柏大蚜和松大蚜体内细菌的16S rRNA-RFLP分析

利用16SrRNA-RFLP方法分析了同一样地柏大蚜和松大蚜体内细菌的组成。结果表明:2种蚜虫体内细菌主要由其初级内共生菌Buchneraaphidicola和次级内共生菌Candidatus Serratia symbiotica组成,但各自所占的比例存在差异;在柏大蚜克隆文库中,B.aphidicola和Ca.Serratia symbiotica分别占37%和56%,还有少量的霍氏肠杆菌(Enterobacter hormaechei)占7%;在松大蚜克隆文库中,B.aphidicola和Ca.Serratia symbiotica分别占66.7%和33.3%。表明2种蚜虫体内的微生物组成比较简单且相似,内共生菌种类相同。

蒙古国传统发酵乳中部分乳杆菌16S rRNA-RFLP的分类

采用16S rRNA-RFLP技术对分离自蒙古国乌兰巴图周边地区酸马奶中部分乳杆菌进行分类和鉴定。结合HaeIII,AluⅠ和HinfⅠ三种限制性内切酶RFLP的分析,将26株乳杆菌鉴定为Lactobacillus helveticus(18),actobacillus plantarum(7)和Lactobacillus casei(1)。在此基础上采用了16S rRNA基因序列分析的方法对本研究的26株乳杆菌进行验证,实验结果与16S rRNA-RFLP鉴定结果相吻合,表明此方法是一种快速、准确用于大量乳杆菌分类和鉴定的方法。

两种林木植原体病害的分子鉴定

近年来,林木植原体病害发生日趋严重,对我国林业经济和生态造成了很大损失。2021年-2022年,在山西沙棘主产区的沙棘上和北京冬奥园区的油松上分别出现了典型的植原体病害症状;沙棘叶片皱缩,呈小叶状;油松过度分枝生长且出现球状结构等。本研究通过荧光显微观察,16S rRNA和tuf基因序列分析,并结合虚拟限制性片段长度多态性分析证实了这两种病害均由植原体引起。基于16S rRNA的系统进化分析显示:引起沙棘叶片皱缩的植原体与泡桐丛枝植原体(Paulownia witches’-broom phytoplasma,OP107515.1)的相似性最高(99.92%),引起油松丛枝的植原体与狗尾草丛枝植原体株系(Setaria viridis witches’-broom phytoplasma,FJ263625.1)的相似性最高(99.52%);基于tuf基因的系统发育树显示,二者同属于16SrⅠ组D亚组(16SrⅠ-D)。本研究首次明确了沙棘叶片皱缩病和油松丛枝病相关植原体的分类地位,为这两种植原体病害的准确诊断、快速检测及其防治提供了基础资料。

日本弓背蚁肠道细菌群落的季节特征（英文）

【目的】在长期的进化过程中,蚂蚁和微生物之间建立了复杂的联系,尤其肠道微生物对蚂蚁的食性进化和物种分化产生了巨大的影响。弓背蚁属Camponotus蚂蚁消化道内普遍存在内共生菌Blochmannia及其他肠道细菌,这些细菌在寄主蚂蚁营养补充方面发挥了重要的作用,此外肠道微生物对食物类型的变化十分敏感,这些信息可能有助于调查寄主蚂蚁在不同季节的取食习性。本研究旨在揭示弓背蚁属蚂蚁肠道微生物是否存在季节特征。【方法】采用16S rRNA-RFLP方法分析比较了了2个日本弓背蚁蚁巢（巢1和2）的工蚁在4个月份时间点（2012年6月12日,8月15日和10月10日,2013年4月15日）的肠道菌群组成。【结果】在8个样品中共发现了17个属的细菌和1种未知细菌,弓背蚁属蚂蚁特有的内共生菌Blochmannia是优势细菌,出现在所有样品中,占67.1%~98.8%;假单胞菌属Pseudomonas和肠杆菌属Enterobacter在大多数的样本中都检测到,其他属的细菌则零星分布在个别样品中,只占较低的比例。两个蚁巢工蚁肠道菌群在4个月份没有呈现一致的变化趋势,都具有低的细菌多样性。在巢1中,4月和10月的肠道细菌多样性相对较高,在6月和8月较低;而在巢2中,8月的肠道细菌多样性明显高于4,6和10月。两个蚁巢6月和10月的肠道菌群组成相似,但是8月和4月差异较大。【结论】日本弓背蚁两个蚁巢的工蚁肠道菌群组成和多样性都随季节产生变化,但是没有呈现一致的变化趋势,没有表现出明显的季节特征。

人工栽培蛹虫草退化现象的分子分析

利用PCR-RFLP和RAPD方法对野生驯化蛹虫草及其退化菌种进行了基因水平的分析。PCR-RFLP实验,采用真菌通用引物ITS1和ITS4,扩增出5.8S和其两端的两个转录间隔区(ITS),选用5种识别四个碱基的内切酶(HaeIII、AfaI、TagI、AluI和XspI),其中只XspI酶切结果在两个菌种中存在差异,进一步测序表明,整个片段全长534bp,共有13个位点发生碱基突变,且都为c转换为t。RAPD实验,选用4组计80个随机引物进行PCR扩增,共筛选出9个对所有供试个体均存在明显差异的引物。结果表明了退化菌株较野生驯化菌株在DNA水平上发生了频率较高的突变,这些突变可能直接与导致菌种退化的基因相关联。

用于分子生态学研究的堆肥DNA提取方法

分子生态学为堆肥微生物的研究提供了新的技术手段,DNA的提取是该技术的基础,但由于腐殖酸类物质的污染,增加了堆肥微生物总DNA的提取难度.采用了3种不同的方法(溶菌酶法、超声波破碎法和蛋白酶K-CTAB法)从堆肥中提取微生物的总DNA,使用核酸和蛋白质分析仪检测后表明3种提取方法获得的DNA产量均较高;琼脂糖凝胶电泳结果表明其长度约为23 kb;使用细菌16S rRNA基因通用引物(27F和1 495R)对总DNA进行PCR扩增,都获得了几乎全长的16S rDNA序列(约1.5 kb);利用限制性内切酶(HaeⅢ和AluⅠ)对纯化后的PCR产物进行RFLP分析,结果表明3种方法提取的DNA反映了比较一致的微生物多样性.虽然3种方法各有优缺点,但其提取的DNA都可以用于堆肥微生物的分子生态学研究,可以根据实际需要选用某一种方法用于提取堆肥总DNA.

我国南北大豆产区慢生大豆根瘤菌的遗传多样性和系统发育研究

利用16S rRNA基因RFLP、16S rRNA基因序列分析以及16S-23S rRNA IGS PCR RFLP技术对分离自我国南北大豆产区的慢生大豆根瘤菌进行了群体遗传多样性和系统发育研究。16S rRNA基因PCR RFLP分析以及16S rRNA基因序列分析结果表明:所有供试慢生大豆根瘤菌可分为B.japonicum和B.elkanii两个类群,其中属于B.japonicum的为优势种群,占供试菌株的91%,属于B.elkanii的仅占9%,多样性水平较低。16S-23S rRNA IGS PCRRFLP研究结果表明:属于B.japonicum的慢生根瘤菌具有较丰富的遗传多样性,在69%的相似性水平上可分为群Ⅰ和群Ⅱ两大类群。群I的菌株以分离自黑龙江和河北等北部区域的菌株为代表,群Ⅱ的菌株以分离自广西和江苏等南部地域的菌株为代表,反映出明显的地域特征。两群菌株在系统发育上均与USDA6、USDA110和USDA122等B.japonicum的模式或代表菌株有差异。

“传统”垃圾填埋场渗滤液中古细菌16S rRNA基因的RFLP分析

“传统”垃圾填埋场渗滤液中古细菌群落的多样性通过不依赖于培养的分析而获得。将渗滤液中古细菌的16S rRNA基因片断(16S rDNA)选择性地扩增出来并用于构建16S rDNA克隆文库。文库内古细菌16S rDNA的遗传变异性通过RFLP分析(限制性内切酶Hha Ⅰ和HaeⅢ)而得到。80个随机选出的古细菌rDNA克隆子被划分为29个不同的RFLP型(组),其中最大的5个型共占所有被分析克隆子的53％左右,而其余24个型的丰度均处于相对较低的水平,其中16个型更仅含有1个克隆子。有关结果表明,对克隆16S rDNA片断的RFLP分析是评估复杂厌氧系统中微生物群落多样性的有力工具。

我国主要生态区域绿豆慢生根瘤菌的遗传多样性和系统发育研究

利用16SrRNAPCR-RFLP、16SrRNA序列分析以及16S-23SrRNAIGS(IntergeneticSpacer)PCR-RFLP技术对分离自中国主要生态区域的44株慢生型绿豆根瘤菌和5株参比菌株进行了遗传多样性和系统发育研究。16SrRNAPCR-RFLP分析表明:在76%的相似水平上,所有供试菌株可分为三大类群:群I由LYG1等13株慢生根瘤菌组成,该群在系统发育上与B.japonicum和B.liaoningense的参比菌株存在一定的差异;群Ⅱ由XJ1等21株供试菌株、B.japonicum和B.liaoningense的代表菌株组成;群Ⅲ由10株来自广东和广西的菌株和B.elkanii的代表菌株组成。16S-23SrRNAIGSPCR-RFLP分析将供试菌株分为A、B两大群。群A由34株供试菌株、B.japonicum和B.liaoningense的代表菌株组成。在85%的相似性水平上,可再分为AⅠ、AⅡ和AⅢ3个亚群。群B由10株分离自广西和广东的菌株和B.elkanii的代表菌株组成。在85%的相似性水平上,可再分为BI和BⅡ两亚群,表现出一定的多样性。与16SrRNAPCR-RFLP相比,16S-23SrRNAIGSPCR-RFLP具有更高的解析度,供试菌株表现出更加丰富的遗传多样性。分离自中国新疆、广东和广西等地的菌株在分群上具有较为明显的地域特征。

新疆棉花根际土壤铁载体产生菌的遗传多样性及系统发育研究

【目的】了解中国新疆地区铁载体产生菌的遗传多样性和系统发育,为筛选高效铁载体产生菌提供依据。【方法】采用BOXAIR-PCR、16S rRNA PCR-RFLP和16SrDNA全序列分析方法对分离自新疆地区棉花根际土壤的铁载体产生菌的遗传多样性进行分析。【结果】在BOXAIR-PCR分析中,68株供试菌分为11个遗传群;在16SrRNAPCR-RFLP分析中,68株供试菌分10个遗传群;代表菌株的16SrDNA全序列分析表明,供试菌分属于假单胞菌属(Pseudomonas)、肠杆菌属(Enterobacter)、不动细菌属(Acinetobacter)、芽孢杆菌属(Bacillus)、产碱杆菌属(Alcaligenes)、短状杆菌属(Brachybacterium)和泛菌属(Pantoea)。其中,假单胞菌属(Pseudomonas)为优势属。【结论】分离自新疆地区棉花根际土壤铁载体菌存在极大的遗传多样性。

用16S rRNA基因的内切酶图谱快速鉴别几种对虾病原菌

坎普氏弧菌是青岛海洋大学生物系微生物实验室于1989－1990年自对虾养殖场中国对虾红腿病虾心脏及血淋巴中分离并鉴定的菌株，副溶血弧菌和溶藻胶弧菌两菌株于1994年9月得自中国科学院微生物研究所。为建立快速、准确的中国对虾病原菌的诊断技术，根据几种细菌的16SrRNA基因的序列，设计并合成该基因的多聚酶链反应的引物PLI和PL2。用该对引物分别从坎普氏弧菌、副溶血弧菌和溶藻胶弧菌的DNA样品中扩增出分子量与原设计相同的DNA片段，然后用AluI内切酶对3种细菌的多聚酶链反应产物进行酶切，形成3种不同的限制性内切酶图谱。研究结果证明，用16SrRNA基因的限制性内切酶图谱，可快速、准确地鉴别3种对虾病原菌。

16种商品海参16S rRNA的PCR-RFLP鉴定方法

基于570bp左右的线粒体16SrRNA基因片段,利用3种核酸内切酶(DdeI,Hae Ⅲ和Sty Ⅰ)对16种海参PCR产物进行酶切,分别产生10种、5种和5种单倍型,通过单倍型的组合,即能有效区分16种海参的种类。运用此方法对19种商品海参(包括冻品和干品)进行鉴定,结果表明,9种产品属于错误贴标。本研究建立的PCR-RFLP方法方便、有效,可靠,可为海参产品评估、进出口种类鉴定提供实用高效的方法。本研究旨在为市场海参产品贴标情况的评估提供技术支撑。

花生根瘤菌群体遗传多样性和系统发育研究

利用 16SrRNARFLP、16SrRNA序列分析和 16S～ 2 3SIGSPCRRFLP技术对 4 3株花生根瘤菌和来自其他种属的 15个参比菌株进行了群体遗传多样性和系统分析。 16SrRNAPCRRFLP分析结果表明 ,所有供试花生根瘤菌均属于慢生根瘤菌属 ,在系统发育上与B .japonicum的亲缘关系最近 ,具有相同的 16SrRNARFLP基因型 ,而与B .elkanii相对较远。 16SrRNA序列分析结果表明 ,供试花生根瘤菌在系统发育上更接近于B .liaoningense ,序列间差异小于 1% ,而B .liaoningense在系统发育上与B .japonicum相距很近 ,其序列间差异小于 1%。 16S～ 2 3SrRNAIGSRFLP分析结果表明 ,尽管花生根瘤菌与B .japonicum和B .elkanii的亲缘关系很近 ,但在 71%的相似性水平上供试花生根瘤菌仍各自聚为一群 ,并可进一步分为A、B、C和D 4个亚群 ,该分群还明显反映了地理因素对群体遗传多样性和系统发育的影响。

利用RFLP分型方法鉴定牛源性链球菌和肠球菌

为分离及种属鉴定引起牛乳腺炎相关的链球菌和肠球菌,本研究于兰州及周边地区采集疑似奶牛乳腺炎乳样382份,通过THB(Todd-Hewitt Broth)固体选择培养基初步分离到67株疑似链球菌或疑似肠球菌。参照已发表文献合成链球菌属16S r RNA和16S^23S r RNA间隔区基因引物序列,扩增分离菌株16S^23S r RNA间隔区序列,产物分别利用AluⅠ和RsaⅠ单酶切消化,并以参考菌株的16S^23S r RNA酶切图谱为参考,对分离株进行限制性片段多态性(RFLP)分类分析;再选取各RFLP类群的任一菌株,扩增其16S r RNA基因并测序,并经NCBI核酸数据库进行比对,结果显示67株疑似链球菌中有53株为粪肠球菌(79.1%)、3株为屎肠球菌(4.5%)、3株为肠道肠球菌(4.5%)、8株为无乳链球菌(11.9%)。结果表明肠球菌属细菌(粪肠球菌、肠道肠球菌、屎肠球菌)与兰州市及周边地区奶牛乳腺炎的发病紧密相关,肠球菌属细菌与链球菌属细菌16S r RNA基因同源性很高,但可以通过分子生物学方法准确区分。

大黄鱼冰鲜杂鱼饲料中细菌多样性研究

为研究大黄鱼(Larimichthys crocea)冰鲜杂鱼饲料中细菌的多样性,用细菌通用引物构建了细菌16S rRNA基因克隆文库。从文库中随机挑选125个克隆子进行限制性片段长度多态性(RFLP)分析,得到82个不同的RFLP带型。对部分代表性克隆子进行测序,得到23条有效序列。序列同源性分析和系统进化分析结果表明,大黄鱼冰鲜杂鱼饲料中细菌主要分为3大类群,其中γ-变形菌纲(γ-Proteobacteria)细菌占据明显地优势地位,约占所分析克隆子数的84.4%;其次是黄杆菌纲(Flavobacteria)细菌,约占10.9%;还有少量的梭杆菌纲(Fusobacteria)细菌,约占4.7%。γ-变形菌纲细菌中以嗜冷杆菌(Psychrobacter sp.)最多,其次是发光杆菌(Photobacterium)。

内蒙古土默川平原葡萄酒相关酵母多样性研究

考察酿酒葡萄中酵母菌种的多样性,分别采用形态学及基于酵母5.8S rRNA-ITS区域的RFLP分析法对内蒙古土默川平原酿酒葡萄中的酵母菌种进行了鉴定。结果表明,该地区葡萄酒相关酵母分属于5个属的6个酵母菌种,分别为葡萄汁有孢汉逊酵母(Hanseniaspora uvarum)、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、东方伊萨酵母(Issatchenkia orientalis)、克鲁维毕赤酵母(Pichia kluyveri)、异常毕赤酵母(Pichia anomala)及星形假丝酵母(Candida stellata)。实验表明,该地区酿酒葡萄中的酵母菌种具有多样性;此外,采用形态学及分子生物学相结合的方法可以快速、准确地对酵母菌种进行鉴定。

绣线菊丛枝病病原的分子鉴定

用植原体16S rRNA基因的通用引物,对表现黄化、丛枝、顶枯等症状的绣线菊DNA进行PCR扩增,得到了约1.2kb的特异性片段。测序结果证明其病原为植原体。RFLP和序列分析表明:该分离物属于翠菊黄化组的16SrⅠ-B亚组。与GenBank中其他植原体分离物序列比较,发现该分离物与16SrⅠ-B亚组中的西方翠菊黄化植原体(SAY)同源性高达99.6%。

渝西地区奶牛隐孢子虫的分离和基因型鉴定

为鉴定渝西地区奶牛隐孢子虫分离株的种类和基因型,本研究利用巢氏PCR(Nested PCR)扩增18S rRNA基因,PCR产物进行限制性片段长度多态性分析(Restriction fragment length polymorphism analysis,RFLP);将目的片段克隆至pGEM-T Easy载体,对阳性克隆进行测序,序列用BLAST和MEGA 4.0进行同源性和种系发育分析。结果表明阳性样品均成功扩增出约830bp的目的基因片段,PCR产物分别经SspⅠ和MboⅡ酶切后进行RFLP分析,显示渝西地区存在3种隐孢子虫,即C.andersoni、C.bovis、C.ryanae。其中C.andersoni为优势虫种。鉴定结果为进一步开展奶牛隐孢子虫的病原生物学研究及该地区隐孢子虫病的监测奠定了基础。

山羊奇异变形杆菌分离鉴定及其16S-23SrRNAISR序列RFLP分析

2012年初,山东菏泽某羊场的羊群发病,从发病羊器官分离到2株病原细菌。对病原细菌进行鉴定,并对其与已知同种异源菌株相似性差异进行分析。从患病山羊内脏器官分离细菌,经形态特征、培养特性、生化试验、血清学试验及致病性试验进行鉴定;再通过设计通用引物扩增16S-23SrRNA ISR(intergenic spacer region)序列,将PCR产物经HinfⅠ单酶切获得3条可视条带,同时对扩增条带中的主带测序并进行系统发育分析。结果表明,分离菌株为奇异变形杆菌;分离菌株同本实验室保存的兔源与鸡源奇异变形杆菌PCR-RFLP结果一致;分离菌株PCR产物同GenBank收录的HI4320株奇异变形杆菌及本实验室保存的兔源与鸡源奇异变形杆菌进行序列比较,分离羊源菌株与兔源菌株相似性为94.8%、与鸡源菌株相似性为96.0%～98.2%,与人源HI4320株相似性为96.9%。研究证实发病羊致病病原为奇异变形杆菌,其与鸡源、兔源和人源奇异变形杆菌的亲缘关系较近。

鄱阳湖水体细菌群落组成及遗传多样性

利用建立细菌16S rRNA基因文库和限制性内切酶长度多态性（RFLP）分析的方法,对鄱阳湖南、北湖区水体的细菌多样性进行了研究.结果表明,鄱阳湖水体细菌多样性较高,且南湖区2007年水体的细菌多样性明显高于其2006年水体和北湖区水体.主要细菌组成分析表明,鄱阳湖水体中的349个阳性克隆代表的167种基因型分别属于十大细菌类群,变形菌门（Proteobacteria）在4个克隆文库中占据了47%-81%,数量极其丰富,尤其是亚型的β-变形菌为优势菌群;拟杆菌门（Bacteroidetes）和放线菌门（Actinobacteria）也广泛分布,且有2.9%-17.1%的克隆数属于未分类细菌.研究结果进一步提示鄱阳湖水体有一定程度的富营养化.