基于种特异性COI标记的西花蓟马温室品系和羽扇豆品系一步双重快速鉴定技术

【背景】西花蓟马(Frankliniella occidentalis)是世界性农业和园艺作物害虫,也是我国重要的对外对内检疫对象。西花蓟马具有两个品系,即温室品系(greenhouse race,GR)和羽扇豆品系(lupin race,LR),二者在寄主范围、抗药性、生存环境等方面均具有明显差异,但外部形态相似,无法准确鉴别。【目的】以西花蓟马温室品系和羽扇豆品系为靶标,以田间常见的其他14种蓟马为参照,采用基于线粒体DNA细胞色素C氧化酶亚基I(mitochondrial DNA cytochrome c oxidase subunit I,mtDNA COI)基因的种特异性(species-specific COI,SS-COI)PCR法,研究一步双重品系快速检测技术。【方法】采用mtDNA COI基因通用引物获得西花蓟马温室品系和羽扇豆品系以及其他常见蓟马的COI序列,根据测序结果以及数据库已公开数据,设计筛选获得可同时扩增两个品系的特异性组合引物(TF6/GR32/LR12),其中TF6为品系通用上游引物,GR32为温室品系特异性下游引物,LR12为羽扇豆品系特异性下游引物,其扩增片段大小分别为温室品系362 bp、羽扇豆品系541 bp;对组合引物比例和退火温度进行优化;同时,对组合引物的种/品系特异性和灵敏性/检测阈值进行检验。【结果】当组合引物TF6/GR32/LR12比例为1.0/0.2/0.8、退火温度为44℃时,扩增效果最好。种/品系特异性检测结果证实,该检测技术仅对西花蓟马温室品系和羽扇豆品系具有扩增能力,对田间常见的其他14种蓟马包括花蓟马(Frankliniella intonsa)、禾花蓟马(Frankliniella tenuicornis)、黄胸蓟马(Thrips hawaiiensis)、大蓟马(Thrips major)、棕榈蓟马(Thrips palmi)、烟蓟马(Thrips tabaci)、普通大蓟马(Megalurothrips usitatus)、豆喙蓟马(Mycterothrips glycines)、草木樨近绢蓟马(Sussericothrips melilotus)、蔗腹齿蓟马(Fulmekiola serrata)、稻简管蓟马(Haplothrips aculeatus)、榕端宽管蓟马(Mesothrips jordani)、榕母管蓟马(Gynaikothrips ficorum)和横纹蓟马(Aeolothrips fasciatus)等不具有扩增能力。灵敏性检测结果显示,该组合引物不仅对单一品系或混合品系的成虫具有良好的扩增效果,对单粒卵、1龄和2龄幼虫以及预蛹和蛹均具有同样的扩增效能;对温室品系的最低检测阈值为35.90 pg·μL^-1,相当于1/10 240头雌成虫,对羽扇豆品系的最低检测阈值为146.95 pg·μL^-1,相当于1/2 560头雌成虫;同时,对来自不同地域的同一品系不同单倍型的成虫亦具有良好的扩增效能。【结论】建立的技术体系完全可以用于西花蓟马品系的快速鉴定及检疫监管,对有效阻截其进一步传播扩散及靶向防控措施制定意义重大。