论结核分枝杆菌CFP10-ESAT6融合蛋白可鉴别结核分枝杆菌活菌、死菌和卡介苗致敏动物。

重组CFP10-ESAT6蛋白通过TLR信号介导A549细胞抗BCG感染

本研究旨在探究重组CFP10-ESAT6蛋白在结核分支杆菌(Mycobacterium tuberculosis,Mtb)感染肺泡上皮细胞过程中对肺泡上皮细胞TLR信号途径及其介导的炎症反应的影响。利用原核表达系统表达纯化Mtb重组蛋白CFP10-ESAT6,使用重组蛋白处理A549细胞,利用CCK-8试剂盒检测重组CFP10-ESAT6对细胞活性的影响;使用重组CFP10-ESAT6和减毒牛分支杆菌BCG处理细胞并设置相应组别,提取细胞总RNA和总蛋白,利用qRT-PCR技术、Western-blot及ELISA方法分别从转录和翻译水平检测A549细胞中TLR信号途径关键分子及其下游炎症因子的表达变化。结果显示,成功获得高纯度的重组CFP10-ESAT6,并且重组CFP10-ESAT6在一定浓度范围和处理时间条件下能够降低A549细胞的存活率。当BCG或重组CFP10-ESAT6单独处理A549细胞时,细胞中TLR2、TLR4、My D88、TRAF6和NF-κB p65及下游炎症因子IL-6和TNF-α的表达水平显著(P<0.05)或极显著(P<0.01)上调,重组CFP10-ESAT6与BCG共处理时,重组CFP10-ESAT6显著(P<0.05)降低了由BCG刺激所导致的TLR途径关键分子TLR2、TLR4、My D88、TRAF6、NF-κB p65、IL-6及TNF-α等炎症因子的表达水平。上述结果表明,重组CFP10-ESAT6可以减轻A549细胞在抗Mtb感染过程中由TLR信号介导的炎症因子的分泌,这将为进一步加深理解结核病发病机制提供理论依据。

重组CFP-10／ESAT-6抗原ELISA法对活动性肺结核诊断的评估

目的以rCFP-10／ESAT-6融合蛋白抗原、植物血凝素（PHA）、生理盐水分别处理活动性肺结核患者外周血致敏T淋巴细胞，测定同一标本IFN-γ释放水平，探讨其对结核感染与发病的诊断意义。方法病例组111例为临床确诊肺结核患者，对照组292例为经胸部透视和结核菌素试验（PPD）筛选的大学生。入选对象取血3．0ml，均分为3份，每管1．0ml，分别加入rCFP-10／ESAT-6融合蛋白、PHA和生理盐水，孵育后ELISA法测定IFN-γ的吸光度（A）值及其抗体。结果rCFP-10／ESAT-6融合蛋白处理：IFN-γ测定值病例组x=1．3885±0．6236，对照组x=0．2944±0．0917，组间t′=16．4259，P〈0．05；以0．42为切割值，病例组阳性率93．58％，对照组阳性率13．07％。PHA处理：病例组x=1．2463±0．5541，对照组x=0．5613±0．0640，t′=19．1797，P〈0．05。生理盐水处理：病例组x=0．0772±0．0444，对照组x=0．0290±0．0235，t′=13．9487，P〈0．05。病例组抗体阳性率66．36％，对照组7．19％。结论利用rCFP-10／ESAT-6融合蛋白为特异性抗原，ELISA法测定外周血致敏淋巴细胞IFN-γ释放水平对结核感染诊断的敏感性〉90％，且无论特异性或非特异性处理，活动性肺结核患者IFN-γ释放水平均明显升高，血清抗体阳性率也高于对照组。

结核分支杆菌核酸适配体研究进展

结核分支杆菌(MTB)是引起多种宿主感染结核病的重要病原菌,由于结核分支杆菌耐药菌株的产生,导致结核病在世界范围内呈高发趋势。由于MTB检出率较低,开发一种简单快速的诊断方法迫在眉睫。指数富集配体系统进化技术(SELEX)的原理是从随机寡核苷酸文库中筛选到能特异性结合靶物质的寡核苷酸配体(称为适配体)。论文对近几年国内外通过SELEX技术对结核分支杆菌筛选出的适配体做一综述,适配体的靶物质分别为分泌蛋白MPT64,CFP10-ESAT6蛋白,多磷酸激酶2(PPK2)以及结核分支杆菌(H37Rv株)整个菌体。体外筛选的结核分支杆菌适配体,能对结核病做出早期诊断,并能作为MTB疫苗的免疫佐剂,在临床诊断及药物研究等方面有很大应用前景。