韩茵陈等3种药材基源rDNA内转录间隔区的序列分析鉴定

目的 :建立一种简便、实用的亲缘关系相近的茵陈类药材DNA分子鉴定方法 ;找出中韩两国茵陈药材在遗传学上的差异。方法 :采用聚合酶链反应产物直接测序法对 3种茵陈 (茵陈蒿、韩茵陈和白莲蒿 )进行鉴别。从 3种茵陈的组织材料中提取DNA ,扩增rDNA的内转录间隔区 (internaltranscribedspacers ,ITS)和 5 .8s的序列。对扩增产物进行了DNA序列分析。结果 :韩茵陈、白莲蒿在PCR产物凝胶电泳图谱上有明显差异 ,且DNA序列分析结果差异为 3.96 % ,韩茵陈和茵陈蒿在遗传学上存在差异。结论 :用rDNA的ITS序列分析法鉴别茵陈类药材 ,方法简便。

16S-23S rDNA内转录间隔区序列寡核苷酸探针鉴定分支杆菌菌种的研究

目的 研究以16S-23S rDNA 内转录间隔区(internal transcribed spacer,ITS)序列为靶基因设计分支杆菌菌种寡核苷酸探针,应用PCR-反向杂交技术快速鉴定分支杆菌菌种。方法 应用PCR-反向杂交技术检测26种36株分支杆菌标准株,24株分支杆菌临床分离株。结果 分支杆菌标准株和临床分离株经PCR扩增,依菌种不同可见一条约340bp-450bp范围DNA片段。探针特异性试验表明,21种寡核苷酸探针除草分支杆菌探针。MPH与微黄分支杆菌亦杂交外,其余探针均为特异的。5株结核分支杆菌临床分离株鉴定为结核分支杆菌复合群,19株非结核分支杆菌临床分离株鉴定至种水平。结论 16S-23S rDNA ITS PCR-反向杂交鉴定分支杆菌菌种简便、快速、准确,具有较高应用价值。

四个红菇科菌株的rDNA ITS序列分析和系统发育研究

以采自浙江省丽水山区的4个红菇科菌株作为研究材料,进行rDNAITS(Internal Transcribed Spacer)区段克隆测序和序列特征比较分析,并对ITS序列进行核酸序列数据库GenBank同源性检索比对,将从GenBank检索获得的15个最相似物种的ITS序列连同4个红菇科菌株的ITS序列一起用于系统发育分析。序列比较结果表明,4个红菇科菌株的rDNAITS序列长度为673bp^766bp,GC含量为47.4%~49.48%,其中2个红菇属(Russula)菌株R32和R57间的ITS序列长度和GC含量差异极小,而与血红乳菇(Lactarius sanguifluus)菌株L37间的ITS序列长度和GC含量差异较大。系统发育分析表明,R57为花盖红菇(R.cyanoxantha)的一个菌株,红菇属的赭盖红菇(R.mustelina)、绿菇(R.virescens)和青灰红菇(R.parazurea)三者间的序列差异较小,亲缘关系较近;乳菇属(Lactarius)的血红乳菇同鲑色乳菇(L.salmonicolor)种间的序列差异较小,亲缘关系较近。

深圳市白纹伊蚊rDNA ITS2区克隆及SNP分析

目的克隆和序列分析深圳市白纹伊蚊核糖体DNA(rDNA)第2内转录间隔区(ITS2),并探明其rDNA ITS2核酸的特异性及不同个体在rDNA ITS2区的单核甘酸的多态性(Single Nuclear Polymorphism,SNP),以便利用ITS2基因的高度保守性及其蚊媒不种群在ITS2片段的多态性来分子鉴别白纹伊蚊。方法PCR特异扩增白纹伊蚊rDNA ITS2,利用QIAquick技术从琼脂糖胶上回收纯化扩增的目的ITS2 DNA片段,纯化后的目的ITS2 DNA片段被连接到TA载体上,在含有青霉素的琼脂糖胶平面上筛选含目的ITS2 DNA片段的阳性克隆,阳性克隆经含有青霉素的LB液体培养基培养,用Ultrapure^(TM)质粒提取试剂盒提取克隆质粒,用双酶切鉴定插入的片段大小,DNA序列分析仪分析每个蚊rDNA ITS2的序列,用生物信息系统进行白纹伊蚊rDNA ITS2 SNP的差异分析。结果518bp全长的深圳市白纹伊蚊rDNA ITS2被克隆和序列分析,深圳市四个不同地理的白纹伊蚊rDNA ITS2的同一性为97％,而两个地方之间的比较有99％的同一性,其rDNA ITS2基因单核苷酸存在转换、颠换和缺失,在518bp的范围内有6个C→T,2个A→G的转换,3A→T,一个A→C的颠换,3个CG和一个AC缺失。结论白纹伊蚊rDNA ITS2有高度的保守性,不同个体也表现了单核苷酸的多态性。

嗜人按蚊rDNA-ITS2基因的克隆鉴定及SNP分析

目的克隆和分析嗜人按蚊核糖体DNA(rDNA)第2内转录间隔区(ITS2)序列,研究嗜人按蚊rDNA-ITS2序列的种属特异性及不同个体rDNA-ITS2序列的单核苷酸多态性(Single Nuclear Polymorphism,SNP)。方法用DNA提取试剂盒从嗜人按蚊中提取DNA摸板,利用蚊虫5.8S和28S序列的保守性设计特异引物进行聚合酶链反应以扩增嗜人按蚊rDNA-ITS2基因,扩增产物经回收纯化后连接到TA载体,经amp+LB固体平板筛选的阳性克隆,经amp+LB液体培养基培养后进行PCR鉴定、EcoRI酶切鉴定和序列分析。结果经PCR反应扩增出全长556bp的嗜人按蚊rDNA-ITS2基因,纯化后重组克隆经PCR鉴定可重现556bp的特异性条带,其酶切产物亦与目的基因PCR产物位置相同。嗜人按蚊6个克隆的同一性为99.6%,其rDNA-ITS2基因单核苷酸存在颠换和插入,在556的范围内有一个A→T,一个G→T的颠换;一个T的插入。结论嗜人按蚊rDNA-ITS2序列在种间高度保守,但不同个体间也存在一定的SNP多态性。

PCR为基础的反向线点杂交及16S～23S rDNA间区测序分析5种少见类型奴卡菌

目的探讨5种新出现的奴卡菌种16S～23S rDNA内转录间隔区(internal transcribed spacer,ITS)DNA基因序列的多态性,筛查特异的奴卡菌种逆向线点杂交(reverse line blot,RLB)探针。方法对6例奴卡菌标本进行ITS基因扩增、克隆、测序,设计奴卡菌种特异探针及ITS间区rDNA基因特异的探针,进行以PCR为基础的RLB(PCR/RLB)杂交试验,不同的RLB型进行ITS基因测序分析,以鉴别不同的奴卡菌种及种内分型。结果发现2个Nocardia beijingensis菌株ITS间区有8个基因序列型,4个RLB型;N.thailandica有4个基因序列型及RLB型;N.blacklockiae有5个基因序列型,3个RLB型,其中N-bla RLBⅢ型与所有Nbla-ITS探针杂交没有信号;N.elegans有5个基因序列型,3个RLB型;N.vinacea有5个基因序列型,2个RLB型。结论通过PCR/RLB试验,准确的ITS基因测序认识了新出现的菌种,即N.beijingensis,N.blacklockiae,N.elegans,N.thailandica及N.vinacea。同时建立了可以大量筛查奴卡菌种的PCR/RLB方法,以进行快速临床诊断及流行病学研究。

足部皮肤镰刀菌病

目的:报告1例由茄病镰刀菌引起的足部皮肤镰刀菌病。方法:皮损分泌物直接镜检、真菌培养,活检皮损作组织病理学检查,培养、分离菌株行DNA序列分析和体外药敏试验。结果:皮损直接镜检见无色、分隔菌丝,组织病理显示真皮内菌丝和孢子。沙堡弱培养基(SDA)和马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA)培养出灰白色棉絮状菌落,微量培养可见大、小分生孢子和厚壁孢子,具有镰刀菌样细胞结构特征。rDNA内转录间隔区(internal transcribed spacer,ITS)序列分析符合茄病镰刀菌。对两性霉素B、制霉菌素、特比萘芬敏感。给予口服特比萘芬0.25 g,每天2次,治疗5个月后皮损完全愈合。结论:该例为由茄病镰刀菌感染引起的足部溃疡,特比萘芬治疗有效。

我国代表地区须癣毛癣菌复合体的分子鉴定与分型研究

目的对我国代表地区的须癣毛癣菌菌株进行分子再鉴定和分型研究。方法选取我国南北方8个省市地区经表型鉴定的须癣毛癣菌菌株47株,通过再培养形态观察、生理试验;PCR扩增核糖体DNA(rDNA)的内转录间隔区(ITS)和核糖体大亚基(LSU)D1-D2区,测序后利用数据库进行序列比对,对须癣毛癣菌复合体进行再鉴定;PCR扩增rDNA非转录间隔区(NTS)的三个串联重复亚单位S0、S1和S2区,进行种内分型,并比较不同部位来源菌株型别的差异性。结果我国南北方8个省市地区47株须癣毛癣菌中3株鉴定为断发毛癣菌,6株鉴定为无性型苯海姆节皮菌,其余均鉴定为万博节皮菌中的亲人型趾间毛癣菌;三对不同引物扩增38株趾间型毛癣菌和2株苯海姆节皮菌NTS区,共产生28种特征性带型。带型和菌株来源及发生部位无相关性。结论我国分离自人类须癣毛癣菌复合体的主要组成菌种为趾间毛癣菌;ITS区结合LSU D1-D2区测序有助于鉴定须癣毛癣菌复合体至种水平;NTS区的三个串联重复亚单位所产生的特征性指纹图提供了一种快速、稳定的分子生物学种内分型方法,可应用于趾间毛癣菌感染的流行病学研究。

一种快速辨别糙皮侧耳和肺形侧耳的方法

目的:建立一种快速、经济的方法辨别糙皮侧耳(P.ostreatus)和肺形侧耳(P.pulmonarius)。方法:在GenBank下载糙皮侧耳和肺形侧耳的ITS序列,经ClustalX序列比对,利用Primer 3设计特异引物组合1F(5′-GATAGATCTGTGAAGTCGTC-3‘)、1R(5′-TCACAATTGGAAAGAAACC-3′)和2R(5′-TGCGTGCTATTGATGAGTGA-3′),最后经PCR扩增和琼脂糖凝胶电泳检测。结果:5个糙皮侧耳菌株均能得到2条带,分别为342bp和459bp。4个肺形侧耳菌株均能扩增到一条446bp的片段。结论:该组引物适合辨别糙皮侧耳和肺形侧耳。

M13分子标记快速区分树木溃疡病原真菌的种类

树木溃疡病菌具有寄主多样性、危害症状复杂且分布广泛的特点,快速简便地区分真菌类别是杨树溃疡病研究及防治中需要解决的重要问题。在对树木溃疡病菌的遗传多样性研究,发现以M13为引物的PCR扩增可以在不同的种类之间产生稳定分化的带型。因此,本研究分离了43株18种树木溃疡病相关真菌,并且对这些菌株进行rDNA-ITS序列测定及M13-PCR。结果显示,M13带型差异与真菌的特定种类相对应。因此,认为M13分子标记可以准确快速地鉴定、区分树木溃疡病菌。

大连、沈阳两地须癣毛癣菌复合体的分子鉴定及DNA分型

目的探讨大连和沈阳两地须癣毛癣菌复合体的主要组成菌种及主要组成菌种肉芽肿株和体癣株DNA分型有无差异。方法选取大连和沈阳地区已行表型鉴定的须癣毛癣菌16株(12株体癣株,4株肉芽肿株),通过PCR扩增核糖体DNA(rDNA)的内转录间隔区(ITS),测序后利用数据库进行序列比对,对须癣毛癣菌复合体进行鉴定;PCR扩增rDNA非转录间隔区(NTS)的3个串联重复亚单位S0,S1和S2区,进行种内分型,比较菌株间型别的差异性。结果大连、沈阳两地的16株须癣毛癣菌中,2株鉴定为断发毛癣菌,1株鉴定为苯海姆节皮菌,13株鉴定为万博节皮菌;3对不同引物扩增13株万博节皮菌NTS区,共产生8种特征性带型;万博节皮菌的体癣株和肉芽肿株的带型除S2区外,在S0,S1区及总区间均有差异。结论大连、沈阳两地须癣毛癣菌复合体的主要组成菌种为万博节皮菌;万博节皮菌肉芽肿株和体癣株NTS区的带型有差异。

基于ITS2序列的藁本与常见混伪品的分子鉴定

本文对药材藁本及其常见混伪品的rDNA ITS2进行了PCR扩增、测序，并运用MEGA软件对该区进行序列分析，比较了ITS2碱基序列的差异及其规律，同时为药材藁本及混伪品的指纹图谱鉴别提供分子标记。结果显示辽藁本的种内差异较小，而与其主要混伪品间存在较大的变异，差异性范围为5．7％～35．3％。根据ITS2序列特征构建的系统树，药材藁本的样品紧密的聚在一起，和其混伪品可以明确区分，支持率为100％。此外，ITS2的二级结构可作为鉴定药材藁本及混伪品种的一个方法，具有一定的系统学及分类学意义。本研究表明rDNA ITS2序列分析可作为药材藁本与混伪品的一种有效的分子鉴定方法，具有重要的应用价值。