二种淡水微囊藻rDNA16S-235基因间隔区的序列测定与分析

本研究采用ＰＣＲ及序列测定的方法，对我国淡水铜绿微囊藻有毒株（Ｍ８６４１）和另一低毒的种类惠氏微囊藻（Ｍ５７４）ｒＤＮＡ１６Ｓ－２３Ｓ基因间隔区进行了序列的测定和分析，结果表明：ｒＤＮＡ１６Ｓ－２３Ｓ基因间隔区可以作为一个精细且稳定的指标，用于微囊藻的分类和鉴定。并从分子水平提出了铜绿微囊藻与惠氏微囊藻在种系发生上有较近缘的关系。本文首次对微囊藻属Ｍｉｃｒｏｃｙｓｔｉｓ ｒＤＮＡ基因间隔区全序列作了报道，为微囊藻属的鉴定及系统学研究提供了分子基础。

米氏凯伦藻18SrDNA和转录间隔区序列分析

对赤潮多发藻米氏凯伦藻（Karenia mikimotoi）核糖体18SrDNA及其转录间隔（ITS）区序列PCR扩增并测序，获得18SrDNA和ITS基因序列长度分别为1690bp和654bp。结合12种甲藻和1种硅藻作序列比较分析，分别在ITS1、ITS2序列寻找到适宜设计特异性引物探针区域，并用邻接法构建系统进化树，研究各藻种间亲缘关系。遗传距离分析结果显示米氏凯伦藻与短凯伦藻（Karena brevis）、微小卡罗藻（Karlodinium micrum）等分类学上较近的藻种18SrDNA序列相似度为97％～99％，远大于微小原甲藻（Prorocentrum minimum）、海洋原甲藻（P．micans）、塔玛亚历山大藻（Alexandrium tamarense）等在分类学上相距较远的藻种，各藻种间的ITS序列平均相似度明显低于18SrDNA序列。以18SrDNA与ITS序列构建的进化树拓扑结构相一致，18SrDNA序列相对保守，适合进行属以上关系的系统进化分析，而ITS序列变异较大，适合种属间鉴别分析，且ITS1和ITS2是变异很大的区域，适合种间的分子特异性鉴定，这为快速鉴别赤潮多发藻米氏凯伦藻提供了依据，进而为治理赤潮提供帮助。

16S-23S rDNA间隔区在奶牛乳房炎诊断中的应用

以 16 S- 2 3S r DNA间隔区为扩增靶序列的 PCR技术是近年来发展的细菌分类和鉴定新方法 ,具有快速、敏感和特异性高的优点。作者综述了细菌 16 S- 2 3S r DNA间隔区序列的特性及其在奶牛乳房炎病原诊断中的应用等研究进展。

赤潮铜绿微囊藻rDNA基因间隔区的序列分析以及与淡水微囊藻的比较

采用ＰＣＲ及序列测定的方法，对在厦门西港海域采集的赤潮铜绿微囊藻１６Ｓ和 ２３５ｒＤＮＡ基因间隔区Ｉｎｔｅｒｇｅｎｉｃ Ｓｐａｃｅｒ Ｒｅｇｉｏｎ （ＩＳＲ）区进行了序列测定和分析，并通过与两 种淡水微囊藻的比较，找出了其特征性核苷酸作为专一性分子探针设计的靶序列，为该藻 种以及微囊藻属的快速鉴定及系统学研究提供了分子基础。

柑橘黄龙病菌亚洲种16S rDNA和16S-23S rDNA间隔区的PCR-RFLP及序列分析

为明确柑橘黄龙病菌的遗传多样性,PCR扩增了6个不同地区黄龙病菌的16SrDNA和16S-23S rDNA间隔区(intergenic spacer regions,ISR),分别通过4种内切酶对其进行了限制性片段长度多态性分析,发现不同分离物的16S rDNA和16S-23S rDNA间隔区各酶切产物的电泳谱带完全一致,未表现多态性。对16S-23SrDNA ISR进行了克隆和测序,经DNAman和NCBI Blast比对分析发现,6个分离物16S-23SrDNAISR序列之间不存在碱基差异,与数据库中柑橘黄龙病菌亚洲种(Candidatus Liberibacter asiaticus)同源性高达99.0%～100%。系统发育分析显示所有的Ca.L.asiaticus归为一个类群,而后与Ca.L.africanus、Ca.L.americanus和Ca.L.psyllaurous组成韧皮部杆菌属(Candidatus Liberibacter)一个大的类群。结果表明,同一种柑橘黄龙病菌不同分离物16S rDNA和16S-23S rDNAISR无分子变异或变异较小,不存在遗传多样性。

16s～23s rDNA间隔区序列RFLP分析在分枝杆菌分类鉴定中的应用

目的：通过对分枝杆菌１６ｓ～２３ｓｒＤＮＡ间隔区序列ＤＮＡＰＣＲ扩增和限制性酶切分析，评价其在分枝杆菌分类鉴定中的价值。方法：对２１种分枝杆菌和９种亲缘关系较远的非分枝杆菌和４种亲缘关系较近的非分枝杆菌的１６ｓ－２３ｓｒＤＮＡ间隔区序列ＤＮＡ进行ＰＣＲ扩增并对扩增产物进行限制性内切酶ＨａｅⅢ．ＭｓｐＩ消化反应，分析不同菌种扩增片段及其限制性片段长度多态性的差异。结果：ＰＣＲ扩增结果显示：分枝杆菌一般扩增出１～２带，非分支杆菌一般有１～３条带。８０％的缓慢生长分枝杆菌扩增片段集中在３４０～４００ｂｐ，快速生长分枝杆菌扩增片段集中在４７０～５７５ｂｐ。单从扩增产物的琼脂糖凝胶电泳只能鉴定４２％的受试菌种。酶切结果显示：３种分枝杆菌酶切图谱没有区别，大部分分枝杆菌的酶切图谱彼此不同，而大部分非分枝杆菌不能被ＨａｅⅢ．ＭＳＰⅠ消化。结论：说明１６ｓ～２３ｓｒＤＮＡ间隔区序列ＤＮＡＰＣＲ扩增和限制性片段长度多态性分析是分枝杆菌菌种分类鉴定的一种快速、有效的方法。

基于16S-23S rDNA间隔区序列(ITS)、REP序列的基因指纹图谱及UPGMA聚类法的拟诺卡菌属分类方法

拟诺卡菌属(Nocardiopsis)是拟诺卡菌科(Nocardiopsaceae)的唯一属.该属内进行物种鉴别时通常是在多相分类方法基础上,以全基因组杂交同源性在70%以下的为不同物种,此为国际公认的定种标准;但在进行大量菌株的比对时操作比较复杂,于是多种基于DNA的基因图谱技术发展起来.本实验利用适宜引物,对拟诺卡菌属15株基准株基因组DNA的16S-23S rDNA间隔区序列(ITS)和REP序列进行了扩增,获得了两种基因指纹图谱,同时根据UPGMA聚类法构建了相应的进化距离树图.结果表明,对于拟诺卡菌属中不同物种的区分,两种基因图谱技术的分辨力相当,均可以较好的呈现物种间差异,可以作为拟诺卡菌属菌株多相分类的组成部分,应用于物种水平的分类与鉴定.

蓝藻OscilatoriaceaerDNA16S-23S基因间隔区的序列分析及其分类学意义

采用末端终止法对蓝藻类颤藻科Ｏｓｃｉｌａｔｏｒｉａｓｐ．ｒＤＮＡ１６Ｓ－２３Ｓ基因间隔区进行了序列测定，获得了Ｏｓｃｉｌａｔｏｒｉａｓｐ．ｒＤＮＡ基因间隔区４２７个核苷酸，其中包含１个异亮氨酸ｔＲＮＡ基因（ｔＲＮＡＩｌｅ）。并通过计算机联网从国际分子生物学数据弹库中获取颤藻科其它种的ｒＤＮＡ基因间隔区序列，通过比较分析，从分子水平对颤藻科Ｏｓｃｉｌａｔｏｒｉａｃｅａｅ属间的某些分类学问题进行了讨论，并根据序列中核苷酸差异值探讨了颤藻科属间界定的分子标准。提出了ｒＤＮＡ基因间隔区是良好的分子标记，可用于“赤潮”或“水华”

产氢菌的16S-23S rDNA间隔区的长度变异性分析(英文)

生物制氢细菌Rennanqilyf3的16SrRNAgene(rDNA)-23SrDNA间隔区碱基序列被测定.利用PCR扩增间隔区DNA,间隔区碱基序列存在长度多态现象.用这一长度多态现象进行产氢发酵细菌的辨认和识别.产氢发酵细菌Rennanqilyf3的16SrRNAgene(rDNA)-23SrDNA间隔区的PCR产品从1270到398bp,共有5个序列.碱基数目分别为1270、398、638、437和436bp.

甘蔗近缘属种23S-4.5S-5S rDNA内转录间隔区序列分析

【目的】探讨叶绿体23S-4.5S-5S rDNA内转录间隔区序列在甘蔗近缘属种系统进化中的应用,为深入研究甘蔗近缘属种系统进化提供参考。【方法】以14个甘蔗近缘属种材料为研究对象,测序分析其23S-4.5S-5S rDNA内转录间隔区序列,并应用BLAST分析其在禾本科中的变异情况。【结果】23S-4.5S-5S rDNA内转录间隔区序列在14个甘蔗近缘属种材料间的同源性为100%,属于高度保守区域,但在禾本科各亚科间表现出一定的变异,且在各亚科中都存在其特异的变异位点。【结论】23S-4.5S-5S rDNA内转录间隔区序列在甘蔗近缘属种间属于高度保守的区域,不适合用于甘蔗近缘属种间系统进化的分析,但可为禾本科亚科系统进化的分析提供有用的信息。

利用16S-23S rDNA间隔区快速鉴定猪链球菌和马链球菌兽疫亚种

利用16S-23S rDNA间隔区(ISR)长度和序列的多态性,结合16S rDNA和23S rDNA的保守性,分别在16S rDNA末端和23S rDNA前端保守区设计上下游引物,进行PCR扩增。结果为21株猪链球菌均扩增出长度约为1 200 bp的片段,8株马链球菌兽疫亚种均扩出约1 300 bp的片段,其他属菌株和阴性对照无结果。因此,由PCR产物长度的不同就可快速区分猪链球菌和马链球菌兽疫亚种,这种基于ISR的PCR技术为鉴别病原微生物提供了更加简捷的方式。对2株代表菌(HA9801,ATCC 35246)的16S-23S rDNA ISR进行测序发现,猪链球菌和马链球菌兽疫亚种的ISR差异主要表现为碱基的缺失。

16S～23S rDNA间隔区序列寡核苷酸探针不同显色方法对结核患者痰标本的检测

目的 评价 16S～ 2 3SrDNA间隔区序列寡核苷酸探针碱性磷酸酶显色与辣根过氧化物酶化学发光法对结核患者痰标本检测的应用价值。方法 采用生物素标记 5′端 18bp的寡核苷酸探针斑点杂交的碱性磷酸酶显色反应及辣根过氧化物酶化学发光检测 90例结核患者和 30例非结核患者痰标本。结果 痰标本基因组DNA直接与探针杂交 ,碱性磷酸酶显色反应检测阳性率为 2 2 2 % ,辣根过氧化物酶化学发光检测阳性率为 33 3% ;痰标本经引物PL1、PL2扩增 (扩增产物 35 0bp ,)与寡核苷酸探针杂交 ,碱性磷酸酶显色反应检测阳性率为 77 8% ,辣根过氧化物酶化学发光检测阳性率为 83 3% ;痰标本经引物b扩增 (扩增产物 2 5 0bp)与探针杂交 ,碱性磷酸酶显色和化学发光检测阳性率分别为 75 6 %、80 0 % ,检测的敏感性高于痰涂片。寡核苷酸探针与 30例非结核患者痰标本DNA杂交则全为阴性。结论 寡核苷酸探针和 2 5 0bpPCR扩增产物相结合 ,经化学发光显色是分枝杆菌检测的一种有效方法。

16S-23S rDNA内转录间隔区序列寡核苷酸探针鉴定分支杆菌菌种的研究

目的 研究以16S-23S rDNA 内转录间隔区(internal transcribed spacer,ITS)序列为靶基因设计分支杆菌菌种寡核苷酸探针,应用PCR-反向杂交技术快速鉴定分支杆菌菌种。方法 应用PCR-反向杂交技术检测26种36株分支杆菌标准株,24株分支杆菌临床分离株。结果 分支杆菌标准株和临床分离株经PCR扩增,依菌种不同可见一条约340bp-450bp范围DNA片段。探针特异性试验表明,21种寡核苷酸探针除草分支杆菌探针。MPH与微黄分支杆菌亦杂交外,其余探针均为特异的。5株结核分支杆菌临床分离株鉴定为结核分支杆菌复合群,19株非结核分支杆菌临床分离株鉴定至种水平。结论 16S-23S rDNA ITS PCR-反向杂交鉴定分支杆菌菌种简便、快速、准确,具有较高应用价值。

肾形肾状线虫个体间rDNA内转录间隔区的变异

利用DNA序列分析技术对我国浙江、福建和重庆3个地区的肾形肾状线虫（Rotylenchulus reniformis,RN）种内群体及群体内个体间核糖体RNA基因（rDNA）内转录间隔区（internal transcribed spacer,ITS）序列进行PCR扩增及序列变异分析。结果显示不同的群体间均获得2种PCR产物,标记为变异类型Ⅰ（RN_VAR1）和变异类型Ⅱ（RN_VAR2）。基于每个群体内2条雌虫分别挑取各变异类型的5个克隆测序,共得到60个克隆序列。经序列比对分析,发现肾形肾状线虫rDNA基因2种类型的ITS区变异很大,其中变异类型Ⅰ序列长度为705-712bp,鸟嘌呤和胞嘧啶（guanine and cytosine content,GC）含量为45.1%-46.7%;变异类型Ⅱ序列长度为854-860bp,GC含量为48.4%-50.0%。2种类型的ITS相似度（包括5.8SRNA基因）仅为62.1%-65.6%,而各rDNA变异类型内部各个克隆序列也存在差异,变异类型Ⅰ内个体间相似度为89.9%-100%;变异类型Ⅱ内个体间相似度为91.4%-99.8%。系统进化分析表明2种变异序列明显分成2支,同时通过ITS序列分析无法将3个地方群体区分开来。经实时荧光定量PCR（quantitative real-time PCR,qPCR）检测发现RN_VAR1含量稍大于RN_VAR2,分别占保守18S基因的rDNA重复单位含量的56%和40%。同时,还发现肾形肾状线虫的2种rDNA-ITS变异类型与已报道的2种18SRNA基因变异类型相对应,表明肾形肾状线虫存在2种rDNA变异类型。

赣南柑桔黄龙病菌16S rDNA、16S/23S rDNA间隔区和核糖体蛋白基因的遗传多样性

为探究赣南地区柑桔黄龙病菌的遗传多样性,从赣南16个县(市、区)采集32份具典型柑桔黄龙病症状的脐橙叶片样品,运用PCR-RFLP(聚合酶链式反应-限制性长度多态性分析)技术研究柑桔黄龙病菌16SrDNA序列、16S/23SrDNA间隔区序列和核糖体蛋白基因的多态性,并对3个基因片段进行测序,分析序列的碱基含量、碱基转换率与颠换率、相似性、核苷酸遗传距离和系统进化特征。结果表明,供试赣南柑桔黄龙病菌样品在3个基因片段上的RFLP指纹图谱均一致,未表现出多态性,且序列相似性均在98%~100%;序列碱基中的GC含量以16SrDNA最大,序列碱基的转换率/颠换率以16SrDNA最小;赣南柑桔黄龙病菌样品与亚洲种Candidatus Liberibacter asiaticus之间的序列相似性最大、核苷酸遗传距离最小,在系统进化中归属亚洲种。

5.8S rDNA-ITS区片段的序列分析在坛紫菜种质鉴定中的应用

为探讨DNA序列标记技术在坛紫菜种质鉴定中的应用,对10个野生坛紫菜种质材料的5.8S rDNA-ITS区进行PCR扩增和序列分析,结果发现扩增的片段长度在1208～1219bp之间,可以分为ITS1区,5.8S区和ITS2区3个部分,其中5.8S区片段的长度完全一致,均为160bp;ITS1区和ITS2区片段的长度也非常接近,只有几个碱基的差异。多重序列比对发现10个种质材料的ITS区(包括ITS1和ITS2)序列都存在一定差异,序列同源性在95.82%～99.73%之间,而5.8S区序列则完全一致,但与其它种紫菜的5.8S区序列有很大差异,序列同源性在79.7%～95.0%之间。由此认为5.8S rDNA-ITS区这种高度保守区和高变区交替排列的形式可以成为坛紫菜种质鉴定及系统进化分析的强有力工具。

野生大豆与栽培大豆rDNA ITS1区的研究

采用ＰＣＲ 技术从野生大豆（Ｇｌｙｃｉｎｅ ｓｏｊａ）、半野生大豆（Ｇ．ｇｒａｃｉｌｌｉｓ）、多年生野生大豆（Ｇ．ｔｏｍｅｎｔｅｌｌａ、Ｇ．ｔａｂａｃｉｎａ）和栽培大豆（Ｇ．ｍ ａｘ）的两个品种ＵＮＩＯＮ、文丰７ 中扩增和克隆了ｒＤＮＡ第一转录间隔区（ＩＴＳ１）。其在Ｇ．ｍ ａｘ 基因组中的拷贝数约为２×１０３。序列分析表明Ｇ．ｓｏｊａ、Ｇ．ｇｒａｃｉｌｌｉｓ、Ｇ．ｍ ａｘ 中的Ｇ／Ｃ含量为６１．４０％ ，而Ｇ．ｔａｂａｃｉｎａ和Ｇ．ｔｏｍ ｅｎｔｅｌｌａ的Ｇ／Ｃ含量分别为５８．１１％ 和５９．０１％ ，与绿豆Ｇ／Ｃ含量（５９．８１％ ）相近。Ｇ．ｔａｂａｃｉｎａ的Ｇ／Ｃ含量是已知的植物中ＩＴＳ１ 最低的。最大同源性分析表明，大豆属植物ＩＴＳ１ 的同源程度很高，同其近缘属绿豆的同源性明显高于其它作物。同时分析了栽培、多年生和一年生野生大豆间的亲缘关系。另外还发现在已知的植物ＩＴＳ１ 序列中均含有ＧＡＣＣＣＧＣＧＡＡ 及ＧＣＧＣＣＡＡＧＧＡＡ

深圳市白纹伊蚊rDNA ITS2区克隆及SNP分析

目的克隆和序列分析深圳市白纹伊蚊核糖体DNA(rDNA)第2内转录间隔区(ITS2),并探明其rDNA ITS2核酸的特异性及不同个体在rDNA ITS2区的单核甘酸的多态性(Single Nuclear Polymorphism,SNP),以便利用ITS2基因的高度保守性及其蚊媒不种群在ITS2片段的多态性来分子鉴别白纹伊蚊。方法PCR特异扩增白纹伊蚊rDNA ITS2,利用QIAquick技术从琼脂糖胶上回收纯化扩增的目的ITS2 DNA片段,纯化后的目的ITS2 DNA片段被连接到TA载体上,在含有青霉素的琼脂糖胶平面上筛选含目的ITS2 DNA片段的阳性克隆,阳性克隆经含有青霉素的LB液体培养基培养,用Ultrapure^(TM)质粒提取试剂盒提取克隆质粒,用双酶切鉴定插入的片段大小,DNA序列分析仪分析每个蚊rDNA ITS2的序列,用生物信息系统进行白纹伊蚊rDNA ITS2 SNP的差异分析。结果518bp全长的深圳市白纹伊蚊rDNA ITS2被克隆和序列分析,深圳市四个不同地理的白纹伊蚊rDNA ITS2的同一性为97％,而两个地方之间的比较有99％的同一性,其rDNA ITS2基因单核苷酸存在转换、颠换和缺失,在518bp的范围内有6个C→T,2个A→G的转换,3A→T,一个A→C的颠换,3个CG和一个AC缺失。结论白纹伊蚊rDNA ITS2有高度的保守性,不同个体也表现了单核苷酸的多态性。

rDNA间区序列测定在乳杆菌鉴定中的应用

利用16S-23S rDNA Short ISR区间序列分析方法,对分离自酸马奶中的12株杆菌进行鉴定。通过对Short ISR序列测序并进行BLAST比对,结合系统发育树分析,可将ZL3-1、XM2-1和XF5-2判定为Lacto-bacillus.caseisubsp.casei,MG2-1、A6-2、B10-2和XB2-3归入L.helveticus,C56、D73和E96暂定为L.ferintoshensis,无法准确判定E91和E112的归属。16S-23S rDNA Short ISR区间序列可以识别L.rhamnosus和L.casei,而对于L.ferintoshensis、L.kefir、L.buchneri和L.hilgardii无法加以区分,但是仍有助于将未知杆菌归入这一群。