基于16S rRNA基因扩增子测序技术研究云南野生小型哺乳动物肠道菌群多样性

以生活在同一生境,但具有不同进化关系和不同食性的野生哺乳类动物(鼠科、猬科和鼩鼱科)为研究对象,通过16S rRNA基因扩增子测序,分析和比较其肠道菌群。共识别出5378个操作分类单位(OTUs),主要隶属Firmicutes(40.55%),Proteobacteria(34.60%)和Bacteroidetes(13.67%)。Firmicutes和Bacteroidetes是鼠科的优势菌门,Proteobacteria是猬科和鼩鼱科的优势菌门。多样性分析表明,鼠科、猬科与鼩鼱科的肠道微生物多样性及群落结构具有显著性差异;LEfSe分析表明,鼠科中存在更多与复杂碳水化合物发酵相关的细菌,猬科和鼩鼱科中含较多氨基酸发酵菌;益生菌(如Lactobacillus和Lactococcus等)共存于这3类野生小型哺乳类动物中,起调控宿主健康的作用。研究结果揭示,宿主食性与进化关系影响着野生小型哺乳动物肠道菌群结构,而肠道菌群可能在多种方面对宿主起益生作用。

植物内生菌16S rRNA基因扩增子高通量测序中降低宿主污染的方法

植物内生菌能够帮助植物生长,增强其抗逆性与抗病性,研究植物内生菌对了解植物入侵机制、保护生态环境与农业的健康发展具有重要意义。通过阅读相关文献,总结归纳了降低植物内生菌16S rRNA基因扩增子高通量测序(16S-seq)中宿主基因污染的4种方法,即:①寻找特异性错配引物用来扩增细菌16S rRNA基因;②添加特异性阻断物用来抑制宿主16S rRNA基因扩增,如PNA-PCR和LNA-RCR钳位技术;③在文库构建过程中剪切宿主细胞器的16S rRNA基因,如Cas-16S-seq方法;④改变PCR扩增流程,如巢式PCR技术。了解上述各种方法的特点,有助于在植物内生菌16S-seq中选择合适的方法,避免或者减少宿主基因的污染,更准确地进行植物内生细菌群落的研究。

16S rRNA基因序列分析法鉴定病原细菌

目的:运用16S rRNA基因序列分析法鉴定14种细菌,为该方法的临床应用奠定基础。方法:提取细菌DNA,采用通用引物PCR扩增16S rRNA基因片段并测序。将测序结果用Blastn在线软件在Nucleotide数据库中进行序列同源性比对,根据序列同源性鉴定病原细菌。结果:12种细菌可以鉴定到"种",2种细菌可以鉴定到"属"。结论:16SrRNA基因序列分析是一种有效的病原细菌鉴定方法。

垃圾填埋场渗滤液中古细菌群落16S rRNA基因的ARDRA分析

利用特异性的引物对 ,选择性扩增垃圾填埋场渗滤液中古细菌群落的 1 6 S r RNA基因片断 ,在此基础上建立 1 6 Sr DNA克隆文库。经古细菌通用寡核苷酸探针的原位杂交筛选后 ,克隆文库内古细菌 1 6 S r DNA扩增片断的多样性通过ARDRA分析 ( amplified r DNA restriction analysis)而获得。利用 PCR将各重组克隆子内的 1 6 S r DNA外源片断再扩增出来后 ,两种限制性内切酶 -H ha 和 H ae -被分别用于 1 6 Sr DNA克隆片断的限制酶切分析。结果表明 ,随机选出的 70个古细菌 1 6 S r DNA克隆片断被分为 2 1个不同的 ARDRA型 (组 ) ,其中的两个优势型总共占了所有被分析克隆子的6 0 % ,而其余 1 9个型的相对丰度均处于较低的水平 ,当中的 1 4个型更仅含有 1个克隆子。通过对 1 6 Sr RNA基因的 PCR扩增、克隆及其 ARDRA分析 。

中华虎头蟹线粒体16S rRNA和 COⅠ基因的序列比较及其系统进化分析

为研究中华虎头蟹野生群体的种质资源及遗传多样性状况,采用PCR扩增获得中华虎头蟹线粒体DNA的16S rRNA和COⅠ基因片段,分别对其进行序列比较及系统进化分析。16S rRNA和COⅠ基因片段的A+T平均含量分别为67.7%和61.4%,A+T含量显著高于G+C含量。长度为515 bp的16S rRNA基因片段共检测出单倍型4种,多态性位点4个,均为单一变异位点;长度为653 bp的COⅠ基因片段共检测出单倍型11种,多态性位点23个,其中简约信息位点5个和单一变异位点18个。COⅠ基因片段比16S rRNA基因片段具有较大的变异,更适于中华虎头蟹种群的遗传多样性分析。基于16S rRNA和COⅠ基因片段的遗传距离与系统进化分析结果一致,表明中华虎头蟹与梭子蟹科的蟹类亲缘关系最近,方蟹科与沙蟹科的蟹类聚为一支,与传统分类结果基本一致;而脊椎动物2个基因片段的系统进化分析结果不一致。根据16S rRNA基因片段的遗传距离推测出4科7种蟹的大致分化时间发生在古新世至始新世。

16S rRNA基因克隆文库用于菌群分析的效能研究和评价

目的建立16S rRNA基因克隆文库进行菌群相对定量的方法,评价其对细菌的检测效率以及对混合菌群中低含量细菌的分析能力。方法取脆弱类杆菌等9种细菌以相同及级差比例制备细菌悬液,分别用或不用变溶菌素处理后,用试剂盒提取核酸,16S rRNA基因通用引物进行PCR扩增、纯化、连接、克隆和测序,建立16S rRNA基因克隆文库,将序列与数据库进行比对分析。结果相同比例制备的菌悬液,加或不加变溶菌素提取的核酸,掺入的9种细菌均可检出。级差比例制备的菌悬液,加变溶菌素提取核酸,掺入的9种细菌均可检出;不加变溶菌素提取核酸,数量少难裂解的革兰阳性菌双歧杆菌未能检出。混合菌悬液中各种细菌的比例与文库反映的各种细菌的比例有数量对应关系,但不是线性对应关系。结论16S rRNA基因序列分析是一种较好的细菌菌群分析方法,它可以同时检出多种细菌,并能对混合细菌标本进行菌群相对定量,反映菌群中各种细菌的丰度,但不能准确定量菌群中各种细菌的数量。

12种石鲈科鱼类线粒体16S rRNA基因的部分序列分析

分析了5属12种石鲈科鱼类的线粒体16S rRNA基因部分序列特征,并参照RNA二级结构模型区分配对区和非配对区。结果表明,配对区对G有偏好(33.5%),非配对区对A有偏好(38.5%);与配对区相比,非配对区存在更多的变异和系统发育信息。从序列的Jukes-Cantor遗传距离结果看,石鲈科胡椒鲷属Plectorhynchus、矶鲈属Parapristipoma、石鲈属Hapalogenys、髭鲷属Pomadasys、Haemulon属5个属属间的差异水平都接近或超过了其与外类群科间的差异水平。从构建的ME系统发育树结果看,石鲈科鱼类分成二大分支,未能形成单一类群。在亲缘关系上,胡椒鲷属和矶鲈属较近,石鲈属和Haemulon属较近,髭鲷属与其它4个属较远,髭鲷属在鲈亚目中的分类地位可能应提高到科的水平。初步确定研究中选用的16S rRNA基因片段基本适用于石鲈科属间和属内种间关系的研究。

泥鳅和黄鳝18S rRNA基因的克隆与序列分析

通过自行设计引物,扩增且测定了泥鳅和黄鳝18S rRNA基因部分序列,并讨论了后生动物18S rRNA基因的碱基含量变化情况.结果表明,泥鳅和黄鳝的18S rRNA基因部分序列长度均为1204 bp,泥鳅该基因序列GC含量为53.74%,黄鳝该基因序列GC skew为0.082,两条序列同源性为99.67%.将它们和大西洋鲑3个物种的18S rRNA基因与其线粒体12S rRNA,16S rRNA,Cytb和D-loop区4基因进行序列比较,发现核18S rRNA最保守,而线粒体D-loop区基因进化速率最快.从GenBank中选择已测定的4种鱼纲动物和11种脊索动物的同源序列,分别运用NJ法、MP和ML法,构建6种鱼纲动物和13种脊索动物的分子系统树,结果均显示,在鱼纲动物系统树中,6种鱼纲动物被分为软骨鱼类和硬骨鱼类两大支;在脊索动物的系统树中,鱼纲与脊椎动物的四足类形成姐妹群,表明它们在系统发育过程中具有同等重要地位.

中华鳖与砂鳖线粒体DNA 12S rRNA基因序列的比较分析和分子鉴定标记

对中华鳖和砂鳖线粒体DNA12SrRNA基因进行了引物设计、PCR扩增、序列测定和PCRRFLP分析。研究结果表明:中华鳖、砂鳖线粒体DNA12SrRNA基因片段的碱基序列长度相同,均为562bp,其A、T、C、G含量相似,分别为209个(37.2%)、121个(21.5%)、145个(25.8%)、87个(15.5%)和207个(36.8%)、120个(21.4%)、145个(25.8%)、90个(16%)。两序列间共有13处碱基不同,序列差异率为2.31%,中华鳖与砂鳖各自个体间的平均核苷酸序列差异率分别为0.53%和0.36%,种间差异显著;用内切酶MspI酶切两种鳖的12SrRNA基因片段,在砂鳖中可得到大小为519bp和43bp两个片段,而中华鳖无此酶切位点,这可作为准确鉴别中华鳖和砂鳖的分子鉴定标记。从两种鳖线粒体DNA12SrRNA基因片段碱基的显著差异和MspI酶切位点的变化,可以进一步证明砂鳖是不同于中华鳖的鳖属一新种。

浅色黄姑鱼线粒体16S rRNA基因片段序列特征分析

PCR扩增100个浅色黄姑鱼个体的线粒体16SrRNA基因片段序列,得到大约620bp的扩增产物。将其中5个个体的扩增产物进行测序和同源比对,得到468bp可供比对分析的片段。比对结果表明,5条序列包括两个单倍型,两个单倍型之间有1个碱基突变。PCR-RFLP分析结果显示,两个种群的100个样品中98%的个体为其中一种单倍型,只有2%的个体呈另一种单倍型,表明这两个种群的遗传多样性较低。两个单倍型平均碱基组成为:T22.0%,C26.3%,A29.8%,G21.9%,GC含量平均为48.2%。与GenBank中石首鱼科7属9种的11条同源序列比对,得到429个比对位点,其中包括69个简约信息位点、55个单突变子和16个插入/缺失位点。聚类分析显示,浅色黄姑鱼与黄姑鱼亲缘关系较近,与形态分类相符。

拟诺卡氏菌16S rRNA,gyrB,sod和rpoB基因的系统发育分析

为了更好地了解拟诺卡氏菌属(Nocardiopsis)各物种间的系统发育关系,该属现有有效描述种的gyrB,sod和rpoB基因的部分序列被测定,结合16S rRNA基因,对拟诺卡氏菌属进行了系统发育重建。研究发现拟诺卡氏菌属gyrB,sod和rpoB基因的平均相似性分别为87.7%、87.3%和94.1%,而16S rRNA基因的平均相似性则达到96.65%,3个看家基因均比16S rRNA具有更高的分歧度。比较基于不同基因的系统树发现,由gyrB基因得到的系统树拓扑结构与16S rRNA得到的结构在亚群上基本一致。因此,gyrB基因在拟诺卡氏菌属的系统分类上比16S rRNA基因更具优越性。

应用16S rRNA基因序列分析鉴定猪源肠球菌

对河南省不同地区病猪分离的11株疑似肠球菌提取基因组DNA,PCR扩增16S rRNA基因片段,经克隆后测序,并与GenBank中注册的相关肠球菌菌株的16S rRNA基因序列进行比较、绘制系统发育树,进行鉴定。结果表明,4株临床分离株鉴定为粪肠球菌(E.faecalis),7株为屎肠球菌(E.faecium)。首次从分子水平上证实了猪肠球菌在河南省的存在,为临床诊断及分子鉴定提供依据。

哈氏仿对虾线粒体16S rRNA和COⅠ基因的序列比较及其与仿对虾属之间的系统进化分析

为调查研究哈氏仿对虾浙江象山群体的种质资源、物种间的亲缘关系及遗传多样性状况,采用PCR扩增获得哈氏仿对虾线粒体DNA的16S rRNA和COⅠ基因片段,分别对其进行序列比较和系统进化分析。16S r RNA基因片段的T、C、A和G的含量分别是35.76%、19.48%、26.74%和17.88%;COⅠ基因片段的T、C、A和G的含量分别是35.36%、12.68%、30.54%和21.43%;A+T含量显著高于G+C含量。16S rRNA基因片段长度为558 bp,共检测出1种单倍型,没有多态性位点;COⅠ基因片段长度为688 bp,共检测出7种单倍型,6个多态性位点。COⅠ基因片段比16S r RNA基因片段变异丰富,更适于哈氏仿对虾种群的遗传多样性分析。基于16S rRNA和COⅠ基因片段的系统进化分析结果不太一致,结合形态学分析表明,哈氏仿对虾是仿对虾属独立的分支,与细巧仿对虾和亨氏仿对虾种类亲缘关系较近。根据COⅠ基因片段的遗传距离推测出仿对虾属的大致分化时间发生在中新世末期至上新世早期。

猪源绿脓杆菌的分离鉴定及16S rRNA基因同源性分析

从解剖病变为心包炎、纤维素性肺炎、肺脓肿的病死仔猪体内分离到1株细菌,通过形态特征观察、生化试验,将分离菌株初步鉴定为绿脓杆菌。动物致病性试验结果显示,分离菌株对小鼠具有很强的致病性。药敏试验结果显示,分离菌株对氧氟沙星、恩诺沙星高度敏感,对头孢噻肟、庆大霉素中度敏感,对青霉素、氟苯尼考、氨苄西林、阿莫西林、强力霉素、卡那霉素等耐药。将分离菌株的16S rRNA基因序列与Gen Bank中发表的绿脓杆菌序列进行Blast比对,结果表明,分离菌株与绿脓杆菌不同菌株的同源性高达99%以上,进一步确定分离菌株为绿脓杆菌。基于16S rRNA基因序列,使用MEGA 5.05软件,构建系统进化树,结果表明,分离菌株与病人痰液和腹泻婴儿分离菌株的同源性最高,与未加工水果分离菌株同源性最低。

猪附红细胞体16S rRNA基因的序列测定和系统进化分析

从确诊为猪附红细胞体感染的猪场,无菌采集血样,抽提猪附红细胞体基因组DNA,采用真细菌的通用引物进行16S rRNA基因扩增,对扩增产物进行克隆和测序。从3 个地理位置不同的猪场均成功地扩增出长度为1 469 bp的核苷酸序列。系统进化分析表明,3个猪场样品所测序列一致性达99 52%以上,具有相同的基因型,但与国外报道的猪附红细胞体Illinois株同源性为95%,属于同一基因群,但基因型不同;所有种类的附红细胞体和血巴尔通氏体组成同一进化分支,这类血营养菌与支原体科,支原体属的病原最靠近(75%),而与立克次氏体目的病原较远(70%)。上述研究证实,广东所流行的猪附红细胞体是一种新基因型的猪附红细胞体,建议命名为猪附红细胞体广东株型;为反映进化关系,猪附红细胞体和其它血营养菌应划归于支原体科的支原体属。

55株芽孢杆菌16S rRNA基因序列测定与系统发育学分析

采用16S rRNA基因序列分析法对中国工业微生物菌种保藏管理中心(CCIC)保藏的55株枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)进行复核鉴定。菌株经纯化培养,以改良CTAB法提取总DNA,采用细菌16S rRNA通用引物、TD-PCR方法(touchdown-PCR)进行16S rRNA基因序列扩增,PCR产物纯化后直接进行序列测定,序列经人工校对后用Clustal X进行比对分析,最后用MEGA3.1软件构建系统发育树。系统发育分析结果表明:55株枯草芽孢杆菌中有52株菌种与原鉴定结果一致,有3株菌种与原鉴定结果存在差异,其中2株鉴定结果为巨大芽孢杆菌(B.megaterium),另1株鉴定结果为地衣芽孢杆菌(B.licheniformis)。

福寿螺18S rRNA和28S rRNA基因片段的克隆与进化分析

为从分子水平上明确入侵我国的福寿螺在分类学上的地位,采用分子克隆和序列比对的方法,对来自菲律宾及我国广东、广西、浙江等不同地理种群福寿螺的18S rRNA基因和28S rRNA基因片段进行扩增、克隆和序列测定,并同瓶螺科、田螺科和环口螺科相关物种进行系统发育分析。结果表明,获得的福寿螺18S rRNA基因和28S rRNA基因片段长度分别为602bp、325bp,且不同地理种群间碱基序列无差异。通过邻接法(NJ)和最大简约法(MP)构建的系统树基本一致,证实福寿螺隶属于瓶螺科,与田螺科物种亲缘关系较近,而与环口螺科亲缘关系较远。

五鹤续断18S rRNA基因序列的分析

目的研究中药五鹤续断叶18S rRNA基因的序列特征,为五鹤续断分子鉴定提供分子依据。方法采用PCR直接测序技术测定五鹤续断的18S rRNA基因核苷酸序列,并分析其序列组成。结果通过对五鹤续断Dipsacus asperoidesC.Y.cheng et T.M.Ai叶的18S rRNA基因序列进行测序,获得了五鹤续断18S rRNA基因序列特征。结论 DNA测序技术可作为五鹤续断基原鉴定准确而有效的分子鉴定方法,也可为五鹤续断分子鉴定提供基础性资料。

鸭疫里氏杆菌广西分离株16S rRNA基因序列的测定和系统进化分析

选取3株不同血清型的鸭疫里氏杆菌广西分离株GXRA 01、GXRA 07和GXRA 09,利用细菌通用引物,通过PCR方法成功扩增出16S rRNA的部分基因片段,通过克隆、序列测定获得3个分离株16S rRNA基因的核苷酸序列,并与G enB ank中注册的一些菌株的16S rRNA基因序列进行比较、系统进化关系分析发现:3株RA分属两个基因群,I群(GXRA 01)与AY 871818和AY 871819的16S rRNA序列的同源性达99.9%,Ⅱ群(GXRA 07、GXRA 09)与G enB ank中16S rRNA序列的同源性达99.3%-99.6%,GXRA 07与GXRA 09之间的同源性为100%,表明这3株菌株应为鸭疫里氏杆菌。

暗纹东方鲀线粒体DNA16S rRNA基因克隆、测序与在分子系统发育分析中的应用

以暗纹东方鲀（Takifugu fasciatus）肝脏线粒体DNA为模板，按照红鳍东方鲀线粒体DNA序列设计合成特异引物进行PCR扩增，获得了暗纹东方鲀线粒体DNA 16S rRNA基因（1667bp）及3′端上游的tRNALeu基因（73bp）的全序列。16S rRNA碱基组成分别为：胸腺嘧啶（T）22．1％，胞嘧啶（C）23．6％，腺瞟呤（A）35．2％，鸟嘌呤（G）19．0％。运用DNA分析软件对暗纹东方鲀与GenBank中鲀形目其他23种鱼类的mtDNA 16S rRNA序列进行核苷酸同源性比较分析，分别在鲀形目和东方鲀属水平上利用多种鱼类DNA 16S rRNA序列构建分子系统树。结果显示，同目不同科间的16S rRNA序列核苷酸相似性在73．6％～87．4％之间，同属间的核苷酸相似性高达约99．0％。在属间、科级、亚目级水平上，利用较长的16S rRNA序列构建的NJ树和MP树在拓扑图总体趋势相似，各枝的支持率较高。而在东方鲀属内中选取同源性较高的16S rRNA部分序列构建分子系统树拓扑结构虽一致，但各枝的支持率不太高。因此认为，16S rRNA基因较适合于研究鲀形目鱼类中属间、不同种间以及分化较早的种间、科级、亚目级的系统发育分析。本研究结果有助于进一步利用线粒体基因研究分析鲀形目鱼类系统进化关系。