创伤弧菌溶细胞素融合蛋白重组、表达与细胞毒活性鉴定

研究重组创伤弧菌溶细胞素融合蛋白(rVvhA)诱导人脐静脉内皮细胞(human umbili-cal vein endothelial cells,human ECV304)凋亡的作用。诱导含pET-28a(+)vvhA重组质粒的BL21大肠杆菌表达创伤弧菌溶细胞素融合蛋白,应用Ni2+亲和层析方法对rVvhA进行纯化;利用分步稀释加透析相结合的方法进行蛋白质复性;绵羊红细胞裂解试验对复性后的rVvhA进行溶血活性初步测定;MTT法检测rVvhA对人ECV304细胞的体外毒性作用;应用Hochest33342/PI活细胞荧光双染及流式细胞术分析rVvhA对人ECV304细胞诱导凋亡的影响。结果显示,用Ni2+-NTAHisBand亲和层析柱纯化rVvhA纯度达88.6%左右;复性后的rVvhA有一定的溶血活性,其溶血活性具有时间-剂量依赖性;MTT结果显示rVvhA具有降低人ECV304细胞的存活率活性;浓度为2.0HU/mlrVvhA作用人ECV30412h后,其诱导凋亡的活性高于对照组和浓度为0.5HU/mlrVvhA处理组,具有剂量依赖性;浓度为2.0HU/mlrVvhA处理组加用40μmol/Lcaspase全酶抑制剂(Z-VAD-FMK)后凋亡率较2.0HU/mlrVvhA处理组有一定程度降低。rVvhA对人ECV304细胞具有诱导凋亡的生物学活性,推测诱导调亡途径可能与caspase家族有关。

创伤弧菌溶细胞素vvhA融合蛋白细胞毒活性相关分子机制的探讨

目的:研究创伤弧菌溶细胞素vvhA融合蛋白(rVvhA)诱导人脐静脉内皮细胞(ECV304)凋亡过程中caspase-3,-8,-9活性变化。方法:应用MTT法、Hochest33342/pI荧光双染、流式细胞术及DNA琼脂糖凝胶电泳分析rVvhA对人ECV304细胞诱导凋亡的影响;比色法测定rVvhA诱导人ECV304凋亡过程中caspase-3,-8,-9活性变化。结果:MTT结果显示rVvhA具有降低人ECV304细胞的存活率活性;浓度为2.0HU/ml的rVvhA作用人ECV304,12小时后,其诱导凋亡的活性高于对照组和浓度为0.5HU/ml的rVvhA处理组,具有剂量依赖性;浓度为2.0HU/mlrVvhA处理组加40μMcaspase全酶抑制剂(Z-VAD-FMK)后凋亡率较2.0HU/mlrVvhA处理组有一定程度降低。浓度为2.0HU/mlrVvhA处理人ECV304细胞30分钟后caspase-3活性开始增高,于3小时达高峰,与对照组比较差异有统计学意义(P<0.01),caspase-8,-9活性无明显变化。结论:rVvhA对人ECV304具有凋亡诱导的生物学活性,caspase-3可能与活性rVvhA诱导的人ECV304凋亡有关。