猪源Rab基因shRNA文库与稳定细胞株的构建及其对猪伪狂犬病病毒增殖的影响

【目的】探究Rab家族蛋白在猪伪狂犬病病毒(Porcine pseudorabies virus,PRV)感染宿主细胞中的作用。【方法】以猪肾上皮细胞(PK15)为试验模型,构建Rab基因shRNA文库,并用嘌呤霉素筛选获得稳定的能够抑制猪源Rab基因表达的细胞株。用实时荧光定量PCR检测细胞敲减效率,通过流式细胞术检测敲减Rab基因对PRV增殖的影响;用Western blotting检测PRV-gB蛋白表达量,使用实时荧光定量PCR检测敲减Rab基因后PRV-gB、PRV-TK基因以及相关细胞炎性因子表达量。【结果】试验成功构建包含13种Rab基因敲减细胞系的shRNA文库。流式细胞术检测结果显示敲减Rab基因能显著抑制PRV-GFP增殖(P<0.05);病毒滴度与Western blotting检测结果表明,敲减Rab基因极显著抑制子代病毒的产生以及PRV-gB蛋白的表达(P<0.01)。实时荧光定量PCR检测结果显示,敲减Rab基因会显著或极显著抑制PRV-gB、PRV-TK基因表达(P<0.05;P<0.01);敲减Rab14和Rab27基因后细胞中IFN-β、ISG15、IL-1β、IL-18基因表达量均显著或极显著升高(P<0.05;P<0.01)。【结论】敲减Rab基因能够抑制PRV增殖。研究结果为进一步研究Rab基因在PRV生活周期中发挥的作用奠定基础。

甜菜小G蛋白BvRab基因家族的全基因组鉴定及生物信息学分析

【目的】在全基因组范围内鉴定甜菜小G蛋白BvRab基因家族成员,为研究甜菜小G蛋白BvRab基因家族功能奠定基础。【方法】本研究利用生物信息学手段对甜菜小G蛋白BvRab基因家族成员进行筛选鉴定并进行理化性质、基因结构、蛋白保守基序、系统进化、染色体定位及共线性、启动子顺式作用元件和蛋白质互作预测分析。【结果】共鉴定到58个甜菜小G蛋白BvRab基因家族成员。同一类型中的不同基因具有较为一致的外显子和内含子结构,家族成员共有5个蛋白保守基序;甜菜小G蛋白BvRab基因家族包含8个亚家族;家族成员不均匀地分布在甜菜的9条染色体上;BvRab基因家族成员与番茄、拟南芥中的小G蛋白Rab基因家族亲缘关系较近,与水稻中的小G蛋白Rab基因家族亲缘关系较远;BvRab基因家族成员启动子中含有多个激素应答元件和逆境应答元件;BvRab蛋白与参与植物生长发育及逆境应答相关的多种转录因子相互作用。【结论】本研究鉴定出58个BvRab基因家族成员,该基因家族成员可能在植物生长发育及逆境应答方面发挥重要作用。

Rab基因家族在MDA-MB-231乳腺癌细胞胞体和伪足中的差异表达

目的:以表皮生长因子(epidermal growth factor,EGF)刺激MDA-MB-231乳腺癌细胞胞体和伪足分离,在此基础上,鉴定Rab基因家族在胞体和伪足中的差异表达谱。方法:运用Boyden小室技术分离EGF刺激下MDA-MB-231乳腺癌细胞的胞体和伪足,并鉴定Rab基因家族在乳腺癌细胞胞体和伪足中的差异表达谱。结果:RAB1A等21个基因在胞体中高表达,RAB7A等16个基因在伪足中高表达,RAB3B等24个基因在胞体和伪足中的表达量大体相等。结论 :本研究建立的基于Boyden小室技术的实验方法可以有效分离乳腺癌细胞的胞体和伪足,在此基础上鉴定了一类在EGF趋化刺激下乳腺癌细胞伪足中富集的Rab基因,从而为进一步深入研究乳腺癌细胞伪足伸展的确切分子机制提供新的思路和研究方向。

油菜素内酯对低温胁迫下冬小麦Rab15-like基因表达的影响

探索低温胁迫下油菜素内酯(Brassinosteroid,BR)对冬小麦叶片和分蘖节中Rab15-like基因表达的影响,以寒地冬小麦品种“东农冬麦1号”为试验材料,利用RT-PCR法克隆Rab15-like基因CDS序列,运用生物信息学方法分析该序列基本理化性质、二级结构和三级结构特征、Rab15-like蛋白保守性,采用实时荧光定量PCR(RT-qPCR)法检测BR处理对不同温度条件下冬小麦分蘖节和叶片中Rab15-like基因表达的影响。结果表明,Rab15-like基因编码区序列长度为1 265 bp,Rab15-like基因含有一个453 bp开放阅读框,编码150个氨基酸序列,Rab15-like蛋白为LEA家族第二大类蛋白,主要分布在细胞膜上,为稳定亲水性蛋白。RT-qPCR分析结果表明,Rab15-like基因表达量与温度变化相关,在叶片中,随着环境温度降低,Rab15-like基因表达先上调后下调,当环境温度达-10℃时表达量最高;在分蘖节中,随着温度降低,Rab15-like基因表达持续上调,-25℃时表达量最高。BR处理促进低温条件下该基因在叶片中表达,对5、0和-10℃条件下分蘖节中该基因表达影响较小,但显著促进-25℃条件下该基因表达(P<0.05)。Rab15-like基因表达受温度影响,说明Rab15-like基因可能参与冬小麦响应低温胁迫的信号途径。外源BR处理促进低温条件下该基因在冬小麦叶片和分蘖节中表达。

猴源rab基因shRNA文库及其稳定细胞株的构建

为揭示Rab蛋白在猪繁殖与呼吸综合征病毒（porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV）入侵进入宿主细胞后的功能,本研究以PRRSV易感的猴胚胎肾上皮细胞Marc-145为模型,构建了针对猴源rab基因的短发夹RNA（shRNA）文库。此文库中的shRNA以pLKO.1为载体质粒,与pMD2.G和psPAX2包装质粒共同转染HEK293T/17细胞,获得慢病毒;利用慢病毒感染Marc-145,通过puromycin筛选获得稳定抑制猴源rab基因表达的细胞株。通过荧光定量PCR方法检测各细胞株中rab基因的敲减效率。本试验构建的文库包含187个克隆、涉及62种rab基因。荧光定量PCR结果证明,筛选出的稳定细胞株中相应rab基因mRNA的表达量均有显著下降。结果显示本试验成功构建了猴源rab基因shRNA文库并筛选出了稳定细胞株,可用于后续进一步研究Rab蛋白在PRRSV生活周期中发挥的重要功能。

小麦(Triticum asetivum L.)杂交种下调表达的GTP结合蛋白基因TaRab的克隆与鉴定

杂种优势的形成与杂种一代中亲本基因的表达方式改变有关.为深入研究小麦杂种优势形成的分子机理,利用通过抑制性差减杂交(SSH)方法获得的小麦Rab类GTP结合蛋白基因片段为探针,筛选普通小麦品系3338三叶期叶片cDNA文库,获得了一个小麦Rab家族基因TsRab. 同源性比较和序列分析显示,该基因与拟南芥Rab类GTP结合蛋白基因具有90%氨基酸序列相似性.结构分析表明,它具有GTP结合蛋白4个典型结构以及Rab家族成员特有的YYRGA结构域.半定量RT-PCR表达检测结果显示,TaRab基因在叶片的表达水平要高于其他组织器官.研究还发现,该基因在三叶期、分蘖盛期的根系和叶片中为杂种下调表达.采用电子定位方法,将TaRab基因初步定位在7B染色体的着丝粒区域和C-7DS5-0.36两个区域.在此基础上,对Rab 蛋白基因差异表达与杂种优势表现的关系进行了讨论.

凡纳滨对虾Rab6A基因的克隆及表达

为研究凡纳滨对虾免疫调节因子Rab蛋白在对虾机体的免疫调节过程中的作用机理,克隆了凡纳滨对虾Rab6A基因,并对其在感染对虾传染性皮下及造血组织坏死病毒(IHHNV)对虾不同组织中的表达情况进行了研究。根据日本对虾Rab蛋白基因设计引物,采用RT-PCR方法克隆了长为558bp的Rab6A基因的部分cDNA序列,其开放阅读框为442bp,可编码147个氨基酸,推算其分子质量约为16.977ku,理论等电点为4.828,Rab6A与其他物种的Rab基因比对发现,该基因氨基酸序列具有较高的保守性。半定量PCR结果显示,Rab基因在不同组织中的表达情况没有明显的组织特异性,肝胰腺中表达量比其他组织略高,而在感染IHHNV的对虾心脏、肝胰腺、肠道、胃、腮、肌肉、血液组织中比正常组织中表达量增加,表明Rab蛋白参与抗病毒免疫反应。

小G蛋白Rab2基因参与小麦抗叶锈病反应的研究

为了解叶锈菌侵染小麦后小G蛋白Rab2基因的表达情况,明确其与抗病性的关系,从分子水平上探讨小麦的抗叶锈病机制。以普通六倍体小麦近等基因系TcLr1和叶锈菌小种05-22-64①和05-8-63①为试验材料,构建小麦亲和与非亲和组合,利用实时定量PCR技术对小麦小G蛋白Rab2基因的表达情况进行检测。结果表明:在小麦叶锈菌侵染过程中,Rab2基因主要在侵染的前期表达迅速,随着时间的推移表达量有所下降。非亲和叶锈菌菌株可以诱导小G蛋白Rab2基因表达量的升高,而亲和叶锈菌菌株抑制小G蛋白Rab2基因的表达。由此表明,小G蛋白可能与寄主和病原物的亲和程度有着直接的关系。

花生AhRab7基因的克隆及其原核表达研究

为了研究花生小G蛋白AhRab7基因在大肠杆菌中的表达模式及与高盐胁迫的关联性,采用RT-PCR技术从花生(Arachis hypogaea L.)品种花育20中克隆了AhRab7(7-1、7-2)的cDNA全长序列,通过核苷酸序列和氨基酸序列分析结果表明AhRab7(7-1、7-2)的cDNA全长分别为872 bp、816 bp,分别含1个621 bp、618 bp大小的开放阅读框(ORF,open readingframe),拟编码氨基酸数分别为206aa、205aa。将携带完整的ORF序列连入表达载体pET-28a(+)中,经IPTG诱导后进行耐盐性测定,结果表明两种全长重组酶(分别含pET-28a-Rab7-1和pET-28a-Rab7-2的重组质粒)均具有正常酶活性,明显缓解了高盐环境(5.5%～10%NaCl溶液)对大肠杆菌的生长胁迫,而对照组(含空载体pET-28a)未能检测出相同的酶活性,结果表明AhRab7基因表达可以显著缓解高盐胁迫影响。目的基因经IPTG诱导后高效表达,SDS-PAGE电泳检测到目标蛋白的大小为23kDa,与预测结果一致。这为后期探讨花生对盐胁迫及其他非生物胁迫的研究奠定了一定的基础。

rab5a基因在肿瘤转移中的作用研究

为研究rab5a基因在肿瘤转移机制中的作用,将该基因稳定转染至低转移肺腺癌细胞系AGZY83-a中,采用Superarray肿瘤转移相关基因微芯片分析rab5a对肿瘤转移相关基因的表达影响。共获得了5个差异表达基因,rab5a基因促进s100a4的表达,同时抑制了nm23ar、ac1、cst3、col4a2等基因的表达,并分别在RNA及蛋白水平进行验证,确认rab5a基因影响了肿瘤转移的多个途径,促进了肿瘤细胞转移能力增强。

RAB31基因的单核苷酸多态与高度近视的相关性

目的 分析高度近视及正常人的RAB3 1基因的单核苷酸多态 (SNP) ,探讨其与高度近视发病的关系。方法 收集 178例高度近视先证者及 71例正常人的外周血DNA ,对RAB3 1基因的外显子及临近内含子序列进行PCR扩增 ,异源双链 -单链构象多态性 (HA SSCP)及测序分析。结果 共发现 7个SNP ,位于内含子 ,同时出现在高度近视组和正常对照组中。对照组出现SNP10 6694C→T频率高于高度近视组 ,有显著性差异。结论 RAB3 1基因的SNP不会导致高度近视发病 ,SNP10 6694C→T可能是一个保护因子 ,其机制有待进一步研究。

定向克隆构建RAB5A基因真核细胞表达载体

目的 探讨RAB5A作为蛋白质入胞信号传导调控者在肿瘤转移中的作用及影响。方法 采用双酶切、定向克隆技术建立了人RAB5A基因真核细胞表达载体pcDNA3.1(- ) -RAB5A。结果 测序分析证实了RAB5A基因正向插入pcDNA3.1(- )表达载体 ;免疫组化分析表明转染了pcDNA3.1(- ) -RAB5A表达载体的AGZY83 a细胞系细胞内的荧光亮度明显强于转染前 ,蛋白电泳显示近 2 3KD的蛋白质含量增高 ,表明重组质粒在细胞内工作良好。结论 双酶切。

siRNAs表达载体沉默RAB5A基因的位置效应研究

目的研究小干扰RNA(siRNAs)表达载体沉默RAB5A基因的位置效应,寻找沉默RAB5A基因的最佳作用靶点。方法利用MFold软件分析RAB5A mRNA的二级结构,构建针对RAB5A mRNA不同位点的siRNAs表达载体,转染Anip973细胞后,通过RT-PCR和Western-blot方法评价siRNAs对RAB5A基因表达的抑制作用。结果针对RAB5A mRNA编码区内最可及位点设计的siRNAs分别抑制72％和85％的RAB5A基因表达,而针对最不可及位点设计的siRNAs则完全没有活性;非编码区内也存在沉默RAB5A基因的siRNAs有效作用靶点;siRNAs分子与RAB5A mRNA靶序列之间引入2个错配碱基时,siRNAs的抑制活性完全丧失。结论MFold软件分析的RAB5A mRNA二级结构可以作为分析和寻找可及位点的依据,siRNAs的作用效率与RAB5A mRNA靶位点的可及性密切相关。

水稻rab5B基因在大肠杆菌中的表达、纯化和GTP结合分析

Rab5B类蛋白因为其编码产物的N端具有特殊结构而被认为是一类特殊的蛋白质 .水稻rab5B基因Osrab5B是这类蛋白质基因在单子叶植物中的首例发现 .将Osrab5B基因的编码序列按正确读码框重组到具有谷胱甘肽硫转移酶 (glutathioneS transferase,GST)融合标签的 pGEX 4T1表达载体中 ,转化大肠杆菌 ,获得了稳定表达目标融合蛋白的菌株 ,经GSTrapTM 柱纯化 ,获得了纯化的目标融合蛋白 .GTP结合试验表明 ,在原核细胞中表达出的GST

RAB5A基因对肺腺癌细胞微丝的影响(英文)

为研究RAB5A基因对肺腺癌细胞中微丝的影响,通过FITC标记的鬼笔环肽对AGZY83a细胞骨架中的微丝特异染色,利用共聚焦激光扫描显微镜发现RAB5A过表达后微丝束变密。经Superarray肿瘤转移相关基因微芯片分析RAB5A对肿瘤转移相关基因的表达影响,发现了3个与细胞骨架调节相关基因表达发生变化,NM23H1与Rac1的表达受到抑制,同时S100A4的表达增加。以前有研究认为S100A4基因可抑制NM23H1基因表达,为验证NM23H1基因的表达降低是否由于S100A4表达增高所致,利用RNAi沉默AGZY83a细胞中S100A4基因的表达,发现NM23H1基因表达增高,由此推断RAB5A基因可能通过上调S100A4基因表达来抑制NM23H1基因表达。

RAB5A基因与结肠癌发生、转移的相关因素研究

目的:研究RAB5A基因表达与结肠癌发生、转移的关系。方法:应用免疫组化技术检测42例结肠癌标本RAB5A基因的表达。结果:结肠癌中RAB5A的表达与组织学分型、分化、淋巴结转移均有明显关系(χ2=3.96～6.73,P<0.05)。结论:RAB5A是一个可能与结肠癌发生、转移相关的基因,并且还可能与它们的分化程度有关。

基于CRISPR/Cas9技术编辑RAB39B基因对骨髓间充质干细胞软骨分化的影响

背景:基于前期研究,课题组通过蛋白组学和高通量测序筛选出RAB39B基因与骨髓间充质干细胞的增殖、软骨分化可能存在相关性。目的:探讨利用CRISPR/Cas9技术编辑敲除RAB39B基因对骨髓间充质干细胞软骨分化的影响。方法:利用CRISPR/Cas9慢病毒感染方法,构建敲低RAB39B基因稳转细胞系,将兔骨髓间充质干细胞分为正常对照组、空载对照组、RAB39B基因敲除组,通过Western blot鉴定CRISPR/Cas9系统对RAB39B的敲除效果,CCK-8法检测骨髓间充质干细胞增殖活性,流式细胞仪检测骨髓间充质干细胞凋亡率,qRT-PCR检测骨髓间充质干细胞成软骨分化COLⅡ、COLⅩ基因mRNA表达,Western blot检测骨髓间充质干细胞成软骨分化相关通路RHOA、LIMK、Sox9蛋白表达。结果与结论:(1)敲除RAB39B基因质粒的慢病毒感染兔骨髓间充质干细胞48-96 h后荧光显著表达;Western blot检测验证RAB39B基因敲除后骨髓间充质干细胞中RAB39B蛋白表达显著降低(P<0.01);(2)与正常对照组、空载对照组比较,RAB39B基因敲除组细胞增殖活性显著降低(P<0.01);细胞凋亡率增加(P<0.01);COLⅡ、COLⅩ mRNA表达显著降低(P<0.01);RHOA、LIMK、Sox9蛋白表达显著降低(P<0.01);(3)结果表明,CRISPR/Cas9系统编辑敲低RAB39B基因后能够抑制骨髓间充质干细胞增殖,同时促进细胞凋亡,降低其软骨细胞分化能力,说明RAB39B基因可能对骨髓间充质干细胞增殖、软骨分化能力产生影响,其具体作用机制有待进一步研究。

腓骨肌萎缩症RAB7基因突变分析

目的探讨RAS相关GTP结合蛋白7(RAB7)基因在中国人腓骨肌萎缩症的突变特点。方法应用聚合酶链反应—单链构象多态性(PCR-SSCP)并结合DNA序列分析的方法,对已经排除PMP22的大片段重复突变和PMP22、MPZ、Cx32、NEFL、GDAP1、Hsp22、Hsp27点突变的33例患者进行RAB7基因突变分析。结果33例患者所有外显子PCR产物量和特异性均较好,但SSCP均未出现异常条带,未发现RAB7基因突变。结论RAB7基因突变可能在中国人腓骨肌萎缩症患者中少见。

Rab25基因对乳腺癌裸鼠移植瘤生长的影响

目的:建立一系列Rab25表达水平不同的乳腺癌细胞裸鼠移植瘤模型,观察不同水平Rab25表达对乳腺癌裸鼠移植瘤的影响。方法:通过分别上调及沉默Rab25基因在乳腺癌细胞中的表达,建立Rab25表达水平不同的乳腺癌细胞的裸鼠移植瘤模型,测量肿瘤体积,绘制肿瘤生长曲线,检测肿瘤组织中Rab25表达差异。结果:Rab25转染组较干扰组、原株细胞组及空质粒组对裸鼠细胞致瘤能力明显增强。转染组裸鼠瘤体中Rab25 mRNA表达明显增强,而干扰组瘤体Rab25 mRNA表达明显减弱。结论:Rab25为促癌基因,其高表达可直接增强乳腺癌细胞的增殖侵袭能力,而RNA干扰技术有可能为乳腺癌的肿瘤靶向和基因治疗提供新的思路。

DNA结合抑制因子、Rab5基因在子宫内膜异位症患者中的表达及其意义

目的探究DNA结合抑制因子2(ID2)、Rab5基因在子宫内膜异位症(EMS)患者中的表达及其意义。方法以2017年6月至2019年8月本院138例EMS患者为研究组,另120例行输卵管绝育手术患者作为对照组。检测两组子宫内膜组织中Rab5 mRNA、ID2 mRNA表达量,采用受试者工作特征(ROC)曲线分析两者单独及联合的诊断价值。研究组按照r-AFS分期划分,比较不同病情分期患者Rab5 mRNA、ID2 mRNA、临床指标[血清癌胚抗原125(CA125)、子宫内膜抗体(EmAb)]水平,分析Rab5 mRNA、ID2 m RNA与病情分期、血清CA125、EmAb的相关性。结果研究组子宫内膜组织中Rab5 mRNA、ID2 m RNA表达量高于对照组(P<0.05);Rab5 mRNA与ID2 mRNA联合诊断EMS的AUC最大,为0.802,最佳诊断敏感度为78.99%,特异度为69.17%;EMS患者病情分期与Rab5 mRNA、ID2m RNA表达及血清CA125、EmAb水平存在正相关关系(P<0.05);EMS患者Rab5 mRNA、ID2 mRNA表达与血清CA125、EmAb水平存在正相关关系(P<0.05)。结论 EMS患者Rab5 m RNA、ID2 mRNA表达异常增高,与病情分期及血清CA125、EmAb水平关系密切,可辅助临床EMS诊断。