抗弓形虫重组SAG1抗原单克隆抗体的制备与鉴定

目的制备抗弓形虫SAG1单克隆抗体(McAb)。方法将pET32(a)-trSAG1重组质粒转化EscherichiacoliBL21(DE3),用0.1mmol/LIPTG诱导表达,超声破菌后获得可溶性表达产物,通过Ni-NTA一步法纯化,以纯化的rSAG1为抗原,免疫BALB/c小鼠,采用杂交瘤技术制备McAb,用ELISA和有限稀释法筛选出分泌高滴度McAb杂交瘤细胞株,测定其免疫球蛋白亚类及其效价,Western blot分析其特异性。结果筛选出能稳定分泌抗rSAG1单克隆抗体的5株杂交瘤细胞株,抗体重链均为IgG1,轻链均为κ链;Western blot分析显示,5株单抗均能与弓形虫速殖子超声抗原中的天然SAG1发生特异性结合。结论制备的抗rSAG1杂交瘤细胞株能分泌识别SAG1的高特异性单抗,为进一步研究其在弓形虫病免疫诊断中的应用奠定了基础。

弓形虫SAG1重组抗原的特征及其应用的研究

用昆虫细胞中表达的弓形虫主要表面抗原（SAGI）为试剂检测弓形虫IgG抗体。方法将昆虫细胞中表达的重组蛋白（rSAGI）通过单克隆抗体制备的亲和层析柱纯化．用纯化的rSAGI为抗原试剂检测弓形虫病血清，与其他试剂盒检测结果比较，然后再用免疫印迹试验确认．结果重组杆状病毒Bac304感染的Sf9细胞与空载bacmid感染的细胞比较，Bac304的SDS裂解物比空载株在SDS—PAGE考马斯亮蓝染色胶上明显多出一条带，分子量约为30kDa．在恒定条件下，分批收集Bac304感染的昆虫细胞，用免疫荧光鉴定，95％以上的细胞可被感染．在Balb／C小鼠中生产的抗SAGI的单抗XllA10C与Bac304的表达产物发生反应，用纯化的单抗与CNBr—Sepharose4B偶联制备的亲和层析柱从1．3X109感染Bac304的昆虫细胞裂解液中获得1．4mgrSAGI，以纯化rSAGI为抗原，采用EIA法检测了412份妇产科就诊者及不明原因淋巴结肿大等病人血清，检出弓形虫lgG抗体阳性13例，其中10例经全虫体蛋白印迹法确认为阳性．结论昆虫细胞表达的重组SAG1能识别人弓形虫病血清，可以用作诊断试剂．

青海省牛弓形虫病的ELISA诊断及试剂盒建立

用弓形虫的重组蛋白SAG1作为ELISA诊断抗原,建立了ELISA诊断试剂盒,并对青海省牛群进行弓形虫病的血清学诊断。经对所收集的1856份牛血清进行弓形虫抗体检测,共检出阳性血清71份,阳性率约为3.83%。结果表明青海省牛群中存在弓形虫病的感染。

小鼠脾内免疫法制备重组弓形虫SAG1抗原单克隆抗体

目的制备小鼠抗重组弓形虫SAG1抗原单克隆抗体,用于早期弓形虫感染的抗原检测。方法用弓形虫RH株重组抗原SAG1进行常规免疫结合小鼠脾内免疫,杂交瘤技术制备单克隆抗体。ELISA法筛选阳性克隆,经亚克隆建株。诱生腹水法制备抗体,protein-G亲合层析法进行纯化,测定其亚类、效价;Westernblot法分析其特异性;夹心-ELISA法检测抗体的敏感性及特异性;检测弓形虫感染小鼠血液循环抗原,同时用PCR法检测弓形虫B1基因并比较结果。结果获得2株抗重组弓形虫SAG1抗原单克隆抗体3B6、10C4,抗体均为IgG1,轻链均为κ链,Western blot显示2株单抗均能识别弓形虫天然的和重组的SAG1抗原。3B6、10C4敏感度分别为31.3ng和62.5ng,与血吸虫病、钩虫病及疟疾患者血清均无交叉反应。弓形虫早期感染检测PCR及ELISA法阳性检出率分别为63.2%、47.4%。结论成功制备小鼠抗重组弓形虫SAG1抗原单克隆抗体,初步用于早期弓形虫感染诊断。