基于多交叉置换扩增和纳米生物传感技术快速检测肺炎支原体方法的建立

目的建立一种简单、灵敏、快速的肺炎支原体(MP)检测方法,并对其应用性进行验证和评价。方法利用多交叉置换扩增(MCDA)技术对肺炎支原体特异基因CARDS毒素基因进行扩增,利用侧流免疫层析生物传感(LFB)技术读取扩增结果,命名该方法为MP-MCDA-LFB。分析扩增反应在60~67℃(间隔1℃)的扩增效率,筛选最适反应温度;分析分别扩增10、20、30、40 min时能够检测到的最低核酸浓度,筛选最佳反应时间。利用10倍系列稀释的肺炎支原体核酸分析MP-MCDA-LFB方法的灵敏度和检测限,利用35株非肺炎支原体菌株分析MP-MCDA-LFB方法的特异性。利用MP-MCDA-LFB方法检测80份疑似MP感染的临床样本,并与RT-PCR法检测结果进行比较,分析MP-MCDA-LFB方法的临床应用性。结果MP-MCDA-LFB能够实现对肺炎支原体CARDS毒素基因的快速检测。其最佳反应温度为63℃,最短反应时间为40 min,整个检测过程可在1 h内。MP-MCDA-LFB方法具有较高的灵敏度和特异性,其检测限低至45 ng/L,与其他临床表现相似的病原体无交叉反应,特异性为100%。MP-MCDA-LFB方法从80份临床样本中检出45份阳性样本(56.3%),检出率与RT-PCR方法一致。结论本研究建立的以CARDS毒素基因为靶标的MP-MCDA-LFB检测方法具有简单、快速、灵敏度高、特异性强的优点,在基层医疗机构和现场检测具有较好的应用潜力。

“一锅法”等温核酸扩增策略联合荧光定量侧流层析技术对多种细菌16S rRNA的超灵敏检测

致病菌对人类健康构成了极大的威胁,因此及时、灵敏地检测病原体是确诊感染源、预防疾病传播和改善患者治疗的关键。最近的研究表明,细菌的16S rRNA包含了种间差异信息,而典型的细菌则拥有约10000个16S rRNA拷贝。因此,使用16S rRNA作为检测模板对于低浓度病原体的即时检测(POCT)具有重大意义。

基于nuc基因的环介导等温核酸扩增可视化技术检测食源性金黄色葡萄球菌

金黄色葡萄球菌食物中毒主要是由食用被金黄色葡萄球菌及其所产生的肠毒素污染的奶、肉、蛋、糕点、剩饭等蛋白或淀粉含量丰富的食品引起,快速精准的金黄色葡萄球菌检测技术对于保障人们的健康和食品安全具有重要意义。本研究以nuc基因作为检测靶基因,建立了一种检测金黄色葡萄球菌的环介导等温核酸扩增(LAMP)技术。该方法检测金黄色葡萄球菌基因组DNA样品为阳性,而对单细胞增生李斯特菌、鼠伤寒沙门菌、肠出血性大肠杆菌、空肠弯曲菌、小肠结肠炎耶尔森菌和产气荚膜梭菌等食源性致病菌和猪链球菌、胸膜肺炎放线杆菌和多杀性巴氏杆菌等猪源细菌基因组DNA检测结果均为阴性,表明建立的LAMP方15法具有较好的特异性。灵敏度的检测结果表明,LAMP的检测限可达5.6×10^(1) CFU/mL,而常规PCR的检测限为5.6×10^(5) CFU/mL,即LAMP的检测灵敏度比常规PCR高出10000倍。临床样品的检测结果表明,50份猪肉样品中有4份检出金黄色葡萄球菌。本研究为食源性金黄色葡萄球菌提供了一种快速、可视化、特异性好、灵敏度高、成本低的LAMP检测方法。

上海市临床基因扩增检验技术人员上岗培训应急网络教育模式研究

目的探讨网络教育模式在应急上海市临床基因扩增检验技术人员上岗培训中是否有效。方法选取2020年(现场教育)、2022年(网络教育)临床基因扩增检验技术人员上岗培训人员分别1720人和1841人,以及2022年3月新型冠状病毒核酸检测临时证(网络教育)培训人员1028人,通过不同培训方式的成绩、不同学员来源和满意度调查结果进行比较,探讨应急情况下网络教育的可行性。结果2020年、2022年临床基因扩增检验技术人员上岗培训和2022年3月新冠病毒核酸检测临时证培训人员成绩比较差异有统计学意义(P<0.05);2020年、2022年临床基因扩增检验技术人员上岗培训成绩无统计学意义。结论网络教育模式对上岗培训成绩未有影响,人员来源可能会影响培训结果,因此后续应持续更新培训课程,提示反馈机制,建立应急培训课程,完善培训平台。

“临床基因扩增检验技术”课程思政教学探究——以新疆医科大学为例

文章首先阐述了“临床基因扩增检验技术”课程的特点,然后从明确课程思政教学目标、精心设计课程思政教学内容两个方面论述了“临床基因扩增检验技术”课程思政教学实践,最后说明了“临床基因扩增检验技术”课程思政教学效果。

基于重组酶介导等温扩增技术的羊口疮病毒核酸检测方法的建立及初步应用

为建立羊口疮病毒(Orf virus,ORFV)核酸的快速检测方法,本研究根据ORFV B2L基因保守序列设计特异性引物,通过优化反应温度与时间初步建立了基于重组酶介导等温扩增技术(RAA)的ORFV检测方法。优化试验结果显示:该方法在37℃反应40 min检测效果最佳。采用该方法对ORFV、山羊痘病毒、O型和A型口蹄疫病毒、小反刍兽疫病毒、山羊副流感病毒3型等临床常见症状相似的病毒核酸检测,结果显示:该方法除对ORFV的检测结果为阳性外,对羊的其他病毒的检测结果均为阴性,特异性较强。将质粒标准品10倍倍比稀释(1×10^(9)拷贝/μL~1×10^(0)拷贝/μL)后为模板,利用本研究建立的RAA方法检测,结果显示:该方法对ORFV质粒标准品的最低检测限为1×10^(4)拷贝/μL,敏感性较高。利用本研究建立的方法对95份临床样品(15份组织样品和80份血液样品)检测,结果显示:该RAA方法能够对临床样品快速检测,组织样品和血液样品的阳性率分别为33.33%(5/15)和6.25%(5/80),该检测结果与普通PCR检测方法的符合率均为100%,表明本实验建立的RAA方法能够满足临床样品的检测需求。本研究建立的ORFV RAA方法具有操作简单、特异性强、反应快速等特点,为ORFV的快速检测提供新的技术选择。

转基因作物外源转基因成分环介导等温扩增技术检测方法的建立及应用

【目的】建立转基因作物外源转基因成分环介导等温扩增技术检测方法。【方法】以转基因作物中常用的花椰菜花叶病毒35S启动子(CaMV35S)为主要研究对象,利用环介导等温扩增技术(loop-mediatedisothermal amplification,LAMP),针对CaMV35S基因的6个区域设计4种特异引物,利用1种链置换DNA聚合酶(Bst DNA polymerase)在65℃保温1h,通过荧光显色即可完成对转基因作物鉴定工作。同时对7种转基因作物进行LAMP检测。【结果】该LAMP方法通过特异性检测含有CaMV35S启动子的转基因作物,其检测结果的特异性与常规PCR方法结果一致,灵敏度是常规PCR的10倍。【结论】转基因作物LAMP检测方法具有高度的特异性及稳定性,结果可靠,非常适合转基因作物的快速检测,有较好的应用价值。

利用RACE技术扩增大豆抗病基因同源cDNA 5′末端序列

利用抗病基因保守序列筛选大豆cDNA文库,获得一抗病基因同源cDNA片段,命名为KR3-1。根据KR3-1设计两个基因特异引物(GSP和NGSP),分别与通用引物(UPM)和巢式通用引物(NUP)共同扩增,成功地克隆到了该基因的5’末端序列。该扩增片段长447bp,与已知序列重叠部分为129bp。

PCR扩增rRNA基因在细菌菌种鉴定中的应用

PCR技术以其快速及准确的优点已广泛应用于微生物检测与菌种鉴定中。本文重点从 16SrRNA序列、16S～ 2 3SrRNA间隔序列、5SrRNA序列及tRNA基因序列扩增四个方面介绍了近年来PCR技术在细菌菌种鉴定中的应用。

环介导等温扩增技术检测含有CaMV35S的转基因玉米

DNA环介导等温扩增技术是一种特异、灵敏、快速的新型基因检测技术。针对玉米表达载体的花椰菜花叶病毒35 S启动子(CaMV35S)的6个区域设计4种特异引物,对LAMP反应的MgSO4、dNTPs、Betaine、内引物、外引物各个成分进行了优化,此外还对LAMP和PCR两种不同方法的特异性进行了比较。建立转基因玉米花椰菜花叶病毒35 S启动子环介导等温扩增技术检测方法,LAMP与PCR相比具有更高的灵敏度。环介导等温扩增技术检测方法具有时间少,成本低,特异性高,检测方法多样等优势,为检测转基因玉米花椰菜花叶病毒35 S启动子提供了一种更加简便快速的方法。

多重连接依赖的探针扩增(MLPA)技术在广州地区RhD阴性献血者基因分型研究中的应用

目的采用新型Rh血型系统的MLPA检测试剂盒,对广州地区收集的200名RhD阴性献血者进行基因分型。方法采用传统的血型血清学方法,对RhD阴性献血者进行RhD表型鉴定。提取基因组DNA,采用MLPA检测试剂盒对收集的200名RhD阴性献血者进行RHD基因分型。对于不能明确分型的标本,进行RHD基因直接测序分析。结果在200名RhD阴性献血者中,采用MLPA方法对196名进行了明确的基因分型。其中,127名为RHD基因缺失(占63.5%);仅检测到包含RHD1227A突变的DEL等位基因有41例,其中38例包含杂合等位基因,其余3例包含纯合等位基因;仅检测到RHD(1-2)-CE(3-9)-D(10)等位基因的有23例,其中19例杂合,4例纯合;3例包含2种不同的RHD等位基因(1条为RHD(1-2)-CE(3-9)-D(10),另1条为RHD1227A);其余2例分别包含杂合的DFR-2(RHD-CE(4)-D)及弱D15型(RHD845A)等位基因。在其余4例直接测序分析的标本中,2例包含杂合的RHD711delC突变;1例1条等位基因为MLPA检测到的包含RHD1227A突变的DEL等位基因,另1条为包含711delC突变的RHD等位基因;其余1例的1条等位基因为MLPA检测到的RHD(1-2)-CE(3-9)-D(10),另1条为包含新突变的RHD等位基因(1154G>T,385Gly>Val)。结论 MLPA检测试剂盒是适用于中国人群的1种快速、有效的高通量基因分型方法,能够对中国人群常见的各种RHD基因型进行明确分型,适用于参比实验室相关疑难标本的基因分型检测。也可应用于中国人群常见的Del表型检测,使Del表型患者不必再输注RhD阴性血液,节约稀有的RhD阴性血液资源。

抗虫转Bt基因水稻外源转基因成分环介导等温扩增技术检测方法的建立及应用

以转基因Bt水稻品种科丰6号为主要研究对象,利用环介导等温扩增技术(Loop-Mediated Isothermal Amplification,LAMP),针对cry1Ac晶体蛋白毒素基因的6个区域设计4条特异性引物,利用一种链置换DNA聚合酶(Bst DNA polymerase)在65℃保温30min,通过荧光显色完成对转基因检测工作。结果显示,该LAMP方法能够特异性检测cry1Ac基因,其最低定性检测限是传统PCR方法的10倍。本研究建立的针对转基因水稻cry1Ac基因的LAMP检测方法具有高度的特异性及稳定性,结果可靠,非常适合转基因抗虫水稻的快速检测。

环介导等温扩增技术检测转基因组分的研究进展

随着越来越多的转基因作物获得商业化生产和种植,转基因农产品的安全问题一直都有异议,因此,无论对消费人群还是政府监管部门,快速检测转基因组分都是非常必要。转基因组分的检测通常以核酸为基础进行检测,而环介导等温扩增技术(LAMP)是一种等温条件下核酸扩增技术,具有高特异性、高灵敏度、操作简单、成本低廉、结果可视化及不需要专用设备的特点,已逐渐用于转基因组分的检测中。本文针对LAMP技术的原理、优点、关键技术及其在转基因大豆、玉米、水稻等农产品中的应用做一综述,从而为其更广泛的用于转基因组分的检测提供理论依据。

应用解旋恒温基因扩增技术检测沙门氏杆菌

为寻求快速简便的检测沙门氏杆菌及其他病原生物新方法,以沙门氏杆菌invA基因为目的片段,设计特异性引物,通过条件优化,建立了检测沙门氏杆菌的HDA法,用4株沙门氏杆菌和6种其他病原菌(大肠埃希菌、志贺氏菌、变形杆菌、绿脓杆菌、葡萄球菌、链球菌)考核特异性,用稀释法测定灵敏度.结果表明,本研究建立的HDA法可在恒温水浴锅中进行,扩增时程75 min;阳性检测率为100%,无假阳性;用HAD法检测12份饲料样品,结果检出沙门氏杆菌呈阳性的3份,阳性率为25%.HDA法极适合基层实验室使用.

应用二次PCR技术提高体外基因扩增的效率

自1985年Mullis等创立PCR技术以来,作为一种基因研究的新方法,在传染病、遗传病、肿瘤及基因工程的诊断和研究等许多领域内得到广泛应用,是分子生物学研究技术的重大突破.PCR方法灵敏、特异、简便、快速,但实验受诸多因素的影响,可以造成非特异性扩增产物或扩增产物的产量不足等,使实验达不到预期结果.为此我们建立了PCR二次扩增方法,弥补了第一次扩增有时出现的缺陷,提高了扩增效率.

全基因组扩增技术在产前诊断中的应用

目的:探讨全基因组扩增技术(WGA)结合微阵列比较基因组杂交技术(Array-CGH)在低DNA浓度的产前样本中的应用价值。方法:对18例有产前诊断指征的孕妇进行侵入性产前诊断,所抽取的羊水或绒毛样本经DNA提取后因DNA浓度较低行全基因组扩增,再应用微阵列比较基因组杂交技术分析。结果:所检测的18例样本中,有3例异常,均提示为45,X0,其余芯片结果正常。随访15例正常a CGH结果的胎儿,有9例出生后正常。结论:应用WGA技术辅助微阵列比较基因组杂交技术对早孕期超声提示异常的胎儿进行产前诊断是可行的,它不仅缩短了发报告的时间也保持了应用a CGH技术检测的敏感性和精确性。

基因扩增技术在牛早期胚胎性别鉴定中的应用

家畜早期胚胎性别鉴定是近年来胚胎工程领域研究的重点 ,而基因扩增技术在胚胎性别鉴定的应用为实现家畜性别的人为控制带来了新的希望。目前用于牛胚胎性别鉴定的基因扩增方法主要有PCR法和LAMP法等。文章对SRY基因、动物性别决定的生物学机理和用于牛早期胚胎性别鉴定的基因扩增技术作一简要综述。

临床基因扩增检验实验室技术审核中存在的问题分析

聚合酶链反应（PCR）应用初期因规范性问题，曾被全面暂停在临床应用。经过PCR技术工作规范的制订和技术人员培训，卫生部于2002年出台《临床基因扩增检验实验室管理暂行办法》和《临床基因扩增检验实验室工作规范》，重新向临床开放PCR检测项目。2010年卫生部出台《医疗机构临床基因扩增检验实验室管理办法》，加强对临床基因扩增检验实验室的管理。