重组痘苗病毒rVTT-JEVE理化特性研究

目的痘苗病毒作为疫苗载体具有接种途径简单、高滴度、低成本等优点,重组痘苗病毒投入使用之前进行理化特性试验,对重组痘苗病毒的生产、运输和保存有一定重要意义。方法将重组痘苗病毒rVTT-JEVE作热、酸、碱、乙醚、氯仿、胰蛋白酶、超声波以及紫外线处理,然后接种到BHK-21细胞上,观察rVTT-JEVE毒价的变化,分析理化因素对rVTT-JEVE的影响。结果在pH3～9范围内,酸碱度变化不会引起rVTT-JEVE毒价的显著变化。rVTT-JEVE经50℃处理60min、30min和60℃处理15min可被灭活；对5%的氯仿敏感；经终浓度0.5%的胰蛋白酶37℃作用1h,病毒毒价降低2个滴度；对25%的乙醚不敏感；经40KHz超声波处理60min和80KHz处理30min即可灭活；30W紫外灯垂直距离10cm照射15min、30cm照射30min即可灭活。结论 rVTT-JEVE耐热、酸、碱、乙醚、氯仿及胰蛋白酶,对超声波、紫外线较敏感。

欧洲型PRRSV、PCV2二联重组痘苗病毒疫苗猪体免疫实验研究

目的评价实验室构建的欧洲型PRRSV和PCV2二联重组痘苗病毒猪体免疫效果。方法分别用重组痘苗病毒rVTT-PCV2-ORF2-EU-ORF3-ORF5和rVTT-EU-ORF3-ORF5进行猪体免疫试验,每周采血,分离血清,采用ELISA检测病毒特异性抗体、中和抗体检测及细胞因子水平,评价免疫效果。结果 rVTT-PCV2-ORF2-EU-ORF3-ORF免疫组35d时,猪血清欧洲型PRRSV GP3和GP5及PCV2ORF2特异性抗体,显著高于野毒组(t=6.61,t=9.21,t=10.34,P<0.05);猪血清中和抗体35d时,各免疫组均可产生较高的免疫水平,差异均无统计学意义(t=0.48,P>0.05);重组痘苗病毒疫苗rVV-ORF2-EU-ORF3-ORF5免疫可诱导IL-4和IFN-γ产生,增强猪体细胞免疫应答水平。结论欧洲型PRRSV、PCV2二联重组痘苗病毒疫苗能诱导猪体产生体液和细胞免疫应答,为欧洲型PRRSV、PCV2的新型疫苗研究奠定了实验基础。

乙型脑炎重组痘苗病毒候选疫苗小鼠安全性评价

目的对重组痘苗病毒候选疫苗rVTT-JEVE进行动物安全性评价。方法用重组痘苗病毒rVTT-JEVE对BALB/c小鼠进行免疫接种,分别在体液免疫及细胞免疫水平上评价其免疫效果;并通过检测小鼠体内rVTT-JEVE病毒残留,分析乙型脑炎重组痘苗病毒候选疫苗rVTT-JEVE的安全性。结果 BALB/c小鼠经两次免疫接种后,重组痘苗病毒rVTT-JEVE组IgG抗体水平是商品疫苗SA-14-14-2组的1.4倍(t=3.704,P<0.05),中和抗体效价是SA-14-14-2组的1.6倍(t=4.418,P<0.05),T淋巴细胞增殖水平为SA-14-14-2组的1.7倍(t=3.092,P<0.05)。rVTT-JEVE接种小鼠后第1d各脏器均有rVTT-JEVE病毒残留,第3d颌下淋巴结已无病毒残留,第7d仅脾脏和雄性小鼠心脏有少量病毒残留,之后均无病毒残留。结论重组痘苗病毒候选疫苗rVTT-JEVE免疫小鼠可产生较好的免疫效果及免疫安全性。

乙型脑炎重组痘苗病毒候选疫苗对猪体的免疫效果

重组痘苗病毒候选疫苗rVTT-JEVE投入使用之前需要进行本体动物免疫和攻毒保护试验,本研究将重组痘苗病毒rVTT-JEVE进行仔猪免疫接种,分别在体液免疫及细胞免疫水平上评价其免疫效果,并检测攻毒后仔猪体内乙型脑炎病毒载量,分析讨论乙型脑炎重组痘苗病毒候选疫苗rVTT-JEVE对猪体的免疫效果。经2次仔猪免疫接种后,重组痘苗病毒rVTT-JEVE组的IgG抗体水平是商品疫苗SA-14-14-2组的1.5倍,显著高于SA-14-14-2组(P<0.05),而且rVTT-JEVE组的中和抗体效价达到SA-14-14-2组的1.7倍,显著高于SA-14-14-2组(P<0.05)。rVTT-JEVE组的T淋巴细胞刺激指数为SA-14-14-2组的1.6倍,显著高于SA-14-14-2组(P<0.05)。本研究结果显示,rVTT-JEVE候选疫苗组和SA-14-14-2商品疫苗组JEV病毒载量均显著低于PBS对照组(P<0.05),均可有效保护仔猪感染JEV。

缺失TC7L-TK2L基因减毒天坛株痘苗病毒构建及筛选

目的通过敲除天坛株痘苗病毒(Vaccinia virus Tiantan strain,VTT)的复制非必需基因TC7L-TK2L,并结合双标记筛选及外源筛选标记敲除技术构建TC7L-TK2L基因缺失的VTT弱毒株rVTT-TC7L--TK2L-。方法人工合成含有痘病毒早晚期复合强启动子pE/L和外源筛选标记增强型绿色荧光蛋白(enhance green fluorescent protein,EGFP)的重组臂,构建穿梭质粒pTC7L-TK2L-EGFP,再与VTT共转染BHK-21细胞,通过连续筛选10次,获得含有筛选标记的重组痘苗病毒rVTT-TC7L--TK2L--EGFP+;利用Cre/loxp系统敲除EGFP,连续筛选10次,获得无筛选标记的重组痘苗病毒rVTT-TC7L--TK2L-,用PCR方法对rVTT-TC7L--TK2L-进行鉴定和遗传稳定性检测,用电镜观察病毒形态变化,并通过绘制生长曲线观察病毒在细胞内的复制情况。结果 PCR结果表明,成功构建了重组痘苗病毒rVTT-TC7L--TK2L-,且具有良好的遗传稳定性;电镜观察痘苗病毒缺失TC7L-TK2L基因未影响病毒形态;生长曲线显示敲除TC7L-TK2L基因后病毒毒力显著下降,但不影响病毒的正常复制。结论成功构建了痘苗病毒减毒株rVTT-TC7L--TK2L-,该重组痘苗具有良好的遗传稳定性且毒力减弱。