松材线虫rDNA-ITS2的Taq Man探针实时荧光PCR检测

以松材线虫rDNA -ITS2为靶区 ,建立松材线虫的TaqMan探针实时荧光PCR检测方法。对松材线虫大量DNA和单条线虫的检测结果表明 ,探针检测松材线虫和拟松材线虫时 ,前者产生明显的荧光信号 ,后者无荧光信号 ,表明探针具有高度的特异性 ;探针检测到最低模板浓度为 1pg·μL- 1 。

rDNA探针杂交检测病人痰标本中结核杆菌的研究

应用结核分枝杆菌特异的rDNA探针杂交检测痰标本中的结核杆菌rDNA ,评价其在临床标本检测中的应用价值。方法 用引物b对结核分枝杆菌 1 6S - 2 3SrDNA间隔区序列进行扩增 ,同时加入生物素标记 ,制成 2 50bp的rDNA探针。对该探针的敏感性、特异性进行了研究 ,并对 90份结核病人 ,30份非结核病人痰标本的PCR产物进行了斑点杂交检测。结果 rDNA探针检测引物bPCR扩增产物的敏感性为 1 0 0pg。rDNA探针与受试 2 4种分枝杆菌和 1 1种非分枝杆菌引物bPCR扩增产物杂交只有结核分枝杆菌、胃分枝杆菌为阳性杂交 ,特异性较高。而rDNA探针对 90份结核病人痰标本引物b扩增产物检测的阳性率为 80 .2 % ,高于PCR扩增产物电泳检测结果 (64% )。rDNA探针与 30份非结核病人痰标本杂交结果均为阴性杂交。结论 rDNA探针与引物bPCR扩增相结合能提高结核病人痰标本检测的敏感性与特异性。

锥虫Ls-rRNA序列分析与锥虫rDNA探针群

用大分子ＲＮＡ快速测序法测定刚果锥虫（Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａｃｏｎｇｏｌｅｎｓｅ）ＬｓｒＲＮＡ５′端６９４个核苷酸序列．比较分析揭示伊氏锥虫、布氏锥虫和刚果锥虫之间以及它们与其它鞭毛虫和哺乳动物宿主的分子差异；表明ＬｓｒＲＮＡ高变区可以作为一个灵敏的分子指标研究锥虫属内的系统进化关系；并为研制属、种不同专一性的锥虫ｒＤＮＡ探针奠定了基础．人工合成锥虫亚属ｒＤＮＡ探针Ｄ１ｔｅ与ＰＣＲ方法联用，可以检测相当于单个伊氏锥虫的微量ＤＮＡ．

玉米细菌性枯萎病菌16S rDNA基因克隆及TaqMan探针实时荧光PCR

为给农业和植物检疫部门提供一种特异性强、灵敏度高,可以快速、直接检测植物病原菌的方法,将玉米细菌性枯萎病菌16SrDNA基因克隆测序,根据该细菌与其他细菌菌株16SrDNA序列差异,设计出对玉米细菌性枯萎病菌具有稳定点突变的特异性探针,除泛菌属3个种和欧氏菌属3个种外,还对假单胞菌属1个种,黄单胞菌属1个种,棒形杆菌属1个种,短小杆菌属1个种以及5种植原体进行了实时荧光PCR检测.结果表明:只有玉米细菌性枯萎病菌产生荧光,其他细菌和植原体都没有荧光产生.检测的灵敏度为104CFU/mL的菌悬浮液,相当于4个细菌细胞的基因,灵敏度高,也就是说,反应体系中只要有2个活细菌,实时荧光PCR就能检测到.相对灵敏度为107CFU/mL,而且整个检测过程只需2h,由于实验采用独特全封闭反应管及光电传导系统,不用凝胶电泳,降低了污染.

细菌种特异性的16SrDNA寡核苷酸探针数据库的初步构建

核酸二级数据库是生物信息学研究的重要领域 ,对生命科学的研究和发展起重要作用 .目前 ,国际核酸序列公共数据库中存在大量的细菌 16SrDNA序列 ,本文利用这些已知细菌的 16SrDNA序列 ,设计了细菌种特异性的寡核苷酸探针 ,将其结果存入二级数据库 ,以计算机网络为载体 ,开发了界面友好的通过WWW浏览器实现对数据库查询的系统 ,其查询结果形象直观 ,为设计细菌的种特异性寡核苷酸探针提供了参考和帮助 ,从而可加速对细菌分类及鉴定的进程 .

三株霍乱弧菌16s rDNA指纹图谱分析

目的 探讨我国新疆分离O13 9群霍乱弧菌的基因组特征。方法 自行设计引物 ,利用PCR掺入法用地高辛标记的16srDNA基因探针 ,分别对二株VCO13 9霍乱弧菌 (新疆分离株XJ93 0 0 6、国际标准株MO45 )及一株ElTor菌株 (新疆分离株 890 79)的基因组DNA的BglⅠ、PvuⅠ酶切产物进行southern杂交。结果 杂交结果显示此三株霍乱的杂交图谱均不同。结论 我国新疆的O13 9霍乱既不同于本地的ElTor霍乱 。

赤潮异弯藻和海洋原甲藻LSU rDNA扩增及序列分析

利用引物 D1R和 D2 C扩增并测定了赤潮异弯藻 (H eterosigma akashiwo Hada)和海洋原甲藻 (Prorocentrum micans Ehrenberg)的 L SU r DNA D1与 D2序列 ,并与 Gen Bank中相关序列进行比较分析。结果表明 :在种内水平 ,所测的 H .akashiwo 6个株系之间共有 5个变异位点 ,序列H.k与 H.k- 2 ,H.k- 4均存在碱基替换 ;原甲藻属不同种内各株系之间的遗传距离为 0 .0 0 2～0 .0 2 3之间 ,所测序列 P.mi与 P.micans其他株系之间均存在碱基替换。在种间水平上 ,原甲藻属不同种之间的遗传距离在 0 .0 4 5～ 0 .139之间 ,大于种内遗传距离 ,每个种都具有特定的保守序列。根据序列间的遗传变异 ,可设计特异性的探针对不同株系和物种进行检测和计数。

烟草18S rDNA染色体原位杂交技术优化研究

荧光原位杂交(Fluorescence in situ hybridization,FISH)在细胞遗传学中有较多应用,其中重复序列常被作为探针来研究物种进化、分类。但现常用的探针序列均较长(200 bp-500 bp),杂交耗时较多。本研究以烟草(Nictiana tabacum)为材料,克隆并标记18S rDNA保守序列(254 bp),以其为探针对烟草染色体进行FISH,经18 h杂交获得了清晰的信号。在此基础上,利用荧光素直接标记引物序列(寡聚核苷酸),经较短时间(2 h)的杂交,也获得了清晰的信号。以寡聚核苷酸为探针对云烟87四倍体、N. tabacum-N. plumbaginifolia五倍体、烟草六倍体、云烟87八倍体以及N. plumbaginifolia的染色体进行杂交,均获得了良好效果。且杂交液可简化配制,洗脱过程也可简化。18S rDNA寡聚核苷酸探针与5S rDNA寡聚核苷酸探针结合,实现了N. plumbaginifolia的18S rDNA和5S rDNA双色FISH。所以,该寡聚核苷酸序列可以应用于烟草属植物18S rDNA(45S rDNA)位点的分析,且较大程度缩短了操作时间并简化了操作过程。

16S-23S rDNA内转录间隔区序列寡核苷酸探针鉴定分支杆菌菌种的研究

目的 研究以16S-23S rDNA 内转录间隔区(internal transcribed spacer,ITS)序列为靶基因设计分支杆菌菌种寡核苷酸探针,应用PCR-反向杂交技术快速鉴定分支杆菌菌种。方法 应用PCR-反向杂交技术检测26种36株分支杆菌标准株,24株分支杆菌临床分离株。结果 分支杆菌标准株和临床分离株经PCR扩增,依菌种不同可见一条约340bp-450bp范围DNA片段。探针特异性试验表明,21种寡核苷酸探针除草分支杆菌探针。MPH与微黄分支杆菌亦杂交外,其余探针均为特异的。5株结核分支杆菌临床分离株鉴定为结核分支杆菌复合群,19株非结核分支杆菌临床分离株鉴定至种水平。结论 16S-23S rDNA ITS PCR-反向杂交鉴定分支杆菌菌种简便、快速、准确,具有较高应用价值。

用原位杂交技术检测小麦异源染色质及定位核糖体DNA

本研究以六倍体小黑麦品系“Badger”(Triticale)1B/1R 易位系“宁8026”和1R(1D)代换系“84056-1-36-1”为材料制备染色体样本,以生物素标记的整个黑麦基因组 DNA 和小麦核糖体 DNA(rDNA)作探针进行原位杂交,结果如下:(1)利用整个黑麦基因组 DNA 作探针时,棕色的杂交信号分布于整个黑麦染色体上,使其与 Wrights 染色的小麦染色体明显不同,从而把“Badger”中的黑麦染色体与小麦染色体区分开来,并且确定了“宁 8026”中的1B/1R 易位染色体及易位断裂点。(2)在“Badger”和“84056-1-36-1”中分别检测出6个和8个含核糖体 DNA 的杂交位点,分布在1B、6B、1R 和5D上。(3)用原位杂交发现小麦核糖体 DNA 基因在细胞分裂间期的表达行为。

Taqman-MGB双重探针PCR技术检测军团菌

目的建立同时检测军团菌属和嗜肺军团菌的双重荧光定量PCR方法。方法利用军团菌16SrDNA和rnip基因的特异性序列设计引物和MGB探针，两条探针5’端分别标记FAM和HEX，3’端标记MGB。优化了荧光定量PCR反应条件和反应体系，并对军团菌、嗜肺军团菌、非嗜肺军团菌及其它细菌进行检测，验证该方法的特异性、敏感性、重复性。结果该方法所检测菌株中军团茵属结果均为16SrDNA阳性（LP12、LP13除外）；嗜肺军团菌均为mip阳性，非嗜肺军团菌属除L．micdadei外均为阴性；而非军团菌菌株16SrDNA和mip检测结果均为阴性。检测灵敏度达10个拷贝／反应；重复性实验中，变异系数为0．2％～O．6％；从菌株核酸的提取至检测完成仅需2h左右。结论本文建立的TaqMan-MGB双重探针荧光定量PCR是一种定量检测军团菌的特异、快速、敏感的方法，可区分嗜肺与非嗜肺军团菌属，该方法的建立将有益于今后开展对外环境污染源进行初步卫生学调查与评估，以及应急临床标本的快速定量检测。

Taqman-MGB双重探针PCR技术检测含89K毒力岛猪链球菌2型

目的建立同时检测猪链球菌(Streptococcus suis,SS)种特异性16S rRNA及其89K毒力岛基因的SS2中国毒力株双重荧光定量PCR方法。方法利用SS种特异性16S rRNA和89K毒力岛基因的特异性序列设计引物和MGB探针。优化荧光定量PCR反应条件和反应体系,并对21株猪链球菌2型(Streptococcus suis serotype 2,SS2)、18株其它链球菌、9株葡萄球菌、5株其它菌株进行检测,验证该方法的特异性、敏感性、重复性。结果该技术的种特异性16S rRNA及其89K毒力岛两基因检测灵敏度分别为6个拷贝/反应(或12cfu/mL)及27拷贝/反应(或58cfu/mL);重复性实验,变异系数为0.30%～2.11%;从菌株核酸的提取至检测完成仅需2h左右。用该方法对有关菌株进行考核,21株SS2菌检测结果均为SS种特异性16S rRNA基因阳性,其中15株含有89K毒力岛的SS2菌株的89K毒力岛基因检测均阳性;而非SS菌株的16S rRNA和89K毒力岛基因检测结果均为阴性。对49份呼吸道咽拭子、血液应急样本等进行实际考核,有2份血液样本16S rRNA基因阳性,其中1份血液样本89K毒力岛基因阳性。结论本次建立的Taq Man-MGB双重探针荧光定量PCR方法特异、快速、敏感,可特异性鉴定SS2中国毒力株(含有89K毒力岛),区分SS与非SS菌以及是否含有89K毒力岛基因,该方法的建立将有益于目前针对猪链球菌2型中国毒力株快速定量检测,以及疑似猪链球菌病患者病原的早期甄别、猪链暴发疫情调查及猪群暴发或带菌调查与评估等。

DGGE法评价牙周袋深度的变化对龈下微生物群落的影响

目的应用变性梯度凝胶电泳(DGGE)方法分析经牙周基础治疗使牙周袋变浅后龈下微生物种类的变化。方法选取2例慢性牙周炎患者(患者1和患者2),在牙周基础治疗前及治疗后6、12、18周和1年时,采集同一位点的龈下菌斑,提取菌斑总DNA,PCR扩增16S rDNA的V3~V5区片段,DGGE分离获得条带图谱;计算条带数目和相似度,并对条带进行聚类分析。结果患者1治疗后牙周袋探诊深度明显变浅,达到≤3 mm的正常水平;患者2治疗后牙周袋探诊深度变浅,但仍≥5 mm。治疗前后2例患者DGGE条带数目无明显变化,治疗后各时间点的DGGE条带与基线分别保持48.14%~57.8%和63.70~72.35%的相似度。牙周治疗各阶段菌群聚类特征分析显示:牙周基础治疗后6周时,菌群聚类特征与基线相比变化明显,随着时间的推移逐渐发生再变化。结论慢性牙周炎患者在接受牙周基础治疗后,虽然牙周探诊深度变浅,但牙周微生物可能已在较短时间内发生再定植。

中草药青蒿(Artem isia annua L.)的实时荧光PCR检测

中草药青蒿,学名黄花蒿(Artem isia annuaL.),属于中国独有的抗疟药用植物资源之一。根据蒿属植物rDNA ITS序列多态性设计TaqM an探针及引物,通过实时荧光PCR方法对黄花蒿进行检测。结果表明:该组探针-引物对黄花蒿有很强的特异性,除黄花蒿外,其余8种对照蒿属材料均未检测到荧光信号。该方法快速、简便、安全、准确,适用于黄花蒿的出入境检验。

焦化废水工业处理装置和实验室装置硝化菌群的分子比较

反应器的群落结构分析有助于对工业装置的故障原因进行诊断。为了解决某焦化废水处理装置硝化功能低下的故障,构建了一套相似的实验室装置作为参照系统,该装置的硝化功能良好。通过工业装置和实验室装置好氧池生物膜16SrDNA克隆文库的比较,分析了它们之间硝化菌群的组成差异。实验室装置克隆文库的构成说明Nitrosomonas europaea-Nitrosoccus mobilis类群和Nitrospira属Ⅰ亚区系分别是该工艺条件下优势的氨氧化菌和亚硝酸氧化菌,但工业装置的克隆文库中却没有找到任何与硝化菌序列相近的克隆,这说明工业装置中硝化菌的多度较低。进一步使用Taqman荧光探针实时定量PCR测定了样品中Nitrospira属的多度,实验室装置中Nitrospira属16S rDNA的拷贝数达到3.4×106个/微克基因组DNA,而工业装置的测定值不到实验室装置的1/300。这些试验结果都表明工业装置好氧池微生物群落中缺少适当的硝化菌群是造成其硝化能力低下的重要原因。提高菌群中Nitrosomonas属和Nitrospira属的多度是解决工业装置硝化能力低下的关键。

基于TaqMan-MGB探针的虾肝肠胞虫荧光定量PCR检测方法

【目的】基于TaqMan-MGB探针建立虾肝肠胞虫(EHP)荧光定量PCR检测方法,为EHP的快速定量检测及实时监测提供技术手段。【方法】以EHP的SSU rDNA基因为检测靶基因,在其保守区设计特异性的扩增引物和TaqMan-MGB探针,将PCR扩增目标片段克隆至pMD18-T载体构建重组质粒pMD18-T-SSU^EHP(标准品),以标准品DNA为模板优化反应体系,建立检测EHP的TaqMan-MGB探针荧光定量PCR;以10倍梯度稀释的标准品DNA为模板构建扩增标准曲线,并进行特异性、敏感性、重复性及临床应用试验。【结果】制备的重组质粒pMD18-T-SSU^EHP DNA稳定性好,可满足作为标准品和阳性对照的要求;标准品(pMD18-T-SSU^EHP)起始模板范围为2.0×10^1~2.0×10^9拷贝/反应时,建立的标准曲线线性关系良好,对应的线性回归方程为y=-3.232×lg(x)+39.51。基于TaqMan-MGB探针建立的EHP荧光定量PCR对标准品的检测灵敏度可达20拷贝/反应,对临床虾样品EHP的检测灵敏度约10拷贝/mg,较农业农村部推荐的套式PCR约提高10倍;对虾类其他常见病原均无扩增反应,其组内和组间变异系数分别为0.26%~0.72%和0.56%~0.92%,整个检测过程可在1 h内完成。采用建立的TaqMan-MGB探针荧光定量PCR与套式PCR同时对276份临床虾样品进行检测比较,发现两种方法的符合率为96.7%,检测低拷贝数虾样品时前者具有更高的灵敏度;2018和2019年广西虾样品的EHP阳性检出率分别为16.2%和30.6%。【结论】基于TaqMan-MGB探针建立的EHP荧光定量PCR检测方法具有特异性强、灵敏度高、重复性好、定量范围宽及简单快速等优点,适用于虾类样品的EHP定量检测,可为EHP实时监测及EHPD快速诊断提供一种新的技术手段。

基于23SrDNA基因的病原细菌通用检测寡核苷酸芯片

目的 :利用新兴的生物芯片技术 ,以细菌 2 3SrDNA基因为靶序列 ,实现常见病原细菌的通用检测。方法 :从核酸数据库中调用一些病原细菌的 2 3SrDNA基因序列 ,在指定的片段内设计目的细菌的种特异性寡核苷酸探针 ,用适当的方法固定在玻片上 ,制备寡核苷酸芯片 ;扩增实验细菌 2 3SrDNA基因片段 ,并同时完成荧光素的掺入标记 ,标记扩增产物纯化后 ,与芯片进行杂交 ,根据杂交结果进行条件优化及芯片评价。结果 :通过对探针、固定化、标记、杂交等条件进行优化 ,本实验中所使用的多种实验细菌可以在 4h左右通过杂交得到准确鉴定 ;以奇异变形杆菌为对象 ,本系统最低检出菌液浓度为 10 0个 ml,即反应体系中含 10个菌体即可检出。结论 :本研究建立的寡核苷酸芯片系统可以稳定而特异地实现多种细菌的通用检测 ,具有良好的应用前景。

rDNA序列在多种蔬果类植物染色体上的定位

利用改进的rDNA序列标记荧光原位杂交方法,将18S-5S rDNA探针序列直接在5'端进行荧光修饰,并成功将其应用到多种植物染色体上,该方法比常规方法具有省时、经济、快速、信号强等特点,使rDNAFISH杂交更为简单,更易操作.首次利用该技术成功地对30种蔬果类植物中期染色体进行18S-5S rDNA的物理定位,初步了解了rDNA序列在这些蔬果类植物基因组中位点数目和分布特点,其中大蒜、大葱、蚕豆、萝卜(3种)茴香、红菜苔、空心菜、芥兰、莴苣、乌塌菜、雪里蕻、茼蒿、油菜、辣椒、茄子、芹菜、菜豆、花椰菜等20种植物首次确定了18S-5S rDNA在中期染色体上的位置,其余10种植物与前人的结果相吻合.该方法可以作为染色体的一个识别指标,也可为蔬果类植物属内进化和物种分化研究提供重要资料.