云南兰坪地区带绦虫rDNA-ITS PCR-RFLP分析

目的对云南兰坪地区带绦虫种类进行鉴定。方法分别选取云南兰坪地区带绦虫(LP株)、猪带绦虫(ZD株)、牛带绦虫(ND株)和都匀亚洲带绦虫(DY株)成虫孕节3片(ZD株、ND株、DY株均为标准对照),抽提基因组DNA,PCR扩增rDNA-ITS片段,用限制性内切酶Dde I对扩增片段作酶切分析。结果LP株rDNA-ITS片段PCR扩增产物经Dde I酶切后的图谱与DY株一致,与ND株和ZD株均不同。结论云南兰坪地区带绦虫(LP株)与DY株相似,同属于亚洲带绦虫。PCR-RFLP适用于带绦虫病的流行病学调查和临床诊断。

松材线虫rDNA-ITS2的Taq Man探针实时荧光PCR检测

以松材线虫rDNA -ITS2为靶区 ,建立松材线虫的TaqMan探针实时荧光PCR检测方法。对松材线虫大量DNA和单条线虫的检测结果表明 ,探针检测松材线虫和拟松材线虫时 ,前者产生明显的荧光信号 ,后者无荧光信号 ,表明探针具有高度的特异性 ;探针检测到最低模板浓度为 1pg·μL- 1 。

玉米顶腐镰孢菌rDNA-ITS和EF-1a基因序列及UP-PCR遗传多样性分析

对采自辽宁省部分地区的45份玉米顶腐病病株进行分离培养,共获得89株镰孢菌,采用传统形态学分类和现代分子生物学方法,共鉴定出4个种,分别为:亚粘团镰孢菌(Fusarium subglutinans)、轮枝镰孢菌(F.verticillioides)、层生镰孢菌(F.proliferatum)和尖孢镰孢菌(F.oxysporum)。经EF-1a基因序列建立系统发育树,将顶腐镰孢菌分为4个组。用5条通用引物经UP-PCR扩增后,扩增出57条谱带,其中多态性条带53条,占总条带数的93.0%。遗传多样性分析表明,当相似系数0.626时,可将24个菌株划分为4个组,EF-1a基因序列与UP-PCR和ITS序列相比,更能体现镰孢菌种间和种内的亲缘关系及遗传差异性。

3种冠环线虫rDNA-ITS的PCR扩增及序列分析

本试验利用PCR扩增3种冠环线虫5个样品的核糖体DNA内转录间隔区(ITS)及5.8S片段,将PCR扩增产物纯化后直接进行序列测定和分析。序列比对和分析结果显示,所测样品ITS1-5.8S-ITS2的长度范围为748～843bp,总变异位点(包括gaps)119个,简约信息位点18个;其中ITS1和ITS2的长度范围分别为367～370bp和228～320bp,变异位点分别为14个和105个,简约信息位点均为9个。所有测试样品的5.8S片段完全相同,长度为153bp。5条序列ITS1区的G+C含量(48.0%～48.5%)明显高于ITS2区(37.7%～40.3%)。通过序列两两比对,3种冠环线虫ITS1和ITS2的种间差异性分别为1.9%～3.5%和5.6%～31.8%;而种内差异性分别为0～0.5%和0～0.9%。并且所测序列与GenBank中已知序列的同源性为99.07%～99.41%。本研究认为,ITS序列可以作为冠环线虫种类鉴定的分子标记。

黄河故道地区葡萄根结线虫rDNA-ITS-PCR研究

用PCR方法扩增来自黄河故道地区不同区域葡萄根结线虫群体的ITS片段,并进行克隆和序列分析。结果表明,来自6个不同采集点的供试线虫属于同一种群,获得的ITS序列长度为766 bp,与已知南方根结线虫ITS区编码序列一致性达到99.74%;聚类结果显示,与南方根结线虫亲缘关系最近。结合形态鉴定结果,初步确定黄河古道地区葡萄根结线虫病病原为南方根结线虫(Meloidogyne incognita)。

鸽圆环病毒荧光定量PCR检测方法的建立及应用

为了建立鸽圆环病毒(PiCV)的快速检测方法,依据PiCV Rep基因的保守序列区域设计了荧光定量PCR的引物和探针,并建立了快速检测PiCV的荧光定量PCR方法。结果显示,构建的PiCV荧光定量PCR方法在1.44×10,1~1.44×10^(7)/μL拷贝标准品间具有良好的线性关系,线性相关系数达0.9866;该方法具有良好的敏感性,其检测病毒系列含量下限为14.4拷贝/μL;该方法特异性良好,与鸽新城疫病毒、鸽疱疹病毒、鸽腺病毒等病毒及鸽组织DNA不存在交叉反应;该方法重复性较好,批内重复试验变异系数均介于0.454%~0.473%,批间重复试验变异系数均介于0.367%~0.869%。与传统普通PCR方法相比,所建立的PiCV荧光定量PCR方法敏感性更高,临床样品PiCV检出率更高,两者检测符合率为93.75%。结果表明,所建立的PiCV荧光定量PCR方法为临床检测鸽圆环病毒提供了一种快速、灵敏的检测方法,为PiCV的流行病学调查和主动监测提供了技术支撑。

奶牛乳房炎5种致病菌多重PCR检测方法的建立与应用

为建立一种能快速检测奶牛乳房炎主要病原菌(大肠埃希氏菌、无乳链球菌、肺炎克雷伯氏菌、金黄色葡萄球菌和肠炎沙门氏菌)的多重PCR检测方法,根据大肠埃希氏菌phoA基因、无乳链球菌ef-tu基因、肺炎克雷伯氏菌Khe基因、金黄色葡萄球菌Nuc基因和肠炎沙门氏菌invA基因设计特异性引物,优化PCR反应体系与反应程序并进行特异性试验,同时分别构建含病原菌基因的pMD-19T重组质粒进行灵敏性试验。结果显示,多重PCR反应的最适引物工作浓度为0.8μmol/L,最适退火温度为59.6℃,最佳延伸时间为40 s,最合适的循环数为30次;优化后的多重PCR反应体系可扩增出5种目标病原菌的特异性条带;5种病原菌PCR检测灵敏度可达到5 copies/μL。进一步利用该多重PCR反应体系对采集的108份乳房炎乳样进行检测,检测结果显示,108份样本的阳性检出率为77.8%,大肠埃希氏菌、无乳链球菌、金黄色葡萄球菌、肺炎克雷伯氏菌和肠炎沙门氏菌的检出率分别为23.1%、8.3%、34.3%、8.3%、5.6%。结果表明,建立了一种具有良好特异性和灵敏性的多重PCR检测方法,在临床生产实践中可用于快速鉴定奶牛乳房炎的致病菌,为奶牛乳房炎的诊断、防控与流行病学调查提供了方法基础。

三疣梭子蟹附肢再生过程中qRT-PCR内参基因的筛选与Wnt7b表达研究应用

为筛选三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)附肢再生过程中的最适内参基因,以附肢再生不同阶段的三疣梭子蟹为研究对象,利用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)对细胞骨架蛋白基因(β-actin)、甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因(GAPDH)、18S rRNA(18S)、转录延伸因子基因(EF1α)、核糖体蛋白L18基因(RPL18)、细胞色素C氧化酶基因(COX)和组蛋白基因(HIS)共7个候选内参基因在肌肉、眼柄、血淋巴、肝胰腺、鳃、心脏和再生附肢共7种组织中的表达水平进行检测,并利用△Ct、geNorm、NormFinder和BestKeeper程序对候选内参基因的稳定性进行评价,筛选出合适的内参,最后以最适内参基因作为参考,分析再生相关基因Wnt7b的表达水平。结果显示,在不同组织中综合稳定性最好的是RPL18,而在不同再生阶段的再生附肢中β-actin和RPL18基因做双内参基因更适合。以RPL18和β-actin作双内参基因研究Wnt7b的表达水平时发现,Wnt7b基因在三疣梭子蟹附肢再生过程中的表达呈先上升后下降再上升的趋势;Wnt7b基因在三疣梭子蟹各组织中均有表达,除再生附肢和血淋巴外其他组织中的表达量都较低。本研究结果为甲壳类再生发育相关研究内参基因的选择及分子调控机制研究提供了参考。

4种乳菇属真菌的形态学与rDNA-ITS鉴定

为明确内蒙古赤峰地区常见有毒乳菇种类,准确、快速地识别有毒乳菇,将采集的4个乳菇属Lactarius真菌标本采用传统形态学分类方法进行鉴定,同时提取子实体DNA,使用真菌通用引物ITS1/ITS4进行PCR扩增,用Blast对扩增产物纯化测序所得的序列进行比对,采用MEGA5.1软件构建系统发育树确定属和种。结果表明,2种方法鉴定结果一致,标本CFSZ10167为毛头乳菇[Lactarius torminosus(Schaeff.)Pers.],标本CFSZ10216为绒边乳菇[Lactarius pubescens(Fr.ex Kronbh.)Fr.],标本CFSZ13021为灰褐乳菇[Lactarius pyrogalus(Bull.)Fr.],3种均为胃肠炎型毒菌,CFSZ10044为皱乳菇(Lactarius ruginosus Romagn),为中国新记录种,主要特点是菌盖棕褐色、浅褐色,有绒质感,盖缘呈齿状,孢子球形具小刺,食毒不明。对4个种的形态学特征进行了详细描述,并附有生境图片和显微图像,研究结果为乳菇属物种鉴定和资源分布提供了重要补充,并为常见毒菌识别提供了理论依据。

进境太平洋鳕鱼寄生的异尖科线虫rDNA-ITS序列的PCR扩增及分析

以日本进境的冻太平洋鳕鱼体内分离出的异尖科线虫为研究对象,采用寄生虫通用引物NC5和NC2扩增其核糖体DNA(rDNA)的内转录间隔区(ITS)序列,进行克隆、转化、测序和序列分析,并对样品进行分子鉴定。结果表明,扩增的异尖科线虫样品的ITS序列片段大小为906bp,包含部分的18S、28S及全部的ITS1(353bp)、5.8S(157bp)和ITS2(299bp)序列,ITS1和ITS2序列与GenBank登录的伪新地蛔线虫(Pseudoterranova decipiens)同源性均为在99.7%以上,与其他线虫的相似性较低。由ITS1和ITS2序列构建的系统进化树可知,从鳕鱼中分离到的线虫ITS1和ITS2均与伪新地蛔线虫处于同一分支。本研究结果为异尖科线虫种属的确定及进一步的分子生物学研究奠定基础。

鲭鱼中寄生的1种异尖科线虫rDNA-ITS序列的PCR扩增及分析

为了对日本进境的冻鲭鱼体内分离出的异尖科线虫进行研究,试验采用寄生虫通用引物NC5和NC2 PCR扩增其核糖体DNA(rDNA)的内转录间隔区(ITS)序列,并进行克隆、转化、测序和序列分析。结果表明:扩增的异尖科线虫样品的ITS序列片段大小为900 bp,包含部分的18S、28S及全部的ITS1(373 bp)、5.8S(159 bp)和ITS2(272 bp)序列,ITS1和ITS2序列与GenBank中抹香鲸异尖线虫(Anisakis physeteris)同源性均为100%,与其他线虫的相似性较低;从鲭鱼中分离到的线虫ITS1和ITS2均与抹香鲸异尖线虫处于同一分支。

Sequence differences of rDNA-ITS2 and species-diagnostic PCR assay of Anopheles sinensis and Anopheles anthropophagus from China

Anopheles sinensis and An. anihropophagus are two morphologically indistinguishable yet genetically and behaviorally distinct mosquito species that vary dramatically in their importance as vectors of malaria inChina. The sequence of the ribosomal DNA internal transcribed spacer 2 (ITS2) was determined for bothspecies to assess the species differentiation. The lengths of ITS2 was 468 hp for An. sinensis and 452 hp forAn. anthropophagus. Interspecies difference in sequence was 28. 8%. Intraspecies sequence divergence wasnegligible. A PCR method was developed for distinguishing the two species based on the species-specific variations of the ITS2 sequences. The method would amplify a diagnostic fragment in length of 425 hp for An.sinensis and 253 hp for An. anthropophagus. Field collections from 12 localities in 10 provinces of China weretested. In 440 mosquitoes identified by adult morphological characteristics as An. sinensis, 291 (66. 2 % ) wereidentified later as An. sinensis and 56 (12. 7 % ) as An. anthropophagus, the remaining 93 (22. 1 % ) were notamplified by PCR. The results showed that the morphological characteritics of adult was not reliable for fieldidentification. The PCR assay was a simple, fast and reliable method for species identification.

rDNA-ITS在植物病原真菌分子检测中的应用

文章综述了rDNA序列结构特点及ITS序列在植物病原真菌的分类鉴定、分子检测、病害诊断及土壤中病原真菌的检测方面的应用,并对其应用前景进行了评述。

猕猴桃果实贮藏期主要真菌病害的rDNA-ITS鉴定及序列分析

【目的】对陕西省周至县猕猴桃主栽品种‘华优’、‘海沃德’及‘秦美’贮藏期霉烂果实中的病原菌进行分离与鉴定,分析比较病原菌rDNA-ITS序列的差异和种内与种间群体分化状况,确定优势菌,为病害防治提供依据。【方法】采用病原菌形态鉴定与rDNA-ITS鉴定相结合的方法,确定引起猕猴桃霉烂的病原菌种类;通过构建系统发育树,分析病原菌种之间的亲缘关系。【结果】从贮藏期霉烂的猕猴桃果实中共分离出30株病原菌,主要为青霉属(Penicillium)、木霉属(Trichoderma)、交链孢霉属(Alternaria)、毛霉属(Mucor)、拟青霉属(Simplicillium)等5个属。其中青霉属(Penicillium)19株占63.3%,为优势菌,包括Penicillium sp.、Penicillium chrysogenum、Penicillium paneum、Penicillium purpurogenum和Penicillium commune;木霉属(Trichoderma)8株占26.7%较次之,包括Trichoderma longibrachiatum和Trichoderma sp;交链孢霉属(Alternaria)、毛霉属(Mucor)、拟青霉属(Simplicillium)各1株,各占3.3%;聚类分析表明,30株病原聚为五大类群。【结论】引起陕西省周至县‘华优’、‘海沃德’和‘秦美‘猕猴桃贮藏期果实霉烂优势病原菌为Penicillium sp.、Penicillium chrysogenum、Penicillium paneum、Penicillium purpurogenum和Penicilliumcommune;rDNA-ITS区序列在青霉菌属内种间差异鉴别具有较高的参考价值。

微小按蚊复合体rDNA-ITS2序列差异及遗传多态性研究

本研究对我国微小按蚊广西、云南、海南 6个地理株和越南Caonguen株rDNA ITS2PCR扩增片段和序列差异作分析 ,获得基因片段总长为 5 6 1bp～ 5 6 3bp ,发现地理株间ITS2序列差异程度不同 ,分析表明元江株为微小按蚊C型 ;其余 6个地理株为A型。应用限制性内切酶Sau96Ⅰ对微小按蚊复合体rDNA ITS2PCR扩增片段作酶切分型 ,结果同样显示两型差异 。

内蒙古中东部草原羽茅Epichloё属内生真菌的分布及rDNA-ITS序列系统发育

对内蒙古中东部地区分布的羽茅6个地理种群的染菌率进行了调查,采集种子并从中分离得到不同形态型的内生真菌,选取其中的19株进行rDNA-ITS片段的扩增、克隆、测序和系统发育分析。结果表明:(1)6个样地羽茅种群内生真菌感染率除西乌旗为96.7%外,其他5个样地均为100%,表明内生真菌侵染羽茅并非偶然现象,二者之间存在一种稳定的共生关系。(2)ITS和5.8S序列得到的N-J树显示,相对于Epichloё属的其他参考菌株,不同地理种群羽茅中的内生真菌聚为一类,形成一个具有97%支持强度的分支。由此推测,不同地理种群羽茅中的内生真菌具有相同的起源点。(3)结合形态观察结果和rDNA-ITS序列分析结果可以看出,羽茅内生真菌种群的优势种亲缘关系较近,可能起源于同一种内生真菌;但由于其地理分布广、气候差异大、群落类型差别也较大,从而造成不同地理种群内生真菌形态上的分化以及种群间明显的遗传分化和较高的遗传多样性。

进境黄盖鲽鱼寄生的异尖科线虫rDNA-ITS序列的PCR扩增及分析

以俄罗斯进境的冻黄盖鲽鱼体内分离出的异尖科线虫为研究对象,采用寄生虫通用引物NC5和NC2 PCR扩增其核糖体DNA(rDNA)的内转录间隔区(ITS)序列,并进行克隆,转化、测序和序列分析,对样品进行分子鉴定。结果表明,扩增的异尖科线虫样品的ITS序列片段大小为1 034 bp。包含部分的18S、28S及全部的ITS1(431 bp)、5.8S(157 bp)和ITS2(349 bp)序列,ITS1和ITS2序列与GenBank已登记的Hysterothylacium aduncum同源性均在99.5%以上,与其他科线虫的相似性较低。由ITS1和ITS2序列构建的系统进化树可知,从黄盖鲽鱼中分离到的线虫ITS1和ITS2均与H.aduncum处于同一分支。研究结果为异尖科线虫种属的确定及进一步分子生物学研究奠定基础。

旱稻孢囊线虫在广西的发生及其rDNA-ITS异质性分析

2011年,从广西龙胜梯田的水稻根系和稻田土壤中分离到一种孢囊线虫。该线虫形态特征与已报道的旱稻孢囊线虫（Heterodera elachista）相符,其rDNA-ITS序列与GenBank中旱稻孢囊线虫的rDNA-ITS序列相似性为97.7%~99.3%。rDNA-ITS分子发育树表明该线虫与旱稻孢囊线虫以100%的置信度及较小的遗传距离形成一个单系,据此将该线虫鉴定为旱稻孢囊线虫。进一步对本研究获得的10条旱稻孢囊线虫rDNA-ITS区序列及Tanha Maafi等报道的1条旱稻孢囊线虫rDNA-ITS序列（AF498391）的酶切位点进行分析,结果发现AluⅠ、AvaⅠ、MvaⅠ和RsaⅠ4个内切酶的酶切位点在11条序列中完全一致,而Bsh1236Ⅰ、BsuRⅠ和CfoⅠ3种酶的酶切位点存在变异,其中Bsh1236Ⅰ和BsuRⅠ有2种变异型,CfoⅠ则有3种变异型,表明旱稻孢囊线虫的rDNA-ITS序列存在DNA异质性。

rDNA-ITS序列分析在真菌鉴定中的应用

目的:通过对3株真菌的rDNA-ITS序列进行分析,以探讨、说明基于核糖体RNA基因(即rDNA)内转录间隔区(Internal Transcribed Spacer,ITS)的多态性的序列分析(rDNA-ITS序列分析)在真菌鉴定中的应用。方法:通过PCR扩增与测序的方法测得待检真菌菌株的rDNA-ITS序列,从GENBANK获取相似序列,使用BLAST和DNAMAN工具对rDNA-ITS序列进行比对分析。结果:1号真菌菌株与Xylariales sp.LM40(属炭角菌目)同源性高,但尚不能鉴定到具体的属、种;2号真菌菌株可鉴定到种,为草酸青霉Penicillium oxalicum;3号真菌菌株可鉴定到种内组水平,为近平滑假丝酵母III组(最新命名为Candida metapsilosis)。结论:相对于传统的真菌形态学鉴定方法,rDNA-ITS序列分析用于真菌鉴定更客观、省时、简便、快速,但目前也存在一定的应用限制(受基因库的完善程度、高度同源性序列的多少以及具体物种ITS区的可变程度等影响)并不能鉴定出所有真菌,宜与传统的形态学鉴定方法相结合用于真菌鉴定。

中国红麻炭疽病病原菌的分离鉴定及rDNA-ITS序列分析

【目的】明确中国红麻炭疽病病原菌种类。【方法】从河南、安徽、浙江、福建4省红麻主产区采集红麻炭疽病病原菌样本,进行分离、纯化,共获得16个菌株,在致病性测定及形态学特征鉴定的基础之上,从中选取AH、HN、ZJ、FJ 4个典型病原菌菌株,对rDNA-ITS区域进行基因序列分析。【结果】AH、HN、ZJ与FJ炭疽病菌株在形态特征及致病力有明显差异;rDNA-ITS序列实际长度分别为541、545、541、535 bp,AH、HN、ZJ与FJ炭疽病菌株同源性达90%—91%,而AH、HN和ZJ 3个菌株的同源性达96%—98%。【结论】从分子水平上对中国麻区红麻炭疽病病原菌种类进行鉴定分析,证实中国红麻主产区近年炭疽病发生的病原菌类型主要有黑线炭疽菌(Colletotrichum dematium)和胶孢炭疽菌(C.gioeosporioides),其中以黑线炭疽菌致病力较强,胶孢炭疽菌致病力较弱。