Chi-CpG NP的制备及其对rNMB0315蛋白的免疫效果

目的制备黏膜免疫佐剂Chi-CpG NP,并检测其对重组B群脑膜炎奈瑟菌0315蛋白(rNMB0315)的免疫效果。方法用壳聚糖纳米颗粒(Chi NP)包裹免疫刺激分子(CpG-ODN)合成Chi-CpG NP,随后检测其理化性质和安全性。将不同黏膜免疫佐剂与rNMB0315充分混合、吸附,滴鼻免疫雌性BALB/c小鼠,检测PBS组、rNMB0315组、rNMB0315+CpG组、rNMB0315+Chi NP组、rNMB0315+Chi-CpG NP组小鼠免疫42天后的体液免疫(IgG、IgG1、IgG2a、sIgA)、细胞免疫水平[白细胞介素(IL)-4、γ干扰素(IFN-γ)、IL-17A]、免疫保护效果以及血清体外杀菌活性。结果成功制备的Chi-CpG NP呈球形,大小均一,有较好的吸附性能和良好的安全性。小鼠免疫42天后,体液免疫和细胞免疫水平rNMB0315+Chi-NP组、rNMB0315+Chi-CpG NP组高于rNMB0315组(P<0.05);rNMB0315+Chi-CpG NP组高于rNMB0315+CpG组和rNMB0315+Chi-NP组(P<0.05)。致死剂量B群脑膜炎奈瑟菌攻击各组小鼠后,rNMB0315+Chi-CpG NP组小鼠存活率最高;血清体外杀菌抗体滴度为1∶4。结论成功制备了Chi-CpG NP。Chi-CpG NP能增强rNMB0315蛋白的免疫效果,提高小鼠的存活率。

脑膜炎奈瑟菌外膜蛋白NMB0315作为B群流脑疫苗候选抗原的免疫效果

目的研究原核重组表达的B群脑膜炎奈瑟菌外膜蛋白0315(rNMB0315)在诱导小鼠产生特异性免疫应答中的作用、免疫血清抗体体外杀菌活性和重组蛋白的免疫保护效果,初步评价rNMB0315作为B群流脑疫苗候选抗原的潜力。方法将构建的原核表达载体p ET30a-NMB0315转化大肠杆菌BL21表达重组蛋白,纯化鉴定后的重组蛋白免疫雌性BALB/c小鼠,检测体液免疫和细胞免疫水平;测定血清抗体在补体介导下的体外杀菌活性,观察rNMB0315蛋白疫苗对实验小鼠的免疫保护效果。结果 rNMB0315具有良好的免疫原性,能诱导产生较高水平的体液免疫应答:包括血清特异性IgG、IgG1、IgG2a、IgG3、IgG2b和生殖道黏膜特异性分泌型IgA(s IgA),免疫后第6周抗体效价分别为1∶150 000、1∶85 000、1∶60 000、1∶35 000、1∶30 000和1∶30 000;也能激发较高水平的细胞免疫应答,免疫小鼠脾淋巴细胞增殖反应的刺激指数(SI)值明显高于PBS、Freund佐剂对照组。在免疫的2、4、6周,血清IgG2a/IgG1比值均小于1,提示rNMB0315疫苗以诱导Th2细胞性体液免疫应答为主。rNMB0315疫苗免疫血清在补体介导下的体外杀菌抗体效价为1∶128;72 h内,对实验小鼠的免疫保护率为90%。结论原核表达的rNMB0315具有良好的免疫活性和免疫保护效果,NMB0315外膜蛋白具有作为预防B群流脑蛋白疫苗候选抗原的潜力。

B群脑膜炎奈瑟菌外膜蛋白NMB0315核酸疫苗的免疫活性和免疫保护作用初步研究

目的:构建B群脑膜炎奈瑟菌pc DNA3.1(+)/NMB0315真核表达重组质粒,检测其诱导小鼠产生的特异性体液免疫和细胞免疫应答水平、免疫血清体外杀菌效果及免疫保护作用,初步探讨NMB0315核酸疫苗的免疫活性和免疫保护效果,为研制一种新的预防B群流脑的核酸疫苗提供实验依据。方法:以B群脑膜炎奈瑟菌标准株MC58基因组DNA为模板设计引物,PCR扩增NMB0315基因,克隆至pc DNA3.1(+)真核表达载体中,经Bam HⅠ和XhoⅠ双酶切及测序鉴定重组质粒。构建成功的pc DNA3.1(+)/NMB0315重组质粒转染COS-7细胞和RAW264.7细胞,免疫细胞化学染色法和Western blot法检测重组蛋白在真核细胞中的表达。大量提取重组质粒,肌注免疫BALB/c小鼠,检测小鼠体内抗NMB0315的特异性体液免疫和细胞免疫水平;测定免疫血清体外杀菌滴度,观察核酸疫苗对实验小鼠的免疫保护效果。结果:构建的核酸疫苗pc DNA3.1(+)/NMB0315能够在真核细胞中有效转录和表达;免疫小鼠后能诱导产生特异性体液免疫应答和细胞免疫应答。在疫苗免疫后的2、4、6周,pc DNA3.1(+)/NMB0315组和pc DNA3.1(+)/NMB0315+Cp G组血清总Ig G及Ig G1、Ig G2a、Ig G2b和Ig G3亚类抗体水平呈递增趋势,均明显高于PBS、pc DNA3.1(+)、Cp G对照组(P<0.001);小鼠血清Ig G2a/Ig G1比值均小于1;生殖道灌洗液中特异性s Ig A水平均明显高于PBS、pc DNA3.1(+)、Cp G对照组(P<0.01)。免疫第6周,脾淋巴细胞刺激指数(SI)均明显高于对照组(P<0.01,P<0.01,P<0.05)。pc DNA3.1(+)/NMB0315+Cp G、pc DNA3.1(+)/NMB0315疫苗组免疫血清补体介导的体外杀菌效价分别为1∶128和1∶64;在致死量B群脑膜炎奈瑟菌MC58攻击后72 h存活率分别为70%和65%,对照组[PBS,pc DNA3.1(+),Cp G]72 h存活率为0。结论:NMB0315核酸疫苗能够诱导小鼠产生较高水平的体液免疫(包括黏膜免疫)和细胞免疫应答;免疫血清补体介导的体外杀菌活性较高;NMB0315核酸疫苗对感染B群脑膜炎奈瑟菌小鼠具有较强的免疫保护作用。

B群脑膜炎球菌外膜蛋白0315不同形式疫苗免疫效果比较

目的:初步探讨和评价NMB0315核酸疫苗、重组蛋白疫苗及核酸疫苗+重组蛋白疫苗联合免疫诱导小鼠产生的特异性体液/细胞免疫应答水平及其免疫保护效果,为进一步探索NMB0315疫苗有效的免疫方法和途径提供实验依据。方法:大量制备核酸疫苗[pc DNA3.1(+)/NMB0315]和重组蛋白疫苗(p ET-30a/NMB0315),采用核酸初免-蛋白加强的方法联合免疫或分别免疫雌性BALB/c小鼠,测定特异性体液/细胞免疫应答水平、免疫血清体外杀菌效价,观察疫苗对感染B群脑膜炎球菌小鼠的免疫保护效果。结果:NMB0315核酸疫苗组(p NMB0315-Cp G)、蛋白疫苗组(r NMB0315-FA)及联合免疫疫苗组(p NMB0315-Cp G+r NMB0315-FA)诱导的血清特异性Ig G、Ig G1、Ig G2a及生殖道灌洗液中特异性s Ig A水平在第八周达到峰值,A450值分别为(0.505±0.042、0.513±0.022、0.342±0.017、0.250±0.015)、(0.823±0.061、0.807±0.045、0.596±0.027、0.450±0.028)和(0.694±0.053、0.711±0.032、0.455±0.021、0.386±0.024),明显高于PBS对照组(P<0.01);其中,蛋白疫苗组的抗体水平明显高于联合免疫疫苗组和核酸疫苗组(P<0.05)。小鼠脾淋巴细胞刺激指数及IFN-γ水平,联合免疫疫苗组明显高于蛋白疫苗组和核酸疫苗组(P<0.05);核酸疫苗组、蛋白疫苗组和联合免疫疫苗组免疫血清在补体介导下的体外杀菌抗体效价分别为1∶64、1∶128和1∶128,对实验小鼠的免疫保护率分别为70%、95%和80%。免疫2、4、6、8周时,核酸疫苗组、重组蛋白疫苗组和联合免疫疫苗组Ig G2a/Ig G1比值均小于1。结论:NMB0315疫苗诱导的体液免疫(包括黏膜免疫)效果从高到低为:重组蛋白疫苗组、联合免疫疫苗组、核酸疫苗组;诱导细胞免疫的效果从高到低为:联合免疫疫苗组、核酸疫苗组、重组蛋白疫苗组;NMB0315疫苗对实验小鼠的免疫保护效果从高到低为:重组蛋白疫苗组、联合免疫疫苗组、核酸疫苗组。