Rac1和WAVE2蛋白在高脂饮食C57BL/6J幼鼠肾小球中的表达及意义

目的探讨Rac1和WAVE2蛋白在高脂饮食诱导的C57BL/6J幼鼠肾小球中的表达及意义。方法 32只3周龄雄性C57BL/6J幼鼠随机分为正常饮食组和高脂饮食组,每组16只。分别给予标准饲料(脂肪含量10%)与高脂饲料(脂肪含量60%)喂养4周。HE染色和PAS染色观察小鼠肾脏的病理形态学改变;应用免疫组织化学技术及蛋白免疫印迹技术检测Rac1和WAVE2蛋白的表达。结果与正常饮食组相比,高脂饮食喂养的C57BL/6J幼鼠出现了肾小球系膜基质轻度增生以及渗出等病理改变。同时高脂饮食组小鼠肾小球Rac1和WAVE2蛋白的表达明显增强。结论 Rac1和WAVE2蛋白可能共同参与了高脂饮食诱导的C57BL/6J幼鼠肾小球的损伤。

C3G/Rap1和Dock180/Rac1信号通路在卵巢癌浸润中的作用

目的探讨鸟嘌呤核苷酸交换因子C3G/Rap1酶和鸟嘌呤核苷酸交换因子Dock180/Rac1酶信号通路在卵巢癌浸润中的可能作用。方法 Western blot检测Dock180沉默的卵巢癌细胞SKOV3中C3G的表达,验证上皮性卵巢癌组织中Dock180与C3G的表达相关性;免疫组化比较卵巢癌组织中Dock180与C3G的表达趋势;免疫荧光观察SKOV3中Dock180与C3G及它们各自的下游蛋白Rac1/Rap1的定位。结果 Dock180基因沉默的细胞中C3G表达明显增强(P<0.05);Dock180与C3G在卵巢癌组织中的表达呈现相反趋势(P<0.05);C3G/Dock180均主要分布于细胞质,下游效应蛋白Rap1/Rac1在细胞膜和细胞质都有表达,但Rap1以细胞质为主,而Rac1可以伸展至细胞膜及细胞膜皱褶。结论卵巢癌细胞和组织中C3G与Dock180表达呈相反趋势,下游蛋白Rap1与Rac1在细胞内的定位分布差异,可能与C3G/Rap1和Dock180/Rac1信号通路在卵巢肿瘤浸润中的不同作用有关。

Rac1在垂体腺瘤组织中的表达及意义

目的探讨Rac1蛋白及mRNA在垂体腺瘤组织中的表达情况。方法应用免疫组化技术、RT-PCR方法检测82例垂体腺瘤标本中Rac1蛋白及mRNA的表达情况,包括29例侵袭性垂体腺瘤和53例非侵袭性垂体腺瘤。结果免疫组化结果显示:垂体腺瘤Rac1标记指数(LI)为3.34%～53.7%,其中侵袭性垂体腺瘤LI平均为33.5%,非侵袭垂体腺瘤LI平均为8.2%,两者差异具有统计学意义(P<0.01)。RT-PCR显示:Rac1mRNA灰度比侵袭性垂体腺瘤为0.891±0.172,非侵袭性垂体腺瘤为0.372±0.181,两者差异具有统计学意义(P<0.01)。结论 Rac1与垂体腺瘤的侵袭能力密切相关,Rac1过表达可增强垂体腺瘤的侵袭能力并导致临床预后不良。

肺炎衣原体感染通过PI3K激活Rac1而诱导血管平滑肌细胞迁移

目的:研究Rac1活化在肺炎衣原体(C.pn)感染诱导血管平滑肌细胞(VSMCs)迁移中的作用及磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)对其活化的影响。方法:谷胱甘肽巯基转移酶(GST)-p21活化激酶1 p21结合结构域(PBD)即GST-PBD重组质粒转化感受态细菌,诱导融合蛋白表达并纯化;GST-pull down实验检测C.pn感染VSMCs后Rac1活性的变化;PI3K特异性抑制剂LY294002(25μmol/L)预处理VSMCs,GST-pull down实验检测Rac1活性的变化;Rac1特异性抑制剂NSC23766(50μmol/L)预处理VSMCs,wound-healing实验和Transwell实验观察VSMCs迁移能力的变化。结果:重组质粒转化感受态细菌后,经诱导表达和纯化,得到足量有效的GST-PBD融合蛋白;GST-pull down实验结果显示,C.pn感染VSMCs后Rac1活性增强且显著高于正常对照组(P<0.05);LY294002预处理VSMC后,C.pn感染诱导的Rac1活性明显下降(P<0.05);细胞迁移实验结果显示,NSC23766预处理的C.pn感染组细胞迁移能力明显低于单纯感染组(P<0.05)。结论:C.pn感染可能通过PI3K激活Rac1,从而诱导VSMCs迁移。

Rac1抑制剂联合替莫唑胺协同抑制胶质瘤细胞增殖活性和侵袭能力的体外研究

目的探讨Rac1抑制剂联合替莫唑胺对胶质瘤细胞增殖活性、迁移能力和侵袭能力的协同抑制作用。方法分别以Rac1抑制剂、替莫唑胺、Rac1抑制剂联合替莫唑胺于体外培养人胶质瘤细胞系U87和U251,噻唑蓝法、细胞迁移实验和细胞侵袭实验检测胶质瘤细胞增殖活性、迁移能力和侵袭能力。结果经Rac1抑制剂、替莫唑胺、Rac1抑制剂联合替莫唑胺培养后,U87和U251细胞增殖活性均降低(均P<0.05),且替莫唑胺的抑制作用强于Rac1抑制剂(均P<0.05),Rac1抑制剂联合替莫唑胺的抑制作用更强(均P<0.05);U87和U251细胞迁移能力[U87:空白对照(78.00±11.53)细胞数/低倍视野、Rac1抑制剂(39.00±9.53)细胞数/低倍视野、替莫唑胺(42.00±8.54)细胞数/低倍视野、Rac1抑制剂联合替莫唑胺(18.67±10.54)细胞数/低倍视野,P=0.001,0.001,0.000;U251:空白对照(75.00±4.00)细胞数/低倍视野、Rac1抑制剂(37.00±5.56)细胞数/低倍视野、替莫唑胺(36.00±9.00)细胞数/低倍视野、Rac1抑制剂联合替莫唑胺(14.33±5.50)细胞数/低倍视野,均P=0.000]和侵袭能力[U87:空白对照(64.33±4.04)细胞数/低倍视野、Rac1抑制剂(30.33±3.51)细胞数/低倍视野、替莫唑胺(24.00±2.64)细胞数/低倍视野、Rac1抑制剂联合替莫唑胺(11.00±2.00)细胞数/低倍视野,均P=0.000;U251:空白对照(77.33±3.06)细胞数/低倍视野、Rac1抑制剂(40.67±4.04)细胞数/低倍视野、替莫唑胺(37.33±4.51)细胞数/低倍视野、Rac1抑制剂联合替莫唑胺(15.33±2.52)细胞数/低倍视野,均P=0.000]均降低,尤以二者联合应用降低更明显(迁移能力U87:P=0.021,0.011;迁移能力U251:P=0.002,0.003;侵袭能力U87:P=0.000,0.001;侵袭能力U251:均P=0.000)。结论 Rac1抑制剂和替莫唑胺均可抑制胶质瘤细胞的增殖活性、迁移能力和侵袭能力,二者联合应用更具协同抑制作用。

Rab1对海水干预肺微血管内皮细胞β肾上腺素受体表达的调节作用

目的研究Rab1对大鼠肺微血管内皮细胞(RPMVECs)β肾上腺素受体(β-ARs)表达的调节作用。方法取原代培养的RPMVECs作为研究对象,设计3个实验:(1)检测海水干预对β-ARs表达的影响,设对照组和海水处理(SW)组。(2)构建大鼠野生型Rab1慢病毒表达载体(Rab1WT)和Rab1阴性突变体慢病毒表达载体(Rab1N124I),检测两种质粒转染对β-ARs及其亚型(β1-AR、β2-AR)表达的影响,设对照组、转染Rab1WT组(WT组)和转染Rab1N124I组(N124I组)。(3)检测Rab1WT转染对海水处理β-ARs表达的影响,设对照组、SW组和转染Rab1WT后海水处理组(WT/SW组)。上述3个实验中,对照组RPMVECs常规培养至实验结束;SW组细胞常规培养后用海水处理2h;WT组和N124I组细胞分别转染Rab1WT和Rab1N124I(滴度109TU/ml);WT/SW组细胞转染Rab1WT后培养48h,用海水处理2h。β-ARs及其亚型的表达均采用配体饱和测定法进行检测。结果 (1)对照组和SW组RPMVECs表面β-ARs的表达量分别为2107.00±202.36和1324.00±130.01cpm/105细胞,差异有统计学意义(P<0.01)。(2)对照组、WT组和N124I组β-ARs的表达量分别为2048.00±207.64、2833.00±203.07和1040.00±91.59cpm/105细胞(P<0.05),β1-AR分别为517.78±29.65、591.22±18.29、364.11±20.68cpm/105细胞(P<0.05),β2-AR分别为1627.90±112.27、2262.10±169.33和694.33±29.79cpm/105细胞(P<0.05)。与对照组比较,WT组β1-AR的表达增加了14.2%(P<0.05),β2-AR增加了49.0%(P<0.01)。(3)SW组β-ARs的表达量为1276.00±121.42cpm/105细胞,与对照组(2059.00±174.62cpm/105细胞)比较下降了38.0%(P<0.01),WT/SW组β-ARs的表达量为2017.20±101.14cpm/105细胞,与对照组比较差异无统计学意义(P>0.05),与SW组比较增加了58%(P<0.01)。结论海水干预可降低β-ARs在RPMVECs细胞膜上的表达,Rab1可对抗该作用,使β-ARs的表达上调。

肝细胞性肝癌组织中GST-π和Rac-1的表达及其临床意义

目的:探讨谷胱甘肽S转移酶π(GST-π)和Ras相关的C3肉毒素底物1(Rac-1)在肝细胞性肝癌(HCC)中的表达水平及其与临床病理参数和预后的关系。方法:应用免疫组织化学法检测82例HCC组织和30例正常肝组织中的GST-π和Rac-1表达,依据阳性细胞计数与染色强度相结合的二级计分法将两蛋白均分为高表达和低表达两组,分析该两组与常见病理参数的关系及两蛋白的相关性;采用Kaplan-Meier生存曲线分析高低表达间的无疾病进展时间(PFS)及总生存时间(OS)情况。结果:HCC组GST-π和Rac-1的高表达率分别为59.76%和64.63%,高于正常组的20.00%和26.67%(均P<0.01);GST-π表达与HBsAg、肿瘤大小、分化程度、肝外转移有关,而Rac-1表达与肿瘤数目、肿瘤大小、分化程度、肝硬化、肝外转移有关;GST-π不同表达水平间的Rac-1表达有统计学差异(均P<0.05),且GST-π与Rac-1的表达具有相关性(r=5.174,P=0.023);GST-π高表达和Rac-1高表达者的中位PFS和OS均低于低表达者(均P<0.05)。结论:GST-π和Rac-1在肝细胞性肝癌组织中呈高表达,联合两者检测有助于对肝癌的恶性、分化及肝转移程度及预后进行评估和预测。

5-羟色胺1A受体、G蛋白β3亚基基因多态性与卒中后抑郁的相关性

目的观察5-羟色胺1A受体（5-HTR1A）C（-1019）G基因与G蛋白β3亚基（GNβ3）基因C825T多态性在中国广州地区卒中后抑郁患者的分布情况及特点，探讨卒中后抑郁的遗传机制。方法选取159例首发脑卒中患者并根据汉密尔顿抑郁量表（HAMD）评分分为卒中后抑郁组（53例）和卒中对照组（106例），采用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性（PCR—RFLP）技术分析2组患者的5-HTR1AC（-1019）G和GN133C825T基因多态性。结果5-HTR1AC（-1019）G和GN[33C825T基因多态性在2组人群中的分布差异均有统计学意义，卒中后抑郁组5-HTR1A（-1019）GG基因型（8／53，15．1％）及G等位基因频率（44／106，41．5％）和GN[33825T等位基因频率（68／106，64．2％）均高于对照组（5／106，4．7％；35／212，16．5％；113／212，53．3％；x^2=23．204、23．655、3．392，均P〈0．05）。同时携带5-HTR1A（-1019）G和GN33825T等位基因者罹患卒中后抑郁的相对危险度（OR=4．980，95％CI2．429～10．210，P=0．00（3）比单独具有5-HTRIA（-1019）G等位基因者（OR=3．589，95％C12．113—6．096，P=0．000）或GN33825T等位基因者高（OR=0．638，95％C10．395～1．031，P=0．042）。结论5-HTR1AC（-1019）G和GN33C825T基因均可能是卒中后抑郁的易患基因，而且两者在卒中后抑郁的发病中存在微效协同作用。

人Rac1基因shRNA表达质粒的构建及鉴定

目的构建人Rac1基因shRNA表达质粒,为提高卵巢癌放化疗的敏感性奠定基础。方法根据GenBank中登录的人Rac1基因序列,应用shRNA设计软件设计并合成用于构建shRNA表达质粒的oligo DNA,构建shRNA重组质粒。将阳性Rac1基因shRNA重组质粒经脂质体介导转染卵巢癌Skov3细胞,48 h后经RT-PCR筛选有效的shRNA重组质粒。结果经限制性内切酶BamHⅠ和PstⅠ酶切鉴定出阳性Rac1基因shRNA重组质粒,序列比对分析结果与理论序列完全一致。RT-PCR检测显示,转染pGPU6/GFP/Rac1-524的Skov3细胞Rac1基因mRNA的转录水平下降。结论已成功构建人Rac1基因shRNA表达质粒,并筛选出有效的干扰质粒pGPU6/GFP/Rac1-524。

阻断Rac1对转化生长因子-β诱导视网膜色素上皮细胞行为改变的作用研究

目的 观察转化生长因子β1（TGF-β1）诱导视网膜色素上皮（RPE）细胞间质样转分化（EMT）过程中Rac1在其细胞学行为改变中的作用.方法 人RPE-19细胞分为空白组、TGF-β1组、TGF-β1＋NSC23766组、NSC23766组.所有实验于加入TGF-β1前2h给予NSC23766以封闭Rac1受体.免疫荧光、蛋白免疫印迹法检测细胞中α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）表达;细胞划痕、侵袭及凝胶收缩实验,观察NSC23766对细胞迁徙、侵袭、凝胶收缩作用.结果 TGF-β1组细胞中α-SMA荧光表达较空白组、TGF-β1＋ NSC23766增强,差异有统计学意义（F=825.314,P=0.003）;细胞划痕实验结果显示,TGF-β1组细胞间距小于TGF-β1＋ NSC23766组,差异有统计学意义（P24h=0.04,P48h =0.001）;与空白组细胞间距比较,差异无统计学差异（P=0.278）.细胞侵袭实验结果显示,TGF-β1组穿过纤维膜的细胞数与空白组、TGF-β1＋ NSC23766组、NSC23766组穿过纤维膜的细胞数比较,差异无统计学意义（F=0.371,P=0.055）.凝胶收缩实验结果显示,TGF-β1组能明显增加细胞的促凝胶收缩能力,组间差异有统计学意义（F=40.473,P=0.014）,TGF-β1组相对TGF-β1＋ NSC23766组,差异有统计学意义（P=0.022）.结论 Rac1在TGF-β1诱导RPE细胞凝胶收缩改变中发挥作用;NSC23766可通过调控Rac1活化抑制RPE细胞学行为的改变.

实验性脉络膜新生血管中Rapl、鸟苷三磷酸-Rap1、血管内皮生长因子及β-连环蛋白的表达研究

目的观察实验性脉络膜新生血管（CNV）中Rap1、鸟苷三磷酸-Rap1（GTP-Rap1）、血管内皮生长因子（VEGF）及β-连环蛋白（β-catenin）的表达。方法42只棕色挪威大鼠随机分为空白对照组、模型组，分别为7、35只；均双眼入组。模型组大鼠氪离子激光光凝建立CNV模型。光凝后3、7、14、21、28 d行荧光素眼底血管造影（FFA）、脉络膜血管铺片检查，观察光凝后不同时间大鼠荧光素渗漏程度以及CNV面积的变化。蛋白免疫印迹法（Western blot）、实时荧光定量聚合酶链反应（RT-PCR）检测CNV中Rap1、GTP-Rap1、VEGF、β-catenin蛋白和mRNA表达。结果FFA检查结果显示，光凝后14 d，光凝斑出现大片圆盘状荧光素渗漏。激光共聚焦显微镜观察发现，与光凝后7 d时CNV面积比较，光凝后14、21、28 d时CNV面积增加，差异均有统计学意义（t=3.725、5.532、3.605，P＜0.05）。Western blot检测结果显示，与空白对照组比较，光凝后不同时间点，CNV中Rap1蛋白相对表达量差异均无统计学意义（P=0.156）；GTP-Rap1蛋白相对表达量显著降低，VEGF、β-catenin蛋白相对表达量明显增高，差异均有统计学意义（P=0.000）。RT-PCR检测结果显示，与空白对照组比较，光凝后不同时间点，CNV中Rap1 mRNA相对表达量差异无统计学意义（P=0.645）；β-catenin mRNA相对表达量差异均有统计学意义（P=0.000）。7、14、21、28 d，GTP-Rap1、VEGF mRNA相对表达量差异均有统计学意义（P=0.000）。结论实验性CNV中GTP-Rap1表达较正常大鼠明显减少。

RhoA、Rac1及Cdc42在胆道闭锁肝纤维化中的作用

目的研究胆道闭锁（biliary atresia，BA）患儿肝组织中RhoA、Rac1及Cdc42表达情况与肝纤维化的关系，探讨其在BA发病中可能的作用机制。 方法选取胆管扩张症患儿肝组织（胆扩组）15例，BA患儿肝组织（BA组）15例，BA发展至肝硬化接受肝移植患儿自体肝活检组织（移植组）10例，采用HE观察肝组织标本纤维化程度；免疫组化染色检测RhoA、Rac1及Cdc42在肝组织中的蛋白表达情况；实时荧光定量聚合酶链式反应（qRT-PCR）方法检测肝组织中RhoA、Rac1及Cdc42基因表达情况。结果①HE染色：胆扩组偶见少许纤维组织增生；BA组汇管区增宽，纤维组织增生、桥接纤维化现象普遍，可见假小叶形成；移植组假小叶显著；②免疫组化：胆扩组RhoA、Rac1及Cdc42均表达为弱阳性，BA组及肝移植组患儿RhoA、Rac1及Cdc42蛋白在肝细胞、汇管区胆管上皮细胞中均为阳性表达；③半定量分析：RhoA（0.1419±0.0683、0.2203±0.0476和0.2295±0.0623），Rac1（0.1587±0.0072、0.1970±0.0242和0.1993±0.0270）和Cdc42（0.887±0.0270、0.1397±0.0360和0.1519±0.0168）在三组蛋白表达水平之间比较差异有统计学意义（P〈0.05），且三组中BA组及肝移植组RhoA、Rac1及Cdc42蛋白表达水平明显高于胆扩组（P〈0.05）；移植组RhoA、Rac1及Cdc42蛋白含量与BA组，表达差异无统计学意义（P〉0.05）；④qRT-PCR：RhoA[0.3350（0.2525～0.6350）、1.5200（1.4375～2.1700）和1.9350（1.7950～2.3925）]，Rac1[0.2800（0.1450～0.3025）、0.8200（0.7275～0.9300）和0.8000（0.7725～0.9825）]，Cdc42[0.5950（0.4375～0.7125）、1.8950（1.8675～2.1925）和1.9900（1.8675～2.2050）]，三组中mRNA表达水平比较差异有统计学意义（P〈0.017），同时在这三组中，BA组及肝移植组RhoA、Rac1及Cdc42含量表达明显高于胆扩组（P〈0.017）。结论RhoA、Rac1及Cdc42在BA患儿肝组织呈高水平表达，表明其可能参与并促进BA肝纤维进程。

Rac1在糖尿病大鼠脑缺血再灌注损伤中的作用:与线粒体自噬的关系

目的评价Rac1在糖尿病大鼠脑缺血再灌注损伤中的作用及其与线粒体自噬的关系。方法SPF级健康成年雄性SD大鼠,8周龄,体重250~280 g,腹腔注射链脲佐菌素制备糖尿病模型。糖尿病模型制备成功大鼠48只,采用随机数字表法分为4组(n=12):假手术组(sham组)、缺血再灌注组(I/R组)、缺血再灌注+慢病毒抑制Rac1组(I/R+shRac1组)和缺血再灌注+阴性慢病毒组(I/R+NC组)。I/R组采用阻塞大脑中动脉90 min,再灌注24 h的方法制备大鼠脑缺血再灌注损伤模型。I/R+shRac1组和I/R+NC组分别于模型制备前7 d,经右侧脑室注射Rac1 shRNA慢病毒载体或慢病毒阴性对照载体10μl。于再灌注24 h时断头取脑,确定脑梗死体积;采用Western blot法检测BNIP3、P62、LC3Ⅰ和LC3Ⅱ表达,并计算LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值。结果与sham组比较,余3组脑梗死体积增加(P<0.05);与I/R组比较,I/R+shRac1组脑梗死体积降低,LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值升高,BNIP3表达上调,P62表达下调(P<0.05或0.01),I/R+NC组各指标差异无统计学意义(P>0.05);与I/R+NC组比较,I/R+shRac1组脑梗死体积降低,LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值升高,BNIP3表达上调,P62表达下调(P<0.05或0.01)。结论抑制Rac1可减轻糖尿病大鼠脑缺血再灌注损伤,其机制与增强线粒体自噬有关。

抑制Rac1表达对高糖诱发神经元损伤后线粒体自噬的影响

目的:评价抑制Ras相关的C3肉毒素底物1(ras-related C3 botulinum toxin substrate 1, Rac1)表达对高糖诱发神经元损伤的影响。方法:对数生长期PC12细胞接种于6孔板,采用随机数字表法将细胞分为4组(每组3孔):正常浓度葡萄糖组(C组)、高浓度葡萄糖组(HG组)、高浓度葡萄糖+慢病毒抑制Rac1组(HG+shRac1组)、高浓度葡萄糖+慢病毒阴性对照组(HG+NC组)。C组以葡萄糖浓度为4.5 g/L的DMEM完全培养基培养PC12细胞24 h, HG组以葡萄糖浓度为45 g/L的DMEM完全培养基培养PC12细胞24 h, HG+shRac1组以葡萄糖浓度为45 g/L的DMEM完全培养基培养用Rac1 shRNA慢病毒载体转染的PC12细胞24 h,HG+NC组以葡萄糖浓度为45 g/L的DMEM完全培养基培养用阴性慢病毒载体转染的PC12细胞24 h。Western blot法检测微管相关蛋白1轻链3 (microtubule-associated protein 1 light chain 3, LC3)Ⅰ、LC3Ⅱ、Bcl-2/腺病毒E1B相互作用蛋白3 (Bcl-2/adenovirus E1B protein-interacting protein 3, BNIP3)和p62蛋白水平,并计算LC3Ⅱ/LC3Ⅰ;CCK-8法检测细胞活力;流式细胞术检测细胞凋亡率;二氢溴化乙啶法检测细胞活性氧(reactive oxygen species, ROS)水平;荧光定量PCR法检测自噬相关基因7 (autophagy-related gene 7, Atg7)、三磷酸腺苷酶6 (adenosinetriphosphatase 6, ATPase6)和60S核糖体蛋白L13 (60S ribosomal protein L13, Rpl13)相对表达量,并计算ATPase6/Rpl13。结果:与C组比较,HG组和HG+NC组ROS水平和细胞凋亡率升高( P<0.05),细胞活力下降( P<0.05);与HG+NC组比较,HG+shRac1组ROS水平和细胞凋亡率降低( P< 0.05),细胞活力升高( P<0.05),Atg7相对表达量和BNIP3蛋白水平升高( P<0.05),p62蛋白水平降低( P<0.05),LC3Ⅱ/LC3Ⅰ升高( P<0.05),ATPase6/Rpl13降低( P<0.05)。 结论:抑制Rac1可减轻高糖诱发的神经元损伤,其机制可能与增强线粒体自噬有关。

七氟烷麻醉诱发新生大鼠远期学习记忆能力障碍与PSD-95/Kalirin-7/Rac1信号通路的关系

目的评价七氟烷麻醉诱发新生大鼠远期学习记忆能力障碍与突触后致密蛋白95(PSD-95)/Kalirin-7/Ras相关的C3肉毒杆菌毒素底物1(Rac1)信号通路的关系。方法SPF级雄性Wistar大鼠60只,7日龄,体重12~18 g,采用随机数字表法为分为5组(n=12):对照组(C组)、1%七氟烷麻醉2 h组(S1组)、1%七氟烷麻醉4 h组(S2组)、2%七氟烷麻醉2 h组(S3组)和2%七氟烷麻醉4 h组(S4组)。麻醉后第4、8和12周行Morris水迷宫实验。末次Morris水迷宫实验完成后,处死大鼠,取海马组织,HE染色观察病理学结果,TUNEL染色计算神经元凋亡率,分别采用Western blot法和qRT-PCR法检测PSD-95、Kalirin-7和Rac1及其mRNA的表达。结果与C组比较,麻醉后第4、8和12周S1组、S2组、S3组、S4组逃避潜伏期延长,穿越原平台次数减少,目标象限停留时间缩短,海马神经元凋亡率升高,磷酸化Rac1/Rac1比值降低,PSD-95、Kalirin-7及其mRNA表达下调(P<0.05);与S4组比较,S1组、S2组、S3组逃避潜伏期缩短,穿越原平台次数增多,目标象限停留时间延长,海马神经元凋亡率降低,磷酸化Rac1/Rac1比值升高,PSD-95和Kalirin-7及其mRNA表达上调(P<0.05),海马组织病理改变程度减轻。结论七氟烷麻醉诱导新生大鼠远期学习记忆能力障碍的机制可能与抑制海马PSD-95/Kalirin-7/Rac1信号通路活性有关。

LMP1瞬时过表达对鼻咽癌CNE2细胞迁移的影响

目的 :探讨潜伏膜蛋白1(latent membrane protein 1,LMP1)瞬时过表达对鼻咽癌CNE2细胞迁移的影响及其可能的作用机制。方法 :成功构建重组真核表达载体pEGFP-C1-LMP1,并将其瞬时转染至CNE2细胞,激光共聚焦显微镜下观察LMP1在CNE2细胞中的定位,Transwell法检测LMP1对CNE2细胞迁移和侵袭能力的影响,实时荧光定量PCR和蛋白质印迹法检测LMP1和Ras相关C3肉毒素底物1(Ras-related C3 botulinum toxin substrate 1,Rac1)mRNA及蛋白的表达。结果 :pEGFP-C1-LMP1成功转染至CNE2细胞后,可见LMP1主要表达于细胞膜和部分细胞质中,CNE2细胞的侵袭和迁移能力明显低于转染空载体的对照组(P<0.05),CNE2细胞中LMP1 mRNA及蛋白的表达水平明显高于转染空载体的对照组(P<0.01),而Rac1 mRNA及蛋白的表达水平明显低于转染空载体的对照组(P<0.05)。结论 :LMP1瞬时过表达可抑制鼻咽癌CNE2细胞的迁移,这一作用可能与Rac1表达下调有关。

Wnt5A基因过表达对黑素细胞骨架蛋白的影响

目的 探讨携带Wnt5A全基因序列的质粒转染原代黑素细胞后，Wnt5A表达升高对黑素细胞骨架蛋白的影响。方法 培养原代人表皮黑素细胞，并分为3组：①空白对照组：除细胞外不加任何试剂；②阴性对照组：加入空白的去内毒素pcDNA3.1（＋）质粒、Opti-MEM培养基及Lipo3000；③Wnt5A质粒组：加入Wnt5A去内毒素pcDNA3.1（＋）质粒、Opti-MEM培养基及Lipo3000。Wnt5A质粒转染黑素细胞，采用qPCR法检测各组Wnt5A、Ras相关C3肉毒素底物1（Rac1）、丝状肌动蛋白（F肌动蛋白）和β微管蛋白基因表达，Western印迹法测定Wnt5A、酪氨酸激酶受体2（ROR2）、Rac1、F肌动蛋白和β微管蛋白表达，并通过细胞免疫荧光试验观察细胞骨架蛋白表达情况。结果 qPCR法显示，Wnt5A质粒组、阴性对照组和空白对照组Wnt5A mRNA及其下游基因Rac1和F肌动蛋白mRNA表达量3组间差异均有统计学意义（F = 1 374.179、112.576、66.458，均P 〈 0.01），但β微管蛋白mRNA表达差异无统计学意义（P 〉 0.05）。Wnt5A质粒组Wnt5A、Rac1和F肌动蛋白mRNA表达量均显著高于空白对照组及阴性对照组（P 〈 0.05）。Western印迹法显示，Wnt5A质粒组Wnt5A蛋白表达较空白对照及阴性对照明显升高，差异均有统计学意义（P 〈 0.05）。Wnt5A质粒组Rac1、ROR2、F肌动蛋白表达均明显低于空白对照组和阴性对照组（P 〈 0.05），但β微管蛋白表达在3组间差异无统计学意义（P 〉 0.05）。细胞免疫荧光实验显示，Wnt5A质粒组绿色（β微管蛋白）、红色（F肌动蛋白）荧光强度与两个对照组相比均无明显差别，但黑素细胞体积明显增大，树突数目明显增多，细胞骨架显著改变，表现为F肌动蛋白强弱不一，纹理模糊，张力丝断裂，局部呈团块状。结论 黑素细胞Wnt5A基因表达升高可调控细胞骨架相关基因及蛋白表达，使黑素细胞体积增大、树突增多、骨架改变，可能有利于黑素小体的输送传递，参与色素沉着性疾病的发病。

缺氧条件下沉默Rab11基因的表达对子宫颈癌细胞系SiHa细胞侵袭和迁移能力的影响

目的通过观察缺氧条件下沉默Rabll基因对子宫颈癌细胞系SiHa细胞侵袭和迁移能力的影响，并探讨其可能的作用机制。方法实验分为4组：缺氧Rabll干扰组（缺氧状态下转染siRNA）、缺氧阴性干扰组（缺氧条件下转染空白无干扰意义的siRNA）、缺氧空白组（缺氧条件下培养）、常氧空白组（常氧条件下培养）。蛋白印迹法检测4组SiHa细胞中Ras相关蛋白11（Rabll）、整合素d5、整合素p3、磷酸化局部黏着斑激酶（p-FAK）、磷酸化磷脂酰肌醇3激酶（p-P13K）及Ras相关的c3肉毒素底物1（Racl）的表达水平；实时荧光定量PCR技术检测4组SiHa细胞中RabllmRNA的表达水平；体外侵袭实验检测4组SiHa细胞的侵袭能力；体外迁移实验检测4组SiHa细胞的迁移能力；免疫荧光法检测4组SiHa细胞中Racl蛋白的表达。结果（1）蛋白印迹法检测显示：①缺氧Rabll干扰组中SiHa细胞Rabll、整合素仪5、整合素133、p-FAK、p-P13K、Racl蛋白的表达水平分别为0．44±0．03、0．30±0．03、0．29±0．03、0．30±0．03、0．30±0．03、0．34±0．04；②缺氧阴性干扰组分别为0．72±0．03、0．73±0．03、0．59±0．03、0．61±O．03、0．59±0．03、0．72±0．03；③缺氧空白组分别为0．73±0．03、0．74±0．03、0．61±0．03、0．62±0．03、0．60±0．03、0．73±0．03；④常氧空白组分别为0．56±0．04、0．33±0．03、0．33±O．03、0．36±0．03、0．35±0．03、0．47±0．03。（2）4组SiHa细胞中RabllmRNA的表达水平，缺氧Rabll干扰组为0．570±0．046，缺氧阴性干扰组为1．442±0．101，缺氧空白组为1．454±0．114，常氧空白组为1．000±0．000。（3）4组SiHa细胞侵袭至小室下层的细胞数分别为，缺氧Rabll干扰组（50±11）个，缺氧阴性干扰组（104±17）个，缺氧空白组（106±16）个，常氧空白组（65±12）个。（4）4组SiHa细胞迁移的数量分别为，常氧空白组（127±12）个，缺氧空白组（169±15）个，缺氧阴性干扰组（161±13）个，缺氧Rabll干扰组（77±13）个。（5）免疫荧光法显示4组SiHa细胞核中周围分布有红色荧光，为Racl蛋白的定位表达。以上检测指标的比较结果均为：缺氧Rabll干扰组〈常氧空白组〈缺氧阴性干扰组〈缺氧空白组；缺氧Rabll干扰组的结果较缺氧空白组、缺氧阴性干扰组均明显降低（P〈O．05）；而缺氧空白组的结果与缺氧阴性干扰组比较，差异无统计学意义（P〉O．05）；缺氧空白组的结果较常氧空白组明显升高（P〈O．05）。结论缺氧促进子宫颈癌细胞系SiHa细胞的侵袭、迁移；缺氧时，Rabll蛋白下调能够抑制SiHa细胞的侵袭、迁移，其机制可能与整合素仅5、整合素133、p-FAK、p-P13K及Racl蛋白表达水平下降有关。

Racl在正常及庆大霉素耳毒性损伤豚鼠耳蜗中的表达

目的研究庆大霉素所致耳毒性损伤及应用抗氧化剂水杨酸钠保护时Racl在豚鼠耳蜗中的表达，探讨RacI在庆大霉素耳毒性机制中的作用。方法健康雄性白色红目豚鼠30只，按随机数字表法分成3组。对照组：腹腔内注射生理盐水，连续7d；庆大霉素组：腹腔内注射硫酸庆大霉素，连续7d；庆大霉素＋水杨酸钠组：腹腔内注射硫酸庆大霉素和水杨酸钠，连续7d。7d后处死大鼠，采用石蜡切片免疫组织化学染色技术检测各组豚鼠耳蜗Racl蛋白的表达与分布情况；提取耳蜗蛋白，采用Westernblot检测各组Racl蛋白表达水平。结果对照组耳蜗螺旋器和螺旋神经节细胞Racl呈弱阳性表达，主要表达于细胞浆和细胞膜；庆大霉素组耳蜗Racl表达增强；庆大霉素＋水杨酸钠组呈阳性表达，其表达程度介于对照组和庆大霉素组之间；各组灰度值比较差异有统计学意义（P〈0．05）。对照组耳蜗Racl蛋白有低强度表达；庆大霉素组耳蜗Racl蛋白表达最强；庆大霉素＋水杨酸钠组耳蜗Racl蛋白表达程度介于对照组和庆大霉素组之间；各组间蛋白电泳积分光密度值比较差异有统计学意义（P〈0．05）。结论Racl在正常豚鼠耳蜗螺旋器和螺旋神经节细胞的胞浆及胞膜弱表达，庆大霉素给药后耳蜗中Racl表达增强，同时给予抗氧化剂水杨酸钠后可使RacI表达较庆大霉素组减弱。提示Racl可能在庆大霉素导致耳蜗损伤过程中起作用。