鸽微RNA病毒实时荧光定量RT-PCR检测方法的建立

旨在建立鸽微RNA病毒(pigeon megrivirus,PiMeV)实时荧光定量RT-PCR检测方法。本研究根据GenBank中PiMeVs序列特征设计特异性检测引物,从信鸽粪便中检测到PiMeV阳性(命名为PiMeV-CHN001株),并对其3 C基因进行核苷酸同源性比较和遗传进化分析,明确其基因特征后,设计特异性实时荧光定量RT-PCR检测(RT-qPCR)引物组,建立检测PiMeV的RT-qPCR方法。结果显示:PiMeV-CHN001株3 C基因全长为591 bp,编码197个氨基酸,和其他2株野鸽源PiMeV(MeV-B1株和MeV-B2株)核苷酸相似性分别为89.5%和92.0%。建立的检测PiMeV的RT-qPCR方法的标准曲线Y轴截距为37.93,斜率为-3.335,相关系数为1.00,扩增效率为99.4%。特异性强,仅PiMeV出现特异性扩增信号和特异性峰值[Tm值为(81.69±0.22)℃],对鸽源禽流感病毒(avian influenza virus,AIV)、鸽源禽I型副黏病毒(pigeon paramyxovirus type I,PPMV-1)、鸽输血传播病毒(pigeon torque teno virus,PTTV)、鸽腺病毒(pigeon adenovirus,PiAd)及鸽圆环病毒(pigeon circovirus,PiCV)检测均未见特异性扩增信号;敏感性优,最低检测限为54.0拷贝·μL^(-1);重复性好,批内和批间变异系数均低于1.5%。用建立的检测方法对42份信鸽粪便样品进行检测,发现2份阳性样品(阳性率为4.76%)。本研究首次证实我国大陆地区信鸽中存在PiMeV,丰富了PiMeV宿主谱信息;建立的RT-qPCR方法为后续开展PiMeV流行病学研究提供支撑。

信鸽产酸克雷伯菌GS-BY-GG的分离鉴定

目的 分离并鉴定鸽源产酸克雷伯菌,探究其生物学特性及致病性。方法 剖检甘肃某信鸽棚发病鸽,观察并采集病变组织,通过观察病菌形态、生化试验、16S rRNA PCR鉴定和序列分析实现对致病菌的分离鉴定,结合组织病理学观察、药敏试验和致病性试验对分离菌株进行耐药性和致病性研究。结果 病鸽肝、肺、心等多器官出血,肝脏发黄且质地脆,肺脏发生化脓;从病鸽中成功分离到一株革兰氏阴性、短杆状菌株,麦康凯琼脂培养基上为粉红色光滑、湿润、圆形菌落,靛基质试验阳性;16S rRNA扩增序列与MN330093.1同源性达100.00%,表明病鸽感染产酸克雷伯菌,并命名为GS-BY-GG;产酸克雷伯菌GS-BY-GG对青霉素、氨苄西林和呋喃唑酮等10种药物耐药,对氟苯尼考、美罗培南和庆大霉素等5种药物敏感;组织病理学观察可见病鸽多器官出血,肝脏细胞排列不规则、多处可见棕黄色色素沉积,气管黏膜上皮广泛细胞坏死和脱落、黏膜层可见大量炎性细胞浸润;接种SPF雏鸡显示分离菌具有很强的致病性。结论 本研究成功分离了鸽源产酸克雷伯菌GS-BY-GG,研究结果为产酸克雷伯的临床诊断和防治提供数据支撑。

基于Sanger测序方法检测赛鸽竞翔相关基因的单核苷酸多态性

大量研究发现赛鸽中LDHA、F-KER、DRD4、MSTN和CRY1这5个基因存在单核苷酸多态性,并与归巢能力相关,成为分子辅助育种的潜在SNP标记。当前的检测方法仍以传统的RFLP为主,尚未报道Sanger测序的应用。通过建立一种基于Sanger测序技术的检测方法,以识别这5个基因中的多态性位点。结果表明:针对赛鸽的LDHA、F-KER、DRD4、MSTN和CRY1基因设计了特异性引物,用于扩增单核苷酸多态性位点,所得PCR产物条带单一,显示具有良好的特异性。进一步,利用这些引物对60羽赛鸽的羽毛DNA样品进行扩增和Sanger测序,能成功获得各个基因位点的多态性分型结果。最后,统计了各种基因分型在这60羽赛鸽中的分布频率,发现相关的罕见基因型频率均低于5%,与国外赛鸽群体的频率相一致。研究显示所建立的赛鸽竞翔相关基因SNP分型Sanger测序分析方法,对于选育优良基因型的赛鸽具有重要的应用价值。

鸽源ST443肺炎克雷伯菌的分离鉴定和生物学特性分析

为查明引起江苏省某养殖场赛鸽肺炎的病原及其生物学特性,本试验从患有呼吸道疾病的赛鸽肺组织中分离到1株肺炎克雷伯菌,通过形态学、生化鉴定、PCR扩增和16S rRNA基因测序对分离菌株进行鉴定,并采用多位点序列分型(MLST)、毒力基因检测、荚膜血清型分型、wzi基因测序、致病性分析、生物被膜形成能力测定、耐药基因检测、药敏试验和中药体外抑菌试验对分离菌株的生物学特性进行分析。结果显示,分离菌株为革兰阴性杆菌,显微镜下可见两端钝圆、杆状菌体,生化鉴定、khe基因PCR扩增和16S rRNA基因进化发育树分析确定其为肺炎克雷伯菌;MLST分型为ST443型;该菌株携带fimH、uge和wabG三种毒力基因;wzi基因测序鉴定分离菌株荚膜血清型为K16型;该菌株人工感染健康雏鸡可导致雏鸡多个器官出现不同程度的病变,半数致死量(LD_(50))为4.68×10^(9) CFU/mL;分离菌株具有中等生物被膜形成能力,携带bla SHV、bla TEM、tetM和sul 1四种耐药基因,对头孢曲松、头孢美唑、丁胺卡那、复方新诺明和多黏菌素敏感;中药明雄黄在体外对分离菌株有明显抑制作用。本试验为鸽源肺炎克雷伯菌感染的防控提供了参考。

应用RACE法克隆鸽恒定链基因的研究

为比较禽类恒定链的结构和功能,应用RACE(Rapid Amplification of cDNA Ends)技术首次克隆并鉴定了鸽恒定链基因。首先用一对含高度保守的DNA片段的简并引物,从鸽脾细胞RNA扩增部分恒定链片段,接着测序并设计新引物分别从5′和3′RACE扩增延长该片段。最后根据全基因的序列设计上、下游引物,获得大小为1050bp的全长cDNA。比较核苷酸序列,鸽与鸡的Ii链同源性达到82.8%,而与人等其它动物的同源性则在52.0%以上;其中633bp的开放阅读框编码211个氨基酸残基的前体蛋白。推导和分析氨基酸序列表明,分子结构与鸡恒定链相似,其中有些氨基酸残基表现出较高的保守性。

高效液相色谱法测定赛鸽用复方恩诺沙星胶囊中恩诺沙星和甲氧苄啶的含量

用高效液相色谱法同时分离测定赛鸽用复方恩诺沙星胶囊中恩诺沙星和甲氧苄啶的含量。采用NovaPakC18柱(150mm×3.9mm,4μm),以乙腈-磷酸溶液(0.025mol/L的磷酸溶液用三乙胺调节至pH3.5,摇匀,经0.45μm滤膜滤过)(15∶85,V/V)为流动相,流速为1.0mL/min,检测波长为254nm,柱温25℃。在此色谱条件下,恩诺沙星和甲氧苄啶的分离良好,它们的峰面积响应与浓度分别在25.1～150.4μg/mL和12.6～75.5μg/mL范围内呈良好线性关系(r>0.999);按外标法进行测定,以峰面积计算,恩诺沙星和甲氧苄啶的平均回收率分别为(99.5±0.49)%和(99.6±0.72)%,n=9;RSD分别为0.49%和0.72%。该法操作简便易行,系统适用性良好,适用于赛鸽用复方恩诺沙星胶囊中恩诺沙星和甲氧苄啶含量的测定。

体育运动纠纷的司法管辖——以信鸽运动为分析个案

在目前的司法体系中,相关判例对于信鸽运动纠纷的定性和判决结果不一。本文从司法管辖的角度,分析认为,对于信鸽运动纠纷中的单纯体育纠纷,应当赋予信鸽协会有限的自治权,确立仲裁前置的纠纷解决机制;对于信鸽运动纠纷中的民事纠纷和刑事纠纷,则应当明确由法院行使司法管辖权。

四君子汤对赛鸽抗氧化机能的影响

将72只45日龄赛鸽随机分成4组,Ⅰ组为对照组,Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ组为试验组。饲养至52日龄时试验组灌服四君子汤(剂量分别为0.125、0.250、0.500 g/L),每天2次,每次1 mL,对照组灌服等量生理盐水,连喂7 d。并分别于52、59、66日龄心脏采血分离血清,测定血清中超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)、过氧化氢酶(CAT)活性及丙二醛(MDA)活性。结果显示,四君子汤可以提高赛鸽血清中超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)、过氧化氢酶(CAT)活性,降低血清中丙二醛(MDA)含量,尤其以高剂量组作用较明显。证明四君子汤能够提高赛鸽抗氧化功能。

信鸽新城疫病毒P/Anhui/1/09株囊膜糖蛋白基因的遗传进化及氨基酸差异性位点分析

为分析流行于信鸽群中新城疫病毒致病株P/Anhui/1/09的分子遗传特性及其囊膜糖蛋白的差异性,采用RT-PCR法扩增其F和HN基因开放阅读框(ORF),并与已公布的主要代表性毒株序列进行遗传进化分析及615个全长F基因和480个全长HN基因推导氨基酸序列比对分析,同时对P/Anhui/1/09株进行型内遗传关系分析。结果显示:P/Anhui/1/09株F和HN基因开放阅读框长度分别为1 662 bp和1 716 bp,GenBank登录号分别为JQ290284和JQ305097,其F基因与NDV05-029、PG/CH/JS/1/06、CH/98-1鸽源毒株亲缘关系最近,同源率在98.2%～99.5%,同属基因VIb亚型,但与传统疫苗株LaSota、V4、B1和Mukteswar的遗传距离较远,同源率仅在84%～86.3%。HN基因ORF进化树分支拓扑结构与F基因相似。型内遗传关系分析显示,VIb亚型可进一步为VIb1～VIb5 5个进化分支,其中我国分离株都位于VIb1和VIb4进化分支中。氨基酸序列比对及糖基化位点分析显示,P/Anhui/1/09的F蛋白裂解位点氨基酸序列为112K-R-Q-K-R-F117,与NDV强毒株分子特征相符,并发现在七肽重复区旁497位新增一个潜在N-糖基化位点,除2个基因III型日本分离株(Miyadera和MIY/51)外,所有含497位新增糖基化位点的毒株都位于VIb1分支。包含P/Anhui/1/09株在内的大部分鸽源毒株在F蛋白aa132S(融合肽区)、aa259H和HN蛋白aa3H(胞质区)、aa122R、aa347G、aa349E存在一定特征性。

信鸽竞翔系统的设计和实现

信鸽竞赛活动日见增多,信鸽比赛的管理开始采用自动管理系统.介绍了信鸽竞翔系统的基本设计思想,并 给出了系统的软、硬件设计及实现框图.

一例鸽大肠杆菌病的病原鉴定及其致病性研究

为了确定某赛鸽公棚病死赛鸽的病原菌,试验从送检病死鸽的肝脏分离出病原菌,然后对病原菌进行纯化培养、染色、生化试验、血清型鉴定、菌毛基因PCR检测与系统发育分析,以及肠毒素基因PCR检测、动物致病性试验。结果表明:共分离得到7株病原菌,7株病原菌均符合大肠杆菌的生物学特性;血清型分别为O55(3/7)、O1(1/7)、O164(1/7),2株未定型;分离菌除O164外,其余6株均表达黏附素基因K99、肠毒素基因STa及LT毒力因子; O55分离株对试验鸽有一定的致病性。说明该公棚赛鸽病死系由大肠杆菌引起。

鸽新城疫HB株水佐剂灭活疫苗的制备及免疫特性

为有效控制临床中赛鸽新城疫的发生,将分离到的鸽新城疫河北毒株(HB株)灭活后制备成水佐剂疫苗,并对其物理性状、安全性、毒性、最佳免疫剂量和抗体产生时间、免疫持续期和保护效果及与鸡新城疫疫苗(LaSota株)对比效果进行检测。结果显示,使用0.10%甲醛37℃灭活16 h可彻底将病毒灭活,并且对病毒的效价影响最小;制备的水佐剂疫苗安全无毒副作用,采用0.3 mL剂量免疫雏鸽后7 d,有较低水平抗体产生,21 d抗体水平达到8.1 log2,28 d达到顶峰9.0 log2;免疫30 d后保护指数为100.0;与鸡新城疫疫苗(LaSota株)进行对比发现,制备的水佐剂疫苗攻毒保护率为100%,而鸡新城疫疫苗(LaSota株)仅为30%;制备的水佐剂疫苗在4℃条件下可保存180 d,20℃条件下可保存90 d。综上,采用鸽新城疫病毒HB株制备的水佐剂疫苗可在免疫后短时间内产生有效抗体,并且在受到强毒攻击时较鸡新城疫疫苗的保护率高。

矩形渠道翼形量水槽仿生优化试验研究

【目的】探索利用仿生技术优化翼形量水槽,期望降低过槽水头损失、提高临界淹没度,以适用于更小比降的渠道,助力国家节水行动。【方法】15种流量条件下,试验观测量水槽进口到出口多个测流断面的水位,对机翼形量水槽和仿赛鸽翼截面曲线型量水槽自由出流工况下的水头损失、壅水高度、佛汝德数、临界比降等水力参数进行分析与对比。【结果】仿赛鸽翼截面曲线型量水槽平均测流误差为1.28%,具有较高的测流精度,满足规范要求;与机翼形量水槽相比,临界淹没工况:平均壅水高度、平均水头损失分别降低7.46%、5.81%;上游可形成平稳缓流,Fr均小于0.4;工作的最小渠道比降接近1/5000,临界淹没度最大值达0.933。【结论】通过仿生优化方法改善量水槽性能可行,仿赛鸽翼截面曲线型量水槽各项量水性能指标优良,可用于大多数支渠、斗渠、农渠量水,在一定程度上解决了平原灌区渠道量水槽淹没出流误差大、阻水严重、适用范围小等问题,具有非常好的应用前景。

1株赛鸽新城疫强毒株的致病特性及分子特征分析

为了解赛鸽群中新城疫流行毒株的分子遗传特征及变异情况,从河北省疑似赛鸽新城疫病例中采集病料,常规处理后接种SPF鸡胚,经血凝试验(HA)和血凝抑制试验(HI)鉴定病毒,并对分离毒株进行致病性试验、毒力测定,采用RT-PCR方法扩增F基因,并与其他不同种属新城疫毒株进行遗传进化发育分析和氨基酸序列同源性分析。结果显示,从病料中分离到1株新城疫病毒(命名为HB株),致病性试验产生与发病鸽相似的临床症状和剖检变化;其鸡胚平均死亡时间(MDT)、1日龄雏鸡脑内致病指数(ICPI)和6周龄雏鸡静脉致病指数(IVPI)分别为52.8 h、1.78和2.59,表明HB株新城疫病毒为强毒株;HB株F基因碱基序列包含1个大小为1 662 bp的完整开放阅读框,基因分型结果显示,HB株属于基因型Ⅵ型。根据遗传进化发育关系和同源性分析结果发现,HB株与pi/CH/LGD/110208、dove/Italy/2736/00、Q-GB 506/97等毒株核苷酸序列相似性和氨基酸同源性较高,尤其与pigeon/Qinghai/1344/2017毒株亲缘关系最近,分别达98.45%和99.5%;与目前使用的传统新城疫疫苗毒株LaSota、B1、V4、Mukteswar株等遗传关系较远;F蛋白裂解位点氨基酸序列为112 R-R-Q-K-R-F 117,符合强毒株特征。以上结果表明,HB株为强毒株且与目前广泛使用的新城疫疫苗毒株遗传关系较远。

一株赛鸽新城疫病毒的分离鉴定及致病性研究

为了从疑似赛鸽新城疫的病料中进行新城疫病毒的分离鉴定及致病性研究,采用常规方法将24只未经任何免疫的30~40日龄雏鸽随机分成人工感染组和对照组,感染组肌肉注射分离的病毒,对照组通过相同途径接种等量生理盐水,观察临床症状,统计死亡率;对死亡病例进行剖检,取脏器组织常规处理、石蜡包埋、切片观察,测定分离毒株的鸡胚平均死亡时间(MDT)、1日龄雏鸡脑内致病指数(ICPI)、6周龄雏鸡静脉致病指数(IVPI),确定其毒力。结果表明:在疑似新城疫死亡的赛鸽体内分离出新城疫病毒,人工感染该病毒的雏鸽6d内全部死亡,该病毒的MDT为52.8h,ICPI为1.775,IVPI为2.59。说明新城疫病毒是导致该群赛鸽死亡的主要原因,且该毒株为强毒株。

基于鸽胸肌转录组挖掘其卓越飞行性能的分子标记

[目的]对赛鸽和观赏鸽胸肌组织的转录组进行比较分析,探讨鸽胸肌中与飞行性能相关的关键基因。[方法]通过差异分析获取赛鸽和观赏鸽胸肌中显著上调和下调的差异基因并进行富集分析。[结果]数据经质量控制共获得18.3 G的有效数据,筛选出477个差异表达基因,包含194个上调基因和130个下调基因。KEGG pathway显著性富集分析共筛选出3个与鸽飞行性能相关的候选基因,分别为MUSTN1、PDK4和MSTN。[结论]通过比较赛鸽和观赏鸽胸肌转录组数据,筛选与鸽飞行性能相关的关键基因,丰富了鸽的基因组信息,为进一步揭示鸽胸肌分子机理奠定了基础。

1株信鸽源鼠伤寒沙门氏菌的分离鉴定及其耐药性和毒力分析

本试验旨在鉴定临床疑似沙门氏菌感染致死信鸽的病原菌并确定致病菌的耐药及毒力状况。通过细菌分离培养、菌落形态观察、染色镜检、生化鉴定、血清分型、16S rRNA基因测序分析和康复信鸽血清平板凝集试验进行鉴定,并通过药敏试验、耐药基因和毒力基因检测进行耐药性和毒力分析。结果显示,分离纯化的细菌在BS、XLD、HE培养基上为黑色菌落,镜检为无荚膜、无芽孢的革兰氏阴性短杆菌;分离菌株生化反应结果符合沙门氏菌生化特性;分离菌株血清型为1,4,12:i:1,2;分离菌株16S rRNA基因序列系统进化树分析显示,该分离菌株与鼠伤寒沙门氏菌聚为一支,同源性>99%,康复信鸽血清与分离菌株发生特异性凝集,结合生化反应和血清分型结果该菌株鉴定为鼠伤寒沙门氏菌;分离菌株对氟苯尼考耐药,经耐药基因检测携带floR、cmlA氯霉素类耐药基因,与耐药表型相符;分离菌株mogA等17种毒力基因检测均为阳性。本试验成功分离到1株信鸽源鼠伤寒沙门氏菌,分离菌株对氟苯尼考耐药且具有较强毒力,为下一步信鸽沙门氏菌的防治和研究提供了参考依据。

赛鸽源致病性多重耐药海豚葡萄球菌分离鉴定

为确定长春市某鸽舍赛鸽暴发眼炎、肺炎的原因,从赛鸽肺脏、眼部渗出物分离培养获得1株致病菌。经过形态学观察、生化特性与耐药性分析、Partial kat(Catalase)基因与16S rRNA基因序列分析,确定该菌为凝固酶阳性、β内酰胺酶阳性海豚葡萄球菌,具有多重耐药特性。该病菌对氨苄西林、青霉素G、复方磺胺恶唑、甲氧苄氨嘧啶、克林霉素、红霉素、达福普丁、环丙沙星、四环素均耐药,对阿米卡星、庆大霉素、妥布霉素、头孢西丁、苯唑西林、替考拉宁、万古霉素、利奈唑胺、莫匹罗星、利福平敏感。动物试验证实,该菌株可以引起幼鸽的肺炎和眼部炎症。

一株赛鸽源鸽圆环病毒全基因克隆与序列分析

鸽圆环病毒(Pigeon circovirus,PiCV)是圆环病毒科的一个成员,是一种免疫抑制性病原。为了研究PiCV中国流行毒株的基因特征和遗传进化关系,本研究应用PCR方法对江苏省某赛鸽公棚的22份样品进行了PiCV检测,结果有6份样品为阳性。采用重叠PCR技术得到一株鸽圆环病毒全基因序列,命名为JS15-1(GenBank登录号:KX431143)。基因序列分析表明,JS15-1全长为2 034bp,包含3个主要开放阅读框。核苷酸同源性比较结果显示JS15-1与GenBank上登录的其他鸽圆环病毒分离株的全基因核苷酸同源性为85.3%~97.1%,与比利时分离的Bel20株同源性最高。不同鸽圆环病毒Rep基因同源性为92.1%~96.6%,Cap基因同源性为72.2%~99.4%。全基因遗传进化树显示JS15-1与之前的中国分离株处于不同的分支,而与Bel20的亲缘关系最近,Rep基因进化树显示JS15-1与Bel20、PiCV/Japan/2010、Ita4B位于同一分支,Cap基因进化树显示JS15-1与Bel20处于同一分支,亲缘关系最近。氨基酸序列比较发现,JS15-1与Bel20在Rep蛋白存在6个氨基酸残基的差异,而Cap蛋白存在1个氨基酸残基的差异和1个氨基酸残基的插入。研究结果表明,JS15-1极可能来源于比利时,而且发生了变异。

赛鸽新城疫病毒南京分离株的生物学特性及其F和HN基因的分析

从南京市某赛鸽公棚发病鸽脑组织中分离到1株鸽新城疫病毒,命名为Pi/NJ/CH/4416/2016(简称ND4416)。各项生物学特性试验结果表明,该分离株为鸽新城疫强毒,对鸽具有高致病性,对鸡的致病性相对较低。经RT-PCR扩增、测序得到分离株的F基因和HN基因序列。F基因分析表明,其裂解位点的氨基酸序列为^(112)R-R-Q-K-R-F117,是典型的强毒株共有序列。F、HN基因遗传进化分析发现,本次分离株的基因型为Class II,VIb亚型,且与目前国内流行株属于同一遗传分支,这些毒株与比利时流行株PPMV-1/Belgium/11-09620/2011(JX901124.1)的亲缘关系相近,推测近年国内流行毒株可能来源于比利时。本次分离毒株与弱毒疫苗株La Sota(AF077761.1)的遗传距离较远。生物信息学分析显示,该鸽源分离株HN蛋白第491~500位的一个线性抗原表位发生了改变,血清学试验也显示本毒株与La Sota疫苗株的抗原性差异明显,在一定程度上说明该鸽源毒株已经发生了抗原性变异。