rPA(K)原核表达产物的复性与纯化

为探索新型rPA(K)在原核系统中表达产物的纯化和复性,采用不同的洗涤剂(脲、Triton X-100、乙醇)依次洗涤包涵体,又经硫酸铵沉淀,得到了经初纯后纯度较高的包涵体.结果表明,经2 mol/L脲1、mL/L TritonX-100、200 mL/L乙醇洗涤,15%饱和度的硫酸铵沉淀后,包涵体的纯度由16.0%提高到56.6%.在此基础上,利用稀释复性和透析复性2种方法对包涵体进行复性,以恢复产物的天然构象,获得具有生物学活性的目的蛋白.结果如下:采用透析复性法,rPA(K)的比活可达1.33×105IU/mg;采用稀释复性法,rPA(K)的比活可达1.06×105IU/mg.利用S.TagTMrEK纯化试剂盒对目的产物进行进一步纯化,并对rEK和MgCl22种洗脱剂的洗脱效果进行了比较.SDS-PAGE结果显示,MgCl2洗脱后的产物,分子量未发生变化,仍为43 ku,其纯度为72%;而rEK洗脱后的产物,其纯度达到了72%,且分子量减小至约40 ku,表明去除了融合蛋白中的非目的片段.

rPA(K)的原核表达及其产物的初步纯化

rPA(K)是经过缺失/定点突变技术所获得的t-PA突变体。本实验以IPTG诱导,实现了rPA(K)在原核系统中的表达。实验证明目的产物的表达形式为包涵体,且当以IPTG诱导3h时,表达量最高,为41%。此后对该表达产物进行了初步纯化,即通过对不同超声破碎次数,包涵体洗涤液(脲,Triton X-100,乙醇)的不同浓度对纯化的影响因素进行了摸索。结果表明,超声2次,2M脲,0.5%Triton X-100,20%乙醇对目的蛋白纯化的效果最好,从而为进一步的纯化和复性奠定基础。