基于16SrRNA和16S-23SrRNA基因间隔区序列探讨陆生和水生螺原体菌株的系统发生关系

采集江苏省养殖池塘内发病的中华绒螯蟹、克氏原螯虾和南美白对虾,利用已有螺原体16S rRNA和23S rRNA基因序列保守引物扩增并测序16S rRNA和16S-23S rRNA基因间隔区序列(ISRs).基于已获得的序列和GenBank中下载的螺原体序列分别进行同源性比对,比对的结果分别利用PAUP软件和MrBayes软件提供的最大似然法和贝叶斯法进行系统发生关系分析.分析结果是:所有淡水甲壳动物螺原体菌株Spiroplasma erio-cheiris(中华绒螯蟹)、Spiroplasmasp.CRAYFISH(克氏原螯虾)、Spiroplasmasp.SHRIMP(南美白对虾)严格聚为一支,并且与陆生兔扁虱螺原体(非凡螺原体)Spiroplasma mirum关系最近,而与中国报道的陆生植物螺原体菌株Spiroplasmasp.CR-1(油菜)、Spiroplasmasp.CNR-1(油菜)、Spiroplasmasp.CNR-2(油菜)、Spiroplasmasp.CAN-1(杜鹃花)、Spiroplasmasp.CRW-1(红花酢浆草)及昆虫螺原体菌株Spiroplasmasp.CH-1(蜜蜂)、Spiroplas-masp.M10(蜜蜂)关系较远,此外,3个淡水甲壳动物螺原体菌株与现今唯一报道的海水南美白对虾螺原体Spi-roplasma penaei系统发生关系也很远.因此,在螺原体属中,我国发现的淡水甲壳动物螺原体近缘种是非凡螺原体而不是我国陆生昆虫或植物螺原体及美洲的南美白对虾螺原体.

rRNA基因间隔区序列用于亲缘关系密切的根瘤菌种群鉴定及系统发育分析

通过rRNA基因内转录间隔区的碱基序列分析,对中华根瘤菌属Sinorhizobium、慢生根瘤菌属Bradyrhizobium和中慢生根瘤菌属Mesorhizobium种间亲缘关系十分密切的菌株进行区分.结果表明,rRNA基因间隔区序列能很好地区分种间亲缘关系十分密切的菌株.用rRNA基因间隔区序列构建的系统发育树与rRNA基因序列构建的系统发育树结果十分相似.

橐吾属药用植物5S rRNA基因间隔区序列与含HPAs植物的鉴别

目的对橐吾属Ligularia药用植物的5SrRNA基因间隔区序列进行测定,为含肝毒吡咯里西啶生物碱(HPAs)植物的鉴别提供分子依据。方法对12种橐吾属植物的5SrRNA区序列进行PCR扩增、测序,并运用CLUSTAL、MEGA等软件对所测序列进行了排序、对比和分析。结果建立了12种橐吾属药用植物的5SrRNA区序列数据库,橐吾属植物在该区间具有显著的种间差异,替代数为3～53,变异位点数128个,信息位点数58个。结论含HPAs的橐吾属植物的5SrRNA区序列具有明显而稳定的特异性鉴别位点,可用作该类型植物鉴别的分子标记。

中华绒螯蟹颤抖病螺原体分布及16 S-23 S rRNA基因间隔区序列的分析

为了探究中华绒螯蟹颤抖病螺原体(Spiroplasma eriocheiris)在江苏省的分布,以2003年至2009年从江苏省养殖池塘收集的发病中华绒螯蟹(Eriocheir sinensis)为研究对象,利用螺原体体外培养、光电镜检测和16 S-23 S rRNA基因间隔区序列比较等方法进行了系统分析。结果表明,S.eriocheiris是一种广泛分布于江苏省养殖中华绒螯蟹体内的病原微生物,它们不仅在7月底8月初的高温季节引起中华绒螯蟹发病和暴发性死亡,还能在3月和11月等低温季节引起部分中华绒螯蟹的发病和死亡,其严重危害中国江苏省中华绒螯蟹养殖业的健康发展。

基于叶绿体psbA-trnH和核糖体5S rRNA基因间隔区序列的石斛种间和种内鉴别

采用直接测序法对12种石斛叶绿体psb A-trn H基因间隔区序列和核糖体5S r RNA基因间隔区序列进行测序,用克隆测序法对叠鞘石斛dq-2品种和dq-5品系(各20份样品)psb A-trn H基因间隔区序列进行测序,所得序列采用Squencher4.14拼接后,采用Bioedit 7.0软件对获得的psb A-trn H基因间隔区序列和5S r RNA基因间隔区序列进行序列比对和排序,用Dnasp5.0软件分析序列核苷酸多态性,用MEGA 5.2计算种内和种间kimura2-parameter(K2P)遗传距离,并构建系统发育树(NJ树).结果显示,石斛叶绿体psb A-trn H基因间隔区序列平均长度为742.3 bp,有72个变异位点,其中信息位点33个;核糖体5S r RNA基因间隔区序列平均长度为336.4 bp,存在213个变异位点,其中信息位点139个;以上两个基因片段的组合序列,能对叠鞘石斛、铁皮石斛、球花石斛、细叶石斛、细茎石斛、齿瓣石斛、鼓槌石斛、尖刀唇石斛和金钗石斛等9种石斛进行有效鉴别,可揭示铁皮石斛不同居群间的差异,而且可根据该组合序列中存在的一个单核苷酸多态性位点(Single Nucleotide Polymorphism,SNP)对叠鞘石斛dq-2品种和dq-5品系进行区分.本研究表明,psb A-trn H基因间隔区序列和5S r RNA基因间隔区序列组合后显示出多序列组合策略在石斛种间和种内的分子鉴别中的优势,可为石斛属植物及药材鉴别提供分子依据.

唐松草及近缘植物ITS序列和5S rRNA基因间隔区序列的分析

通过对毛茛科的唐松草(ThalictrumL.)及其近缘植物黄连、毛茛和芍药科的牡丹等植物的ITS序列和5S rRNA基因间隔区的克隆、扩增及构建系统发育树的分析研究,结果显示,唐松草扩增后ITS序列长607 bp,5SrRNA基因基因间隔区序列长323 bp;系统树证明唐松草属与黄连属和毛茛属的亲缘关系较近,结合形态学与化学等其它学科证据,本研究结论支持唐松草和黄连在进化上更接近,为含木兰花碱生物碱及毛茛甙植物的鉴别以及毛茛科相关植物的亲缘关系初步提供了分子依据.

牙龈卟啉菌rRNA基因间隔区的序列测定

目的 通过rRNA基因间隔区碱基序列测定 ,建立对牙龈卟啉菌 (Pg)菌株进行鉴定的技术。 方法 利用种特异性引物对PgrRNA基因间隔区进行套式PCR扩增 ,用 glass -milk纯化PCR扩增产物 ,对纯化的扩增产物进行碱基序列测定。结果 琼脂糖凝胶电泳结果显示 ,PgrRNA基因间隔区PCR扩增产物为0 .88kb ,经放射活性测序反应技术测得PgrRNA基因间隔区的碱基序列。结论 rRNA基因间隔区DNA扩增后进行测序 ,对Pg菌株鉴定是一种精确、重复性好的分子遗传学方法。

广西莱姆病螺旋体5s-23srRNA间隔区基因的克隆和序列分析

目的对广西莱姆病螺旋体分离株基因型鉴定。方法应用聚合酶链反应从3株广西莱姆病螺旋体及1株贵州分离株全基因组DNA中将5S -23SrRNA间隔区基因调出 ,并克隆至质粒PGEM -T中 ,构建重组质粒 ,测序后与国外其它分离株进行同源性比较。结果4株莱姆病螺旋体均扩增出约242bp的5s-23srRNA间隔区基因 ,同源性99%以上,与B.valaisiana基因型的同源性均比其他基因型高 ,同源性97.1 %～97.9 %。结论4株莱姆病螺旋体均属于B.valaisiana基因型 。

坛紫菜rbcS及rbcL-rbcS基因间隔区的序列分析

Rubisco是光合作用和光呼吸的关键酶,目前已成为高等植物中研究最深入的酶之一,而在低等藻类中关于该酶的相关研究却很少。以来自浙江和福建的6个坛紫菜(Porphyra haitanensis)无性系为研究对象,以江苏条斑紫菜(P.yezoensis)为参照,克隆了其Rubisco小亚基(rbcS)及大小亚基基因间隔区共516 bp的序列。序列分析结果表明,其中4个坛紫菜系(Hza、Hzf、Hpt、Hzz)的基因序列完全相同(以其作为标准),坛紫菜Hzb和Hzc与其均只有1个碱基差异,而条斑紫菜Yn55与其差别碱基为46个。将本实验的7条紫菜序列与GenBank数据库收录的17条紫菜Rubisco序列一起做系统分析,结果表明坛紫菜和条斑紫菜都分别归到了各自的类群中。以上结果说明,紫菜rbcS和rbcL-rbcS基因间隔区序列的同源性较高,可用于种以上水平的系统分析。

小秦艽rRNA基因内转录间隔区测序鉴定的初步研究

目的 :对小秦艽种籽中提取的DNA中rRNA基因内转录间隔区进行碱基序列测定 ,以期从分子水平建立对秦艽种籽的鉴定标准。方法 :常规提取小秦艽种籽DNA ,利用合成的特异性引物对其DNA中rRNA基因内转录间隔区进行套式PCR扩增 ,将扩增产物以四色荧光标记的双脱氧末端终止循环法进行碱基序列测定。结果 :经琼脂糖凝胶电泳证实rRNA基因内转录间隔区PCR扩增产物存在 ,测序后得到了小秦艽种籽rRNA基因内转录间隔区的碱基序列。结论

桑树TrnL-trnF基因间隔区序列的特点及分析

设计桑树TrnL trnF基因间隔区序列的特异引物 ,扩增并分析了桑属育 71 1和桑莲 2个品种的TrnL trnF基因间隔区序列 ,其长度分别为 4 14bp和 4 17bp ,且富含A/T。该序列有 4 2 1个分析性状 ,具有 17个变异位点。在这些变异中主要以碱基的插入和缺失 (主要是插入 /缺失dA)为进化形式 ,其余的发生了少数置换。除这些变异位点以外的核苷酸序列完全相同 ,说明两者有高度同源性 ,与桑科、菊科和蔷薇科的TrnL trnF基因间隔区序列有一定同源性。用Clustalx软件对 2 1份材料的TrnL trnF基因间隔区序列进行聚类分析 。

水稻条纹病毒RNA4基因间隔区序列分析——混合侵染及基因组变异证据

克隆和测定了我国水稻条纹病毒 (RSV) 2 2个分离物RNA4基因间隔区 (Intergenicre gion,IR)序列 ,序列比较结果表明 ,我国RSVRNA4IR在长度上存在 63 4bp、65 4bp及 73 2bp 3种不同的类型 ,其中 3种不同类型的序列在云南省均有存在 ,而在其它省份仅存在 65 4bp类型的序列 ,云南省还存在不同片段类型序列在同一分离物中混合侵染的现象。序列内部具有两个重要的结构特征 ,一是具有插入序列 ;二是有两处反向重复序列 ,可形成两个明显的发夹结构 ,其中一个序列比较保守 ,形成的发夹结构稳定 ;但另一个发夹结构由于碱基变异导致其稳定性在各个分离物中差异较大。本论文还讨论了插入片段特性。

rRNA基因ITS区序列分析在粘帚霉属生防菌株种级分类上的应用

对分离自不同地域的粘帚霉属不同种类的生防菌株rRNA基因转录间区进行了克隆测序,用Clustal X软件进行自动排序,用Njplot程序构建系统进化树.供试26个粘帚霉菌株分在4个组,与传统形态分类结果一致,同一种类的不同来源的菌株差异不明显.研究表明,可以根据ITS区DNA序列差异对粘帚霉属进行种级分类,但不能用于区分种内不同地域的菌株之间的差别.

马铃薯卷叶病毒基因间隔区的克隆及序列分析

根据已报道的马铃薯卷叶病毒基因组序列．设计合成一对特异性引物，以马铃薯卷叶病毒中国分离株（ＰＬＲＶ－Ｃｈ）的ＲＮＡ为模板，反转录合成ｃＤＮＡ第一条链，经ＰＣＲ扩增后克隆于ｐＵＣ１９质粒中，进一步用ＰＣＲ鉴定、限制酶切分析和序列分析，结果表明：ＰＬＲＶ－Ｃｈ基因间隔区由１９７个核苷酸组成，与国外报道的荷兰ＰＬＲＶ－Ｎ加拿大ＰＬＲＶ－Ｃ，澳大利亚ＰＬＲＶ－Ａ，苏格兰ＰＬＲＶ－Ｓ各株系核苷酸序列具有很高的同源性，同源率依次为９９％、９８％、９３％、９８％。

赤潮铜绿微囊藻rDNA基因间隔区的序列分析以及与淡水微囊藻的比较

采用ＰＣＲ及序列测定的方法，对在厦门西港海域采集的赤潮铜绿微囊藻１６Ｓ和 ２３５ｒＤＮＡ基因间隔区Ｉｎｔｅｒｇｅｎｉｃ Ｓｐａｃｅｒ Ｒｅｇｉｏｎ （ＩＳＲ）区进行了序列测定和分析，并通过与两 种淡水微囊藻的比较，找出了其特征性核苷酸作为专一性分子探针设计的靶序列，为该藻 种以及微囊藻属的快速鉴定及系统学研究提供了分子基础。

马铃薯卷叶病毒(PLRV)内蒙古分离物基因间隔区(IS)的克隆与序列分析

根据Genbank已报道马铃薯卷叶病毒(PLRV)基因组序列,分析其基因间隔区(IS)两端的保守区,自行设计、合成一对特异性引物,以PLRV内蒙古分离物总RNA为模板,经RT-PCR扩增得到含PLRVIS的一段369 bp的cDNA,克隆于载体pBS-T中。重组质粒经PCR鉴定、酶切分析和核苷酸序列测定,并进一步与PLRV其他分离物的同源序列作比对。结果表明:克隆的PLRV内蒙古分离物的IS序列与其他全部已发表的13个全基因组中的IS核苷酸序列有很高的同源性,最高达到100%,平均为97.90%,高于这13个PLRV全基因组序列96.81%的同源性,说明IS序列不仅在PLRV的不同株系间比较保守,而且在PLRV的全基因组序列中也是相对保守的。研究结果预示,将IS构建成RNA干扰型结构导入马铃薯,将有可能获得抗PLRV多种株系且抗性更高的转基因植株。

红豆杉科及相关类群叶绿体rbcL基因与trnL-trnF间隔区序列的分支分析

运用对PCR产物克隆后测序和对PCR产物直接测序的方法对红豆杉科、三尖杉科和罗汉松科 16种植物的叶绿体rbcL基因和trnL -trnF基因间隔区序列进行了测定。选用PAUP软件分别对rbcL基因、trnL_trnF间隔区和rbcL基因—trnL_trnF间隔区联合数据矩阵进行分支分析 ,结果显示 :①穗花杉属以置于红豆杉科内为宜 ,将穗花杉属独立成科的意见未得到支持 ;②三尖杉属内篦子三尖杉地位特殊 ,赞同成立篦子三尖杉组 ;③罗汉松科属单系群 ,竹柏类应归属罗汉松科 ,不同意将其从该科中分离出来成立新科竹柏科 ;④不支持红豆杉科独立成目 ,其单生单轴球果可能是由复合双轴球果减化而来。

水稻条纹病毒两个分离物RNA4基因间隔区的序列比较

通过RT PCR扩增了我国水稻条纹病毒 (RSV)山东济宁 (JN)、云南宜良 (YL)两个分离物RNA4基因间隔区 (intergenicregion ,IR)序列 ,并克隆于 pGEM Teasy载体上。序列分析结果表明 :JN、YL两分离物RNA4IR均由 6 5 4个核苷酸组成 ,两者之间的同源率为 92 %。JN、YL两个分离物RNA4IR在AU碱基富集处可形成两个明显的发夹结构 ,其中一个序列比较保守 ,形成的发夹结构稳定 ;但另一个由于碱基变异导致所形成的发夹结构的稳定性在各个分离物中差异较大。

新城疫病毒V4株NP和P基因及其间隔区序列的克隆与分析

采用RT-PCR技术克隆了新城疫病毒(NDV)V4株长约4 200 bp的核苷酸序列,并进行了序列测定与分析。结果表明,该序列中包含有NDV V4株NP基因编码区、NP和P基因间隔区以及P基因的全部核苷酸序列。NDV V4株NP和P基因与其他8个NDV毒株相应部分进行同源性比较,与Quuesland V4株的同源性最高。NDV V4株NP和P基因间隔区序列与其他13株NDV毒株相应部分的比较结果表明,F48E9等强毒株较La sota等弱毒、无毒毒株和试验用V4株在这个区域多了6个碱基,这6个碱基插入的位置在La sota等弱毒、无毒毒株全基因组序列的1647-1648 nt处;参比的14株NDV在这个区域的同源性为63．9％-100％,弱毒株之间的同源性较高,弱毒株与强毒株之间及强毒株之间的同源性差异较大。

山丘疫区杜氏利什曼原虫核糖体基因内转录间隔区的克隆及序列分析

目的 构建我国山丘疫区杜氏利什曼原虫分离株前鞭体核糖体DNA(rDNA)内转录间隔区 (ITS)片段克隆 ,并进行测序及同源性分析。 方法 提取杜氏利什曼原虫前鞭毛体DNA进行PCR扩增 ,将扩增出rDNAITS片段克隆入pMD18 Tvector上 ,双脱氧链末端终止法测序。 结果 扩增出约 10 0 0bp的rDNAITS片段。测序结果表明山丘疫区的2株利什曼原虫L .d .SC10和L .d .6分别为 10 2 7bp和 10 2 8bp。序列分析结果表明 ,L .d .SC10和L .d .6有一定差异。 结论 获得了我国山丘疫区杜氏利什曼原虫分离株L .d .SC10和L .d .6的前鞭体rDNAITS序列。