中国林蛙(Rana chensinensis)蛙皮抗菌肽的制备及抗菌作用研究

目的从中国林蛙的皮肤中,提取纯化具有抗菌活性的多肽物质,并对其进行抑菌活性的研究。方法用甲醇进行粗提取。对提取的甲醇浓度、甲醇用量、浸提时间和浸提次数,采用L9(34)正交实验,以蛋白含量作为指标,确定最佳提取条件。得到的粗提物经Sephadex G-75、Sephadex G-50和Sephadex G-25凝胶过滤进一步分离纯化获得抗菌肽。对抗菌肽进行氨基酸组成分析,采用杯碟法进行抑菌活性研究。结果提取林蛙抗菌肽的最佳工艺条件:甲醇浓度80%、甲醇体积为蛙皮重量的6倍、提取时间24h,提取次数3次。提取的粗提物经凝胶过滤后得到抗菌肽。抗菌肽的氨基酸组成中,碱性氨基酸占22.1%,酸性氨基酸占13.9%。抗菌肽对细菌的最低抑菌浓度分别为:枯草杆菌73.25μg/ml,金黄色葡萄球菌51.75μg/ml,大肠杆菌51.75μg/ml,铜绿假单胞菌51.75μg/ml。结论经甲醇提取和凝胶过滤可从中国林蛙皮肤得到抗菌肽,该抗菌肽为碱性多肽,对革兰阳性细菌、革兰阴性细菌均有抑制作用。

牛蛙(Rana catesbeiana)腐皮红腿症病理学观察

【目的】观察牛蛙腐皮红腿症的病理学改变。【方法】通过石蜡切片,H.E染色法,对发生腐皮红腿症的牛蛙自然病例进行病理形态学变化观察。【结果】剖检发现病蛙头、背部皮肤腐烂,露出肌肉,腹部及腿部皮肤出血发红;肝肿大,严重充出血,呈花瓣状;脾、肾出血肿大,颜色加深;胃肠道黏膜出血发红,内充满大量淡黄色黏液。镜检以全身多组织器官充出血、实质细胞变性、坏死及炎症细胞浸润为主要特征,以皮肤肌肉、肝、脾、肾和胃肠道的变化最为明显。胃肠道表现为严重的出血性、卡他性炎症,胃肠黏膜上皮严重坏死、脱落;肝细胞严重空泡变性,并出现大面积坏死,肝间质充满大量炎症细胞;脾脏淋巴细胞、网状内皮细胞严重坏死;肾间质充血,肾小管上皮细胞广泛坏死,肾小球毛细血管严重充血。【结论】头背部体表皮肤溃烂,腹部及四肢出血,肝、脾、肾、胃肠道等多器官组织炎性病变是本病的示病症状。机体多器官组织严重病变是引起病蛙死亡的主要因素。

棘胸蛙腐皮病病原菌分离鉴定及五倍子水提液的治疗效果探究

近年来随着棘胸蛙的人工养殖规模逐渐扩大,各种细菌性疾病发生频率也连年增高,其中腐皮病是棘胸蛙常见细菌性疾病之一。患腐皮病的棘胸蛙症状起初是表皮脱落出现白斑,而后白斑逐渐扩大甚至深达肌底,后期因细菌感染引发的炎症而死亡。目前棘胸蛙腐皮病只有报道使用抗生素进行治疗,为探究中草药能否替代抗生素对棘胸蛙腐皮病进行治疗,采用常规的细菌分离纯化及16S rRNA序列扩增确定患腐皮病棘胸蛙的主要病原菌,使用五倍子水提液和其他抗生素开展药敏对比试验,并根据前期养殖场的调研,选用五倍子水提液对棘胸蛙腐皮病进行治疗效果探究。结果表明:患腐皮病棘胸蛙病患处的主要病菌为嗜水气单胞菌Aeromonas hydrophila和维氏气单胞菌Aeromonas veronii;药敏对比试验表明,2种病原菌均对甲砜霉素、氟苯尼考、恩诺沙星、维生素C磷酸酯镁盐酸环丙沙星、硫酸新霉素、强力霉素高度敏感,对五倍子水提液中度敏感。通过治疗试验发现,五倍子水提液治疗组患腐皮病棘胸蛙存活率达100%,且在治疗20 d内患处得到明显缓解。研究发现五倍子水提液虽然对于腐皮病的致病菌只有中度抑菌效果,但是在实际治疗中可以有效控制和治疗棘胸蛙腐皮病,可能五倍子水提液除了抑菌作用之外,还发挥了其他的保健功效。

一种具抗氧化功效的林蛙皮多肽及其提取工艺

具有抗氧化能力的小分子活性肽已成为研究热点,由于大多数蛙皮提取存在工艺处理时间久且成本高的问题,很难将其生产扩大到工业水平。该研究结合化学及与蛋白酶的反应,针对林蛙皮进行多肽的处理及提取。结果表明,借由化学反应后的林蛙皮提取物,只要再经过1 h的酶反应,即能达到优化的多肽提取物,此类多肽提取物对于DPPH、ABTS及NO等自由基具有非常好的去除率,并且在铁还原力上,多肽提取物也比未经过蛋白酶处理的林蛙皮提取物更佳。在细胞层面上,多肽提取物除了不具有细胞毒性,对于活性氧也能有效清除。此外,其亦能吸收较短波长的紫外线,对于作为未来皮肤保护用途的医疗成分,具有一定的潜能。

云南昆明地区三种蛙皮肤显微结构的比较

对昆明地区的多疣狭口蛙、昭觉林蛙及黑斑蛙的背腹皮肤切片的显微结构进行了观察和比较,尤其对它们皮肤腺体的类型和功能进行了比较分析。结果表明:多疣狭口蛙皮肤比昭觉林蛙及黑斑蛙皮肤含有更多的腺体,尤其是颗粒腺比后两者含量更为丰富,并且在皮下存在许多腺体团,背腹皮肤较后者厚。昭觉林蛙皮肤较黑斑蛙的含有更多的颗粒腺和粘液腺。3种蛙的背部皮肤都含有色素细胞,而除了在多疣狭口蛙雌性腹部观察到少量色素细胞外,另两种蛙在腹部皮肤中均未见色素层。相比之下,昭觉林蛙和黑斑蛙皮肤结构较相似,两者同多疣狭口蛙在皮肤腺体分布及数量上差别较大,这也体现了三者不同的生态适应机制。

黑斑蛙、虎纹蛙和牛蛙皮肤的比较组织学

应用H.E和V.G胶原染色法对黑斑蛙(Rana nigromaculata)、虎纹蛙(Rana rugulosa)和牛蛙(Rana catesbeiana)皮肤进行了组织学观察和参数测量与比较.结果表明:三种蛙皮肤组织结构相似,但皮肤厚度、各组织层相对厚度及腺体密度存在较明显的种间差异和部位差异.虎纹蛙的皮肤最厚(0.44-0.68mm),牛蛙其次(0.28-0.60mm),黑斑蛙最薄(0.19-0.38mm);在三种蛙中,黑斑蛙躯体多数部位表皮相对厚度为15.1%-22.6%,较虎纹蛙(10.9%-17.7%)和牛蛙(9.9%-21.8%)厚.虎纹蛙和牛蛙皮肤胶原纤维层相对厚度分别为59.9%-68.7%和51.6%-75.3%,较黑斑蛙(44.4%-69.0%)厚;黑斑蛙和虎纹蛙躯体多数部位的颗粒腺密度(4.5-23.1个/mm2;8.9-25.3个/mm2)和粘液腺(54.1-152.2个/mm2;68.6-127.5个/mm2)较牛蛙(1.4-10.8个/mm2;16.8-39.3个/mm2)高.研究结果可供蛙类皮肤的合理开发利用参考.

牛蛙皮肤抗菌肽的分离纯化与活性测定

目的分离纯化牛蛙皮肤抗菌肽,并检测其活性。方法通过刺激与浸提的方法,得到牛蛙皮肤抗菌肽粗提物,测定其抑菌活性及最低抑菌浓度。利用SephadexG-50凝胶过滤和反相高效液相色谱(RP-HPLC)分离纯化粗提物,用质谱仪测定多肽的相对分子质量及氨基酸序列,并进行活性检测。结果两种方法提取的牛蛙皮肤抗菌肽粗提物均具有较强的抑菌活性,纯化后的多肽相对分子质量约为4370,N-端含22个氨基酸,与其他两栖类来源的抗菌肽同源性较低。活性试验表明均无胰蛋白酶水解活性,存在一定的胰蛋白酶抑制剂活性,有轻微的溶血活性,不具有局部出血活性,具有抗凝和溶栓作用。结论已成功分离并纯化了1种新的牛蛙皮肤抗菌肽。

林蛙皮胶原蛋白肽的制备工艺

以长白山林蛙皮为原料,选用碱性蛋白酶,对酶解温度、酶解时间、加酶量、pH、料液比五个因素来研究,经实验确定最佳酶解条件为:酶解温度50℃,加酶量0.5%,酶解时间3h,pH9.0,料液比1∶3(g/mL),脱色脱腥处理后,喷雾干燥制得微黄色粉末状林蛙皮胶原蛋白肽。结果表明,羟脯氨酸含量为20.69μg/mL,分子量分布在3.5ku以下。

圈养与野生东北林蛙皮肤营养成分比较研究

采用化学及仪器分析方法,对圈养和野生雌性林蛙皮肤的几种营养成分进行了比较研究。结果表明:圈养林蛙皮肤的粗脂肪和总磷脂含量分别比野生林蛙高10.88%和15.14%。野生蛙皮的Ca、P含量较圈养的分别高出70.61%和22.49%,圈养蛙皮的Zn含量较野生的高14.38%。野生蛙皮较圈养蛙皮的80%甲醇提取率高2.36%,对提取物进行柱层析结果显示圈养蛙皮与野生蛙皮不同浓度乙醇洗脱物中氨基酸种类存在差异。

林蛙皮胶原蛋白肽酶解工艺数学建模及抗氧化作用的研究

采用数理统计和数据拟合分析方法对林蛙皮胶原蛋白肽(LWT)酶解过程中的影响因素进行优化,建立了LWT酶解过程中影响因素与水解度关系的数学模型,验证了水解度的最佳值(峰值)。采用聚丙烯酰胺凝胶电泳方法证明LWT的相对分子质量在3 500以下,HPLC表明其纯度较高。研究了LWT对溴代苯小鼠肝损伤的抗氧化作用,结果表明:LWT具有显著降低小鼠肝组织中MDA质量分数和显著升高小鼠肝组织中SOD活力的作用,具有抗氧化作用。

牛蛙腐皮病致病细菌的初步研究

对牛蛙腐皮病的致病菌进行了分离、鉴定和人工感染。从病蛙上分离到5株细菌，通过对健康牛蛙人工感染试验，得知奇异变形杆菌（Proteusmirabilis）和克氏耶尔森菌（Yeriniakristensenii）具有较强致病力，而其他三株菌无致病力。

林蛙皮胶原蛋白的提取及抗氧化性

用木瓜蛋白酶提取林蛙皮胶原蛋白,采用单因素试验和正交试验设计优选最佳提取工艺,并对林蛙皮胶原蛋白的抗氧化性进行研究。结果表明:林蛙皮胶原蛋白的最佳提取工艺是加酶量为1%,料液比为1∶20(g/mL),pH为5.5于室温反应36 h,此条件下胶原蛋白提取率为24.71%,纯度为72.03%。林蛙皮胶原蛋白具有一定的还原能力,对羟自由基具有一定的清除能力,并且随着浓度的增加抗氧化活性逐渐增强。

中国林蛙皮肤抗菌活性肽的分离提取

将中国林蛙毁双髓,置冰浴中迅速剥皮,冲洗血污后粉碎,经 80%甲醇抽提 2次;再经sephadexG-100、sephadexG-25和聚丙烯酰胺凝胶电泳分离等,从林蛙皮肤中分离获得 5种小分子多肽。抗菌活性试验表明:经sephadexG-25凝胶过滤获得的小分子多肽洗脱峰第 6峰,对革兰氏阴性菌及革兰氏阳性菌具有较强的抗菌活性;SDS-PAGE电泳表明为单一区带,此抗菌活性多肽的相对分子量为 4. 31ku。

美国青蛙腐皮病病原的研究

Three bacteria strains were isolated from the skin tissue of Rana grylio with "necrotic skin disease".After artificial infection by the bacteria strain skin 1-3 was determined to be the pathogen of the "necrotic skin disease".It was identified to be Acinetobacter lwoffii by VITEK-AMS-60 automatic identification system.The bacteria were rod shaped with a size of (0 75～0 93 ) μm×(1 5～2) μm, Gram-negative, and non-mobile. It was sensitive to 17 species of drugs and resistant to 5 drugs.

中国林蛙蛙皮肽提取工艺的研究

以中国林蛙的皮肤为研究对象,从中提取出一种具有抗菌作用的蛙皮肽。在单因素实验的基础上,通过正交实验筛选出提取蛙皮肽的最佳工艺条件,即甲醇浓度80%,液固比为6,提取时间24h,提取次数3次。

柱前衍生RP-HPLC法测定林蛙皮胶原蛋白肽中18种氨基酸含量

采用柱前衍生反相高效液相色谱(RP-HPLC)法,测定林蛙皮胶原蛋白肽(LWT)中18种氨基酸的含量。色谱柱为Ultimate○RAA氨基酸分析专用色谱柱(4.6×250mm,5μm);衍生试剂为异硫氰酸苯酯(PITC);流动相A:0.1moL/L醋酸钠溶液(pH6.5)和乙腈按93∶7的比例混合,流动相B:水-乙腈=20∶80,流速为1.0mL/min,进行梯度洗脱;检测波长为254nm。结果显示,18种氨基酸的分离效果良好,氨基酸浓度与峰面积呈良好的线性关系;定量得到LWT中Glu,Gly,Lys,Leu等18种氨基酸的含量。

棘胸蛙烂皮病奇异变形杆菌的分离、鉴定及对药物敏感性研究

从患烂皮病的棘胸蛙(Rana spinosa)中分离到一株致病菌,通过形态学、生理生化试验等方法鉴定该致病菌株为奇异变形杆菌(Proteus mirabilis)。同时,通过抑菌圈法研究了该菌株对11种抗生素、11种中草药、4种消毒剂的敏感性。结果显示:该菌株对头孢曲松、阿莫西林、链霉素、诺氟沙星、庆大霉素、卡那霉素、氯霉素等抗生素敏感,对四环素、红霉素不敏感;未观察到黄芪、茵陈对该菌的抑制作用,忍冬藤抑菌效果最好,其次依次为紫花地丁、金银花与甘草、鱼腥草、大青叶与柴胡、陈皮、黄连;致病菌株对消毒剂的敏感性依次为:高锰酸钾﹥三氯异氰脲酸﹥硫酸铜﹥氧化钙。

沼泽绿牛蛙皮肤抗菌肽的分离纯化与活性检测

以沼泽绿牛蛙皮肤分泌液为样品,采用C18反相柱液相色谱,使用线性梯度洗脱方法,参照获得的RP-HPLC图谱,对图谱结果分析,按每峰一管收集洗脱液,得到分离纯化的活性多肽。用纸片法测定每管的抗菌活性,对抗菌活性最强的洗脱液进行氨基酸序列测定,查询数据库并进行序列比对,发现与牛蛙抗菌肽RANATUER IN2、RANATUER IN3有序列相似性,推断其可能是沼泽绿牛蛙皮肤分泌液中的抗菌肽。

繁殖期东北林蛙两性皮肤组织结构的差异性比较

为了研究繁殖期东北林蛙两性皮肤组织结构的差异,应用苏木精-伊红(Hematoxylin-eosin Stain,HE)染色方法对东北林蛙两性皮肤组织结构进行研究。结果显示:两性皮肤的总厚度在头、躯干背、腹部存在极显著差异(P<0.01),其中背部皮肤雌性比雄性厚,腹部皮肤雄性比雌性厚;躯干侧部皮肤雄性比雌性厚,且二者之间有显著差异(P<0.05);皮肤各部均有颗粒腺和粘液腺分布,且颗粒腺较粘液腺大,此外在雄性背部皮肤中还发现有特殊粘液腺。上述东北林蛙两性皮肤的结构特点与其生殖、呼吸以及防御功能有关。

东北黑斑蛙皮肤抗菌肽的分离及抗菌活性检测

从成年及幼年两组东北黑斑蛙皮肤分泌物中分离抗菌肽,并对其抗菌活性进行检测。采用电刺激法,收集黑斑蛙皮肤分泌物,应用反相高效液相色谱仪进行分离,应用MALDI-TOF/TOF质谱仪鉴定,通过最小抑菌浓度(MIC)试验,检测抗菌肽的抑菌效果。结果表明,AMP1及AMP2的抑菌作用较好,相对分子量分别为3 349.205 Da及1 373.820 Da。AMP1的MIC值分别为耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)16μg/ml、金黄色葡萄球菌8μg/ml、枯草芽孢杆菌64μg/ml、肠炎耶尔森氏菌16μg/ml、肺炎克雷伯菌64μg/ml、大肠杆菌8μg/ml;AMP2的MIC值分别为金黄色葡萄球菌32μg/ml、枯草芽孢杆菌128μg/ml、肠炎耶尔森氏菌32μg/ml、大肠杆菌16μg/ml。试验结果表明,分离得到的抗菌肽具有广谱抗菌性,具有一定的开发潜力。