Ras同源基因家族成员A/Rho相关卷曲螺旋蛋白激酶信号转导通路在膝骨性关节炎软骨组织中的表达及意义

目的:探究Ras同源基因家族成员A(RhoA)/Rho相关卷曲螺旋蛋白激酶(ROCK)信号转导通路在膝骨性关节炎软骨组织中的表达及意义。方法:将取自因原发性膝骨性关节炎(KOA)行全膝关节置换术(TKA)去除的30例患者的膝关节软骨组织设为观察组,将同期行下肢离断术去除的25例患者的膝关节软骨组织设为对照组。比较两组标本外观形态,HE染色、番红O-固绿染色、电镜扫描结果。通过免疫组织化学(IHC)染色、免疫印迹(Western blot)及实时荧光定量PCR(RT-qPCR)检测RhoA和ROCK蛋白及mRNA的表达变化。结果:观察组股骨髁软骨表面粗糙,缺损明显,呈溃疡状,染色不均匀,潮线不完整。对照组软骨面光滑平整,组织分层明显,颜色均匀。电镜扫描结果显示,观察组软骨组织毁损严重,结构不清;对照组表面光洁,软骨间质均匀。与对照组比较,观察组关节软骨组织中RhoA、ROCK蛋白及mRNA表达量高于对照组(均P<0.05)。结论:RhoA/ROCK信号转导通路中的RhoA、ROCK蛋白及mRNA在KOA患者关节软骨组织中表达明显高于行下肢离断术患者,提示RhoA/ROCK信号转导通路与KOA软骨退变具有相关性,可能对KOA的发生与发展起到了重要作用。

Ras同源物基因家族成员B对肾透明细胞癌细胞生长及迁移能力的影响

目的研究干扰Ras同源物基因家族成员B(Ras homolog gene family member B,RhoB)表达后对肾透明细胞癌(renal clear cell carcinoma,RCCC)细胞生长及迁移能力的影响。方法检测RhoB在RCCC细胞中的蛋白表达水平,采用脂质体转染方法转染RhoB真核表达载体pcDNA3.0-Flag-RhoB和沉默RhoB的小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)即si-RhoB序列及相应空载体和对照序列,应用Western Blot法检测转染后RhoB的蛋白表达情况,通过3-(4,5-二甲基吡啶-2-基)-5-(3-羧基甲氧基苯基)-2-(4-磺苯基)-2H-四唑[3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-5-(3-carboxymethoxyphenyl)-2-(4-sugophenyl)-2H-tetrazolium,MTS]法、平板克隆和Transwell小室细胞迁移实验检测细胞生长和细胞迁移能力的变化。结果 RhoB在RCCC细胞中表达降低。与转染空载体组比较,转染pcDNA3.0-Flag-RhoB重组质粒组RhoB的蛋白表达水平明显上调;与转染对照组比较,si-RhoB转染组RhoB的蛋白表达水平明显下调。在RCCC细胞786-O和Caki-1中,上调RhoB的表达后,在4、5、6 d经MTS法测定光密度值明显降低(P<0.05);在786-0细胞中上调RhoB表达后细胞克隆数明显减少;转染48 h后Transwell细胞迁移数明显减少(P<0.05)。而下调RhoB表达后,细胞生长和Transwell细胞迁移数没有明显变化。在相对高表达RhoB的正常人肾小管上皮细胞中下调RhoB表达后细胞生长和细胞迁移数明显增多。结论过表达RhoB后明显抑制RCCC细胞生长和迁移能力。

番茄红素调节RAS同源基因家族成员A/Rho相关激酶信号通路对氧化低密度脂蛋白诱导脑血管内皮细胞凋亡的影响

目的探讨番茄红素(LYC)调节RAS同源基因家族成员A(RhoA)/Rho相关激酶(ROCK)信号通路对氧化低密度脂蛋白(ox-LDL)诱导的脑血管内皮细胞(EC)凋亡的影响。方法未做任何处理的人脑微血管内皮细胞(HBMECs)设为NC组;采用ox-LDL处理的HBMECs分为ox-LDL组、LYC组(0.5μmol/L的LYC处理HBMECs)、溶血磷脂酸(LPA)组(5μmol/L RhoA/ROCK信号通路激活剂LPA处理HBMECs)、LYC+LPA组(0.5μmol/L的LYC以及5μmol/L LPA共同处理HBMECs);处理24 h后用于后续实验。采用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测HBMECs细胞因子水平;CCK-8法检测HBMECs增殖;流式细胞术检测HBMECs凋亡率;Western blot检测细胞血小板内皮细胞黏附分子-1(CD31)、平滑肌(SM)22α、BCL-2相关X蛋白(Bax)、B细胞淋巴瘤/白血病-2蛋白(Bcl-2)、裂解的半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3(cleaved-Caspase-3)、RhoA/ROCK通路相关蛋白表达。结果与NC组相比,ox-LDL组单核细胞趋化蛋白1(MCP-1)、白细胞介素(IL)-6、血管内皮细胞黏附分子1(VCAM-1)、HBMECs凋亡率、Bax、cleaved-Caspase-3、SM22α、RhoA、ROCK1蛋白水平升高,OD值、Bcl-2、CD31蛋白水平下降,差异有统计学意义(P<0.05);与ox-LDL组相比,LYC组MCP-1、IL-6、VCAM-1、HBMECs凋亡率、Bax、cleaved-Caspase-3、SM22α、RhoA、ROCK1蛋白水平降低,OD值、Bcl-2、CD31蛋白水平升高,差异有统计学意义(P<0.05),而LPA组趋势相反;LPA减弱了LYC对ox-LDL诱导的HBMECs凋亡的改善作用。结论LYC可能通过抑制RhoA/ROCK信号通路来减轻HBMECs凋亡。

沉默Ras同源物家族成员C对唾液腺腺样囊性癌增殖、侵袭和迁移的影响

目的探讨沉默Ras同源物家族成员C(RhoC)对唾液腺腺样囊性癌(SACC)增殖、凋亡、侵袭、迁移和上皮-间充质转化(EMT)的影响及其分子机制。方法选择2019年1月1日—2024年3月1日于青岛市市立医院手术切除的SACC病灶和正常唾液腺组织各27例,通过蛋白免疫印迹(Western blot)和免疫组织化学法检测RhoC的表达水平。针对RhoC基因序列设计3条小干扰RNA(siRNA),转染至SACC-LM和SACC-83细胞系中并评估转染效率。通过Western blot比较RhoC、Rho相关卷曲螺旋蛋白激酶1(ROCK1)、p38丝裂原活化蛋白激酶(p38MAPK)、磷酸化p38MAPK(p-p38MAPK)、扭曲家族bHLH转录因子1(TWIST1)、E-钙黏蛋白(E-cadherin)、N-钙黏蛋白(N-cadherin)、波形蛋白(Vimentin)的蛋白表达水平。CCK-8实验、流式细胞术、Transwell侵袭实验、伤口愈合实验分别检测各组细胞增殖、凋亡、侵袭和迁移能力的差异。生物信息学方法预测RhoC可能的上游微小RNA(miRNA)及其在SACC中的表达情况,双荧光素酶报告基因实验验证二者的结合位点。结果RhoC在SACC中的表达显著上升(P<0.05)。沉默RhoC后,实验组ROCK1、p-p38MAPK、TWIST1、N-cadherin、Vimentin的表达显著下降,E-cadherin的表达显著上升(P<0.05);p38MAPK的表达无明显差异(P>0.05);细胞增殖、侵袭和迁移能力显著下降,凋亡率显著上升(P<0.05)。miR-138-5p在SACC中低表达,miR-138-5p micmic可以显著下调转染RhoC野生型质粒后293T细胞的荧光素酶活性(P<0.05)。结论RhoC在SACC中高表达,沉默RhoC可能靶向下游ROCK1/p38MAPK/TWIST1信号通路从而抑制SACC的增殖、侵袭、迁移和EMT,同时促进其凋亡。miR-138-5p在SACC中低表达,是RhoC潜在的上游基因,二者可能存在结合位点。

人Ras同源物基因家族成员B真核表达载体的构建及对肾癌细胞786—0增殖和凋亡的影响

目的观察人Ras同源物基因家族成员B（RhoB）对肾癌细胞株786一O细胞增殖和凋亡的影响。方法构建pcDNA3．0-Flag—RhoB真核表达载体，脂质体转染法将其转入肾癌细胞786一O，利用Westernblot检测细胞中RhoB的表达。用MTS法和流式细胞仪检测RhoB对肾癌细胞增殖和凋亡效应的影响。结果真核表达载体pcDNA3．0-Flag-RhoB构建成功，脂质体转染后RhoB在786一O细胞中表达明显升高；在转染后48、72、96h，重组质粒组细胞的增殖速度明显低于空载体组和阴性对照组（P〈0．05）；转染重组质粒细胞凋亡率为（24．05±0．60）％，明显高于空载体组[（1．67±0．30）％]和阴性对照组[（1．22±0．50）％，P〈0．05]。结论RhoB对肾癌细胞具有抑制增殖和诱导凋亡的作用。

呼吸康复训练联合百令胶囊通过人RAS同源基因家族成员A/Rho-kinase信号通路对慢性阻塞性肺疾病患者的疗效及肺功能的影响

目的:探究呼吸康复训练联合百令胶囊通过人RAS同源基因家族成员A(RhoA)/Rho-kinase信号通路对慢性阻塞性肺疾病(COPD)患者的疗效及肺功能的影响。方法:选择2016年2月至2017年9月陆军第八十一集团军医院100例COPD患者,按照随机数字表法分为对照组和联用组,每组50例,同期挑选50例健康人群作为空白组。对照组患者给予百令胶囊进行治疗,百令胶囊+呼吸康复训练联用组采用呼吸康复训练联合百令胶囊进行治疗。分别分析各组患者肺功能[最大深吸气后第1秒用力呼出气体容积(FEV 1)、用力肺活量(FVC)、FEV 1/FVC]情况和临床疗效,通过免疫印迹、实时荧光定量聚合酶链式反应(qRT-PCR)检测RhoA、RockⅠ/Ⅱ蛋白和mRNA的表达。结果:经治疗,联用组的肺功能各项指标FEV 1、FVC、FEV 1/FVC显著高于对照组[(2.34±0.91)L比(1.91±0.83)L、(2.98±0.83)L比(2.34±0.86)L、(79.63±9.95)%比(76.13±6.97)%](P<0.05);与空白组相比,其余各组RhoA mRNA、RockⅠ/ⅡmRNA显著增高(P<0.05),与对照组相比,联用组RhoA mRNA、RockⅠ/ⅡmRNA显著降低(2.46±0.18比4.38±0.21、1.72±0.11比2.36±0.24、1.79±0.24比3.34±0.21)(P<0.05);经治疗后,联用组6 min步行实验(6MWD)和临床总有效率[92.00%(46/50)比78.00%(39/50)]显著优于对照组(P<0.05)。结论:呼吸康复训练与百令胶囊联用能够显著改善COPD患者肺功能,提高临床疗效,并且可以通过RhoA/Rho-kinase信号通路下调RhoA、RockⅠ/Ⅱ蛋白和mRNA的表达。

汉黄芩素干预糖尿病脑梗死模型大鼠的神经损伤

背景:汉黄芩素是黄芩根中提取的一种黄酮类化合物,既往研究表明汉黄芩素对脑缺血再灌注损伤有保护作用,还能降低糖尿病小鼠的血糖及其并发症,但其在糖尿病脑梗死中的作用及机制还不清楚。目的:探究汉黄芩素对糖尿病脑梗死大鼠神经损伤的影响,并探究其作用机制。方法:将SD大鼠随机分为6组:对照组、模型组、汉黄芩素低、中、高剂量组和汉黄芩素高剂量+RhoA激活剂组,每组10只。除对照组外,其余组通过腹腔注射链脲佐菌素和大脑中动脉闭塞法构建糖尿病脑梗死大鼠模型,汉黄芩素低、中、高剂量组分别灌胃10,20,40 mg/kg汉黄芩素,汉黄芩素高剂量+RhoA激活剂组灌胃40 mg/kg汉黄芩素并腹腔注射10 mg/kg溶血磷脂酸,对照组和模型组给予等量生理盐水,1次/d,连续7 d。末次给药结束后,各组大鼠进行神经功能缺损评分,检测血糖水平,TTC染色检测脑梗死体积,苏木精-伊红染色观察脑组织病理变化,ELISA试剂盒检测脑组织中肿瘤坏死因子α、白细胞介素6和丙二醛、超氧化物歧化酶水平,Western blot检测脑组织中RhoA、ROCK2蛋白表达。结果与结论:(1)与对照组相比,模型组大鼠神经元结构严重受损,细胞坏死、变性;神经功能缺损评分、血糖水平、脑梗死体积升高(P<0.05);脑组织中肿瘤坏死因子α、白细胞介素6、丙二醛水平升高(P<0.05),超氧化物歧化酶水平下降(P<0.05);脑组织中RhoA、ROCK2蛋白表达升高(P<0.05);(2)与模型组相比,汉黄芩素低、中、高剂量组神经元损伤改善,细胞变性和坏死减少;神经功能缺损评分、血糖水平、脑梗死体积下降(P<0.05);脑组织中肿瘤坏死因子α、白细胞介素6、丙二醛水平下降(P<0.05),超氧化物歧化酶水平升高(P<0.05);脑组织中RhoA、ROCK2蛋白表达下降(P<0.05);(3)与汉黄芩素高剂量组相比,汉黄芩素高剂量+RhoA激活剂组明显抑制糖尿病脑梗死大鼠上述指标的改善(P<0.05)。结果表明:汉黄芩素能够改善糖尿病脑梗死大鼠血糖水平,减轻脑梗死和神经损伤,其作用机制可能与抑制RhoA/ROCK信号通路有关。

四君子汤含药血清通过抑制RhoA/Rac1/Cdc42通路影响卵巢癌细胞的上皮间质转化

目的探索四君子汤含药血清对卵巢癌细胞增殖迁移、侵袭及上皮间质化的影响,并初步研究其作用机理。方法体外培养人卵巢癌细胞(SKOV3)和人卵巢上皮细胞,随机分为空白对照组、舒尼替尼组、四君子汤Ⅰ组、Ⅱ组和Ⅲ组。噻唑蓝法检测各组SKOV3细胞和人卵巢上皮细胞增殖变化情况;划痕实验和侵袭(transwell)实验检测各组SKOV3细胞迁移和侵袭能力;蛋白免疫印迹分析法检测各组SKOV3细胞上皮型钙粘蛋白(Ecadherin)、神经性钙黏附蛋白(N-cadherin)、波形蛋白(Vimentin)、Ras同源基因家族成员A(RhoA)、Ras相关的C3肉毒素底物1(Rac1)和细胞分裂周期蛋白42(Cdc42)蛋白表达情况;实时荧光定量PCR(qRT-PCR)法检测各组SKOV3细胞RhoA、Rac1和Cdc42 mRNA表达变化。结果各组人卵巢上皮细胞存活率差异无统计学意义(P>0.05)。与空白对照组相比,舒尼替尼组SKOV3细胞存活率、划痕愈合率、侵袭数量、N-cadherin、Vimentin蛋白、RhoA、Rac1、Cdc42 mRNA和蛋白表达显著降低(P<0.05),E-cadherin蛋白表达显著升高(P<0.05)。四君子汤Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ组SKOV3细胞存活率、划痕愈合率、侵袭数量、N-cadherin、Vimentin蛋白、RhoA、Rac1、Cdc42 mRNA和蛋白表达依次降低(P<0.05),E-cadherin蛋白表达依次升高(P<0.05),呈剂量依赖性。四君子汤Ⅲ组上述指标和舒尼替尼组比较差异无统计学意义(P>0.05)。结论四君子汤含药血清能够抑制人卵巢癌细胞增殖、迁移、侵袭和上皮间质化,可能与RhoA/Rac1/Cdc42信号通路激活受阻相关。

苦参碱调节RhoA-ROCK信号通路对冠心病模型大鼠Th17/Treg细胞平衡的影响

目的探讨苦参碱(Matrine)对冠心病(coronary heart disease,CHD)大鼠辅助T细胞17(helper T cell 17,Th17)/调节性T细胞(regulatory T cells,Treg)细胞平衡及Ras同源基因家族成员A(RhoA)-Rho相关的卷曲螺旋激酶(ROCK)信号通路的影响。方法建立冠心病模型,将实验大鼠分为对照组、模型组、苦参碱低剂量(50 mg·kg^(-1))组、苦参碱高剂量(200 mg·kg^(-1))组及苦参碱高剂量(200 mg·kg^(-1))+LPA组(10 mg·kg^(-1))。超声心动图进行大鼠心功能检测;酶联免疫吸附试验(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)法进行白细胞介素17(IL-17)、转化生长因子β(TGF-β)水平检测;流式细胞术检测Th17、Treg数量及Th17/Treg比值;免疫组化进行内皮型一氧化氮合酶(eNOS)、内皮素1(ET-1)蛋白表达水平检测;Masson染色进行大鼠心肌组织的病理形态变化观察;TTC染色检测各组大鼠心肌梗死情况;TUNEL染色进行心肌组织中细胞凋亡情况检测;试剂盒检测RhoA活性;Western Blot法进行半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3(Caspase-3)、B细胞淋巴瘤因子2(Bcl-2)、Bcl-2相关X蛋白(Bax)、RhoA、ROCK1、ROCK2蛋白表达水平检测。结果与对照组比较,模型组心肌组织有大量蓝色胶原纤维沉积,左室舒张末期容积(left ventricular end-diastolic volume,LVEDV)、左室收缩末期容积(left ventricular end-systolic volume,LVESV)、IL-17、Th17、Th17/Treg、ET-1、心肌梗死面积、细胞凋亡率、TUNEL阳性率、Bax、Caspase-3、RhoA活性、RhoA、ROCK1、ROCK2表达水平明显升高,左室射血分数(left ventricular ejection fraction,LVEF)、左室缩短分数(left ventricular shortening fraction,LVFS)、TGF-β、Treg、eNOS、Bcl-2表达水平明显降低(P<0.05)。与模型组比较,Matrine-L组、苦参碱高剂量组心肌组织蓝色胶原纤维逐渐减少,LVEDV、LVESV、IL-17、Th17、Th17/Treg、ET-1、心肌梗死面积、细胞凋亡率、TUNEL阳性率、Bax、Caspase-3、RhoA活性、RhoA、ROCK1、ROCK2表达水平依次明显降低,LVEF、LVFS、TGF-β、Treg、eNOS、Bcl-2表达水平依次明显升高(P<0.05)。与苦参碱高剂量组比较,苦参碱高剂量+LPA组心肌组织蓝色胶原纤维增多,LVEDV、LVESV、IL-17、Th17、Th17/Treg、ET-1、心肌梗死面积、细胞凋亡率、TUNEL阳性率、Bax、Caspase-3、RhoA活性、RhoA、ROCK1、ROCK2表达水平明显升高,LVEF、LVFS、TGF-β、Treg、eNOS、Bcl-2表达水平明显降低(P<0.05)。结论苦参碱通过抑制RhoAROCK信号通路调节Th17/Treg细胞平衡,改善冠心病大鼠心肌损伤。

炎调方调节RhoA/ROCK信号通路对急性胰腺炎大鼠肠屏障损伤的影响

目的观察炎调方调节Ras同源基因家族成员A(RhoA)/Rho激酶(ROCK)信号通路对急性胰腺炎(AP)大鼠肠屏障损伤的影响。方法将84只大鼠随机分为对照组、模型组、炎调方低剂量组、炎调方高剂量组、乌司他丁组、溶血磷脂酸(LPA)组、炎调方+LPA组,每组12只。除对照组外,其他组构建AP大鼠模型。造模成功后立即进行给药处理,每6小时给药1次,共4次。ELISA法检测大鼠血清中淀粉酶、脂肪酶、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素-6(IL-6)、D-乳酸、二胺氧化酶(DAO)水平;HE染色检测大鼠胰腺组织和回肠组织病理变化;免疫组化染色检测大鼠回肠组织中ZO-1、Occludin蛋白平均光密度;Western blotting检测回肠组织中RhoA、ROCK1、ROCK2蛋白表达。结果与对照组比较,模型组大鼠胰腺组织和回肠组织病理损伤严重,淀粉酶、脂肪酶、TNF-α、IL-6、D-乳酸、DAO水平及RhoA、ROCK1、ROCK2蛋白表达升高,ZO-1、Occludin蛋白平均光密度降低(P<0.05);与模型组比较,炎调方低剂量组、炎调方高剂量组、乌司他丁组大鼠胰腺组织和回肠组织病理损伤减轻,淀粉酶、脂肪酶、TNF-α、IL-6、D-乳酸、DAO水平及RhoA、ROCK1、ROCK2蛋白表达降低,ZO-1、Occludin蛋白平均光密度升高,LPA组对应指标变化趋势与上述相反(P<0.05);与炎调方高剂量组比较,炎调方+LPA组大鼠胰腺组织和回肠组织病理损伤加剧,淀粉酶、脂肪酶、TNF-α、IL-6、D-乳酸、DAO水平及RhoA、ROCK1、ROCK2蛋白表达升高,ZO-1、Occludin蛋白平均光密度降低(P<0.05)。结论炎调方可能通过抑制RhoA/ROCK信号通路改善AP大鼠炎症反应及肠屏障损伤。

银杏叶提取物对糖尿病肾病模型小鼠肾脏炎症的抑制作用及机制

目的探讨银杏叶提取物(GBE)抑制糖尿病肾病(DN)模型小鼠肾脏炎症的作用及其可能机制。方法以高脂高糖喂养KK/Ay小鼠建立DN模型,并分为模型组、阳性对照组[二甲双胍200 mg/(kg·d)]和GBE低、高剂量组[100、200 mg/(kg·d)],每组6只;另取普通饲料喂养的C57BL/6J小鼠6只,作为对照组。各药物组小鼠灌胃相应药液,对照组和模型组小鼠灌胃等体积生理盐水,每天1次,连续8周。检测小鼠的体重、空腹血糖、24 h摄食量、24 h尿量和血清单核细胞趋化蛋白1(MCP-1)、白细胞介素12(IL-12)、IL-10、晚期糖基化终末产物(AGEs)、血尿素氮(BUN)、血肌酐(Scr)水平,计算其双侧肾脏质量与体重的比值,观察其肾皮质的病理损伤和纤维化改变,并检测其肾皮质中巨噬细胞极化标志蛋白[M1型:诱导型一氧化氮合酶(iNOS);M2型:精氨酸酶1(Arg-1)]和AGEs-晚期糖基化终末产物受体(RAGE)/Ras同源基因家族成员A(RhoA/)/Rho相关螺旋卷曲蛋白激酶(ROCK)信号通路相关蛋白的表达情况。结果与模型组比较,GBE低、高剂量组小鼠肾皮质增生、空泡、炎症细胞浸润、肾皮质纤维化等症状均有所好转;其体重、血清IL-10水平、肾皮质中Arg-1蛋白的表达水平均显著高于模型组(P<0.01);空腹血糖和24 h摄食量、尿量,血清MCP-1、IL-12、BUN、Scr、AGEs水平,双侧肾脏质量与体重的比值,肾损伤评分和肾间质纤维化比例,肾皮质中iNOS、RAGE、RhoA、ROCK1(GBE低剂量组除外)蛋白的表达水平均显著低于模型组(P<0.01)。结论GBE可改善DN模型小鼠的肾损伤,并减轻其炎症反应,其机制可能与抑制AGEs-RAGE/RhoA/ROCK信号通路、调节巨噬细胞极化有关。

基于ROCK/NOX4信号通路探究刺芒柄花素对2型糖尿病大鼠内质网应激损伤及肾功能的影响

目的基于RAS同源基因家族成员相关激酶(ROCK)/烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶(NOX)4信号通路探究刺芒柄花素对2型糖尿病大鼠内质网应激损伤及肾功能的影响。方法SPF级健康8周龄雄性C57BL/6大鼠60只,随机分为5组,各12只,健康组、模型组、刺芒柄花素低、中、高组,除健康组外均建立2型糖尿病大鼠模型,刺芒柄花素低组、刺芒柄花素中组、刺芒柄花素高组分别给予20、40、100 mg/kg刺芒柄花素灌胃,其余组别灌胃等体积生理盐水。采用自动生化分析仪测定肾功能指标。苏木素-伊红(HE)染色与Masson染色观察大鼠肾组织病形态。TUNEL检测肾小管上皮细胞凋亡。免疫组化检测RAS同源基因家族成员(Rho)A、NOX4、ROCK阳性表达。Western印迹检测内质网应激相关蛋白表达。结果HE染色结果显示:健康组肾脏组织结构正常;模型组肾小球有一定程度萎缩,组织结构排列不均匀,并且有肿胀、脱落现象、还存在空泡样变性、鲍曼囊腔扩,而经过刺芒柄花素干预后,上述情况有所改善,且呈现出明显的剂量依赖性。Masson染色结果显示:健康组肾组织正常;模型组肾小球、肾小管基底膜增厚,产生空泡样病变,肾间质胶原纤维沉积明显;在经过刺芒柄花素干预后上述状况明显改善,且呈现出明显的剂量依赖性。健康组24 h MAU、SCr、BUN、细胞凋亡率、RhoA、NOX4、ROCL、eIF2α、GRP78水平显著低于模型组(P<0.05)。模型组24 h MAU、SCr、BUN、细胞凋亡率、RhoA、NOX4、ROCL、eIF2α、GRP78水平显著高于刺芒柄花素低组(P<0.05)。刺芒柄花素低组24 h MAU、SCr、BUN、细胞凋亡率、RhoA、NOX4、ROCL、eIF2α、GRP78水平显著高于刺芒柄花素中组(P<0.05)。刺芒柄花素中组24 h MAU、SCr、BUN、细胞凋亡率、RhoA、NOX4、ROCL、eIF2α、GRP78水平显著高于刺芒柄花素高组(P<0.05)。结论刺芒柄花素可能是通过调控Rho/ROCK/NOX4信号通路抑制了2型糖尿病大鼠内质网应激,改善肾功能,对肾脏起保护作用。

川陈皮素对食管癌KYSE150细胞存活、侵袭和凋亡的影响及机制实验研究

目的:探究川陈皮素对食管癌KYSE150细胞存活、侵袭及凋亡的影响及可能的机制。方法:将培养至对数生长期的KYSE150细胞分为对照组(常规培养)、顺铂组(0.5μg/ml顺铂)、川陈皮素低(10μg/ml)、中(20μg/ml)、高(40μg/ml)浓度组。采用MTT法检测KYSE150细胞存活率。采用Transwell实验检测KYSE150细胞侵袭能力。采用流式细胞术检测KYSE150细胞凋亡率。采用荧光定量PCR法检测KYSE150细胞Ras同源基因家族成员A(RhoA)、Rho相关卷曲螺旋蛋白激酶1(ROCK1)、ROCK2 mRNA表达。采用Western bolt法检测KYSE150细胞RhoA、ROCK1、ROCK2蛋白表达。结果:与对照组比较,顺铂组及川陈皮素低、中、高浓度组KYSE150细胞存活率、侵袭数目以及RhoA、ROCK1、ROCK2 mRNA和蛋白表达水平降低,凋亡率升高(均P<0.05)。与顺铂组比较,川陈皮素低、中浓度组KYSE150细胞存活率、侵袭数目以及RhoA、ROCK1、ROCK2 mRNA和蛋白表达水平升高,凋亡率降低(均P<0.05)。川陈皮素高浓度组和顺铂组上述指标比较差异无统计学意义(均P>0.05)。川陈皮素低、中、高浓度组KYSE150细胞存活率、侵袭数目以及RhoA、ROCK1、ROCK2 mRNA和蛋白表达水平依次降低,凋亡率依次升高(均P<0.05)。结论:川陈皮素能够抑制KYSE150细胞的存活和侵袭,促进凋亡,其机制可能与抑制RhoA/ROCK信号通路有关。

对香豆酸通过抑制RhoA/ROCK信号通路减轻糖尿病肾病病变

目的探讨对香豆酸(p-CA)对糖尿病肾病(DN)大鼠的治疗作用及对Ras同源基因家族成员A(RhoA)/Rho相关卷曲螺旋蛋白激酶(ROCK)信号通路的影响。方法将大鼠分为6组:对照组(n=10)、DN组(n=10)、低剂量对香豆酸组(L-p-CA)(n=10)、中剂量对香豆酸组(M-p-CA)(n=10)、高剂量对香豆酸组(H-p-CA)(n=10)和RhoA激动剂U-46619组(U-46619)(n=12)。对照组大鼠为健康SD大鼠,其他组大鼠均为高脂饮食联合链脲佐菌素诱导的DN模型大鼠。造模后,对照组和DN组大鼠灌胃2 mL 0.5%羧甲基纤维素溶液,L-p-CA组、M-p-CA组和H-p-CA组大鼠分别灌胃2 mL剂量为50,100,200 mg/(kg·d)的对香豆酸溶液,U-46619组大鼠同时灌胃1 mL对香豆酸溶液(剂量为200 mg/(kg·d))以及1 mL剂量为30μg/(kg·d)的RhoA激动剂U-46619。各组大鼠均干预12周。治疗后检测各组大鼠生化指标水平:空腹血糖(FPG)、空腹胰岛素(FINS)、糖化血红蛋白(HbA1c)、尿素氮(BUN)、血肌酐(Cr)和24 h尿蛋白;以及血清氧化应激指标水平:超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-PX)和丙二醛(MDA)。通过苏木精-伊红(HE)和Masson三色染色评价大鼠肾脏损伤和纤维化。通过qRT-PCR检测肾脏肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素-1β(IL-1β)和单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)转录活性。通过Western blot检测肾脏TNF-α、IL-1β、MCP-1、RhoA和ROCK1蛋白表达水平。结果与对照组比较,DN组大鼠的FPG、FINS、24 h尿蛋白、HbA1c、BUN和Cr水平升高(P<0.05);肾组织发生明显病变,肾组织纤维化面积升高(P<0.05);血清SOD、CAT和GSH-PX水平均降低(P<0.05),MDA水平升高(P<0.05);肾组织TNF-α、IL-1β和MCP-1的mRNA和蛋白水平均升高(P<0.05);肾组织RhoA和ROCK1蛋白表达水平升高(P<0.05)。与DN组比较,L-p-CA组、M-p-CA组和H-p-CA组大鼠的FPG、FINS、24 h尿蛋白、HbA1c、BUN和Cr水平降低(P<0.05);肾组织病变减轻,肾组织纤维化面积降低(P<0.05);血清SOD、CAT和GSH-PX水平均升高(P<0.05),MDA水平降低(P<0.05);肾组织TNF-α、IL-1β和MCP-1的mRNA和蛋白水平均降低(P<0.05);肾组织RhoA和ROCK1蛋白表达水平降低(P<0.05)。与L-p-CA组和M-p-CA组比较,H-p-CA组大鼠的FPG、FINS、24 h尿蛋白、HbA1c、BUN和Cr水平降低(P<0.05);肾组织病变减轻,肾组织纤维化面积降低(P<0.05);血清SOD、CAT和GSH-PX水平均升高(P<0.05),MDA水平降低(P<0.05);肾组织TNF-α、IL-1β和MCP-1的mRNA和蛋白水平均降低(P<0.05);肾组织RhoA和ROCK1蛋白表达水平降低(P<0.05)。与H-p-CA组比较,U-46619组大鼠的FPG、FINS、24 h尿蛋白、HbA1c、BUN和Cr水平均升高(P<0.05);肾组织病变加重,肾组织纤维化面积升高(P<0.05);血清SOD、CAT和GSH-PX水平均降低(P<0.05),MDA水平升高(P<0.05);肾组织TNF-α、IL-1β和MCP-1的mRNA和蛋白水平均升高(P<0.05);肾组织RhoA和ROCK1蛋白表达水平升高(P<0.05)。结论对香豆酸通过抑制RhoA/ROCK信号通路减轻糖尿病肾病病变。

右美托咪定减轻呼吸机相关性肺损伤模型大鼠肺组织损伤

目的探讨右美托咪定(DEX)对呼吸机相关性肺损伤(VILI)大鼠肺组织Ras同源基因家族成员A(RhoA)/Rho激酶1(ROCK1)信号通路的影响。方法建立VILI大鼠模型,将大鼠分为对照组(control组)、模型组(VILI组)、右美托咪定低、高剂量组(DEX-L、DEX-H组)、右美托咪定高剂量+溶血磷脂酸(LPA)组(DEX-H+LPA组)。测定大鼠肺组织湿/干质量比值(W/D);HE染色观察肺组织病理形态;ELISA试剂盒检测支气管肺泡灌洗液(BALF)中肿瘤坏死因子α(TNF-α)、白细胞介素-1β(IL-1β)、白细胞介素-6(IL-6)的水平;TUNEL染色法检测肺上皮细胞死亡;Western blot检测细胞凋亡相关蛋白及RhoA、ROCK1表达水平。结果DEX可以减轻VILI大鼠肺损伤,降低肺损伤评分、W/D、细胞凋亡率和TNF-α、IL-1β、IL-6水平及Bax、cleaved caspase-3、RhoA、ROCK、α-SMA表达(P<0.05),升高Bcl-2表达(P<0.05);LPA可以促使大鼠肺损伤加重,肺损伤评分、W/D、细胞凋亡率和TNF-α、IL-1β、IL-6水平及Bax、cleaved caspase-3、RhoA、ROCK、α-SMA表达升高(P<0.05),Bcl-2表达降低(P<0.05)。结论右美托咪定可能通过抑制RhoA/ROCK1通路保护大鼠呼吸机相关性肺损伤。

电针早期干预对肌萎缩侧索硬化症小鼠大脑皮层TDP-43及HMGB1/RhoA信号通路的影响

目的:观察电针早期干预对肌萎缩侧索硬化症(amyotrophic lateral sclerosis,ALS)小鼠大脑皮层TARDNA结合蛋白43(TARDNA binding protein,TDP-43)及HMGB1/RhoA信号通路表达的影响,探究电针早期干预改善ALS小鼠运动功能的潜在机制。方法:符合SOD1G93A基因表型小鼠按随机数字表法分为模型组(SOD1G93A)、针刺干预组(electroacupuncture,EA)、利鲁唑组(Riluzole),同窝SOD1G93A阴性小鼠为空白对照组(control),每组15只。电针组针刺干预百会穴、双侧天柱穴、双侧天枢穴,5次/7d,7d为一个疗程,共治疗4个疗程。利鲁唑组予利鲁唑30mg/(kg·d)灌胃治疗,1次/d,5次/周,持续2周。采用后肢功能神经学评分和转棒疲劳实验评估各组小鼠运动功能,免疫荧光法观察大脑皮层TDP-43阳性细胞率;Western Blot法检测大脑皮质离子钙结合接头分子1(Iba-1)、HMGB1、RhoA蛋白相对表达量;Elisa法检测血清TNF-α及MCP-1的含量;透射电镜观察大脑皮层神经元形态变化。结果:与对照组比较,模型组转棒潜伏期时间减少和神经学评分增高(P<0.01),血清MCP-1、TNF-α含量和大脑皮层Iba-1、HMGB1、RhoA蛋白表达以及TDP-43阳性细胞率均升高(P<0.01)。与模型组比较,电针组和利鲁唑组转棒潜伏期时间增加和神经学评分降低(P<0.01,P<0.05),血清MCP-1、TNF-α含量和大脑皮质Iba-1、HMGB1、RhoA蛋白表达以及TDP-43阳性细胞率均降低(P<0.01,P<0.05)。电镜结果显示,对照组小鼠皮层神经元细胞结构正常,模型组小鼠神经细胞有明显病理变化,电针组和利鲁唑组神经细胞损伤减轻,结构较完整,可见部分正常细胞器。结论:电针干预可改善ALS模型小鼠的运动功能,其机制可能与抑制HMGB1/RhoA信号通路进而减轻小胶质细胞诱导的神经炎症有关,并推测其对于减少ALS病理底物TDP-43的沉积具有正相关作用。

水蛭素调节RhoA/ROCK信号通路对脑梗死大鼠神经元细胞凋亡和炎症反应的影响

目的:探讨水蛭素(HRD)调节Ras同源基因家族成员A(RhoA)/Rho相关卷曲螺旋形成蛋白激酶(ROCK)信号通路对脑梗死大鼠神经元细胞凋亡和炎症反应的影响。方法:将SD大鼠分为Ct组、Model组、低剂量HRD组(HRD-L组,13.33 mg/kg)、高剂量HRD组(HRD-H组,26.66 mg/kg)、阳性对照尼莫地平组(NMDP组,40 mg/kg)、U-46619(RhoA激动剂,0.03 mg/kg)组、HRD-H+U-46619组(26.66 mg/kg+0.03 mg/kg),每组24只。除Ct组外,其他组大鼠均利用改良线栓法构建脑梗死模型,Ct组大鼠仅暴露血管,不进行切口和插线栓。建模成功1 h后,进行给药处理。给药1次/d,持续4周。Zea-Longa法评估大鼠神经功能;干湿重法检测大鼠脑组织含水量;2,3,5-三苯基四唑氯化物(TTC)染色测定大鼠脑梗死体积;TUNEL染色检测大鼠海马CA1区神经元凋亡;ELISA检测大鼠海马组织中TNF-α、IL-1β、IL-6水平;Western blot检测大鼠海马组织中裂解的天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶-3(Cleaved-Caspase-3)、Bcl-2相关X蛋白(Bax)、RhoA、ROCK1、ROCK2蛋白表达。结果:与Ct组比较,Model组大鼠神经功能评分、脑组织含水量、脑梗死体积百分比、神经元凋亡率、TNF-α、IL-1β、IL-6水平、Cleaved-Caspase-3、Bax、RhoA、ROCK1、ROCK2蛋白表达升高(P<0.05);与Model组比较,HRD-L组、HRD-H组、NMDP组大鼠神经功能评分、脑组织含水量、脑梗死体积百分比、神经元凋亡率、TNF-α、IL-1β、IL-6水平、Cleaved-Caspase-3、Bax、RhoA、ROCK1、ROCK2蛋白表达降低,而U-46619组对应指标变化呈相反趋势(P<0.05);与HRD-H组比较,HRD-H+U-46619组大鼠神经功能评分、脑组织含水量、脑梗死体积百分比、神经元凋亡率、TNF-α、IL-1β、IL-6水平、Cleaved-Caspase-3、Bax、RhoA、ROCK1、ROCK2蛋白表达升高(P<0.05)。结论:HRD可能通过抑制RhoA/ROCK信号通路抑制脑梗死大鼠神经元凋亡及炎症反应。

藏红花素对脊髓损伤大鼠运动功能、炎症的影响及机制研究

目的 探讨藏红花素对脊髓损伤大鼠运动功能、炎症及Ras同源基因家族成员A(RhoA)/Rho相关卷曲螺旋蛋白激酶(ROCK)信号通路的影响。方法 构建脊髓损伤大鼠模型,将建模成功的48只大鼠随机分为模型组、藏红花素低(25 mg/kg)、高(50 mg/kg)剂量组、甲泼尼龙琥珀酸钠(30 mg/kg)组,每组12只;另取12只大鼠作为假手术组。各组给予对应药物干预14 d(每天1次)。评估大鼠运动功能,并采用苏木素-伊红和脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记法染色分别观察脊髓组织病理变化和细胞凋亡,酶联免疫吸附试验法检测脊髓组织肿瘤坏死因子(TNF)-α、白细胞介素(IL)-1β、IL-6水平;荧光定量PCR和蛋白质印迹法分别检测脊髓组织RhoA、ROCK1、ROCK2信使RNA(mRNA)和蛋白水平。结果 假手术组大鼠脊髓组织结构正常,无明显变化;与假手术组相比,模型组大鼠脊髓组织出现坏死灶,伴随嗜伊红色素颗粒生成,可见较多胶质瘢痕及空洞,BBB评分显著降低(P<0.05),脊髓组织细胞凋亡率、TNF-α、IL-1β、IL-6、RhoA、ROCK1、ROCK2 mRNA和蛋白水平显著升高(P<0.05);与模型组相比,藏红花素低、高剂量组大鼠脊髓组织病理损伤程度依次减轻,BBB评分依次升高(P<0.05),脊髓组织细胞凋亡率、TNF-α、IL-1β、IL-6、RhoA、ROCK1、ROCK2 mRNA和蛋白水平依次降低(P<0.05);甲泼尼龙琥珀酸钠组和藏红花素高剂量组大鼠脊髓组织病理变化程度及各项指标比较,差异均无统计学意义(P>0.05)。结论 藏红花素能改善脊髓损伤大鼠运动功能,抑制脊髓组织细胞凋亡和炎症反应,其机制可能与抑制RhoA/ROCK信号通路的激活有关。

飞燕草素调控RhoA/ROCK信号通路对结肠癌细胞生物学行为及血管生成拟态形成的影响

目的:探讨飞燕草素调控Ras同源基因家族成员A(RhoA)/Rho相关卷曲螺旋形成蛋白激酶(ROCK)信号通路对结肠癌细胞生物学行为及血管生成拟态形成的影响。方法:将人结肠癌细胞SW620随机分为对照组、飞燕草素低浓度组(含45μmol/L飞燕草素培养基培养)、飞燕草素中浓度组(含90μmol/L飞燕草素培养基培养)、飞燕草素高浓度组(含180μmol/L飞燕草素培养基培养)、飞燕草素高浓度+RhoA过表达组(转染RhoA过表达质粒+含180μmol/L飞燕草素培养基培养)。采用细胞计数试剂盒-8(CCK-8)法、Transwell及划痕实验分别检测SW620细胞增殖、侵袭及迁移能力。采用流式细胞术检测SW620细胞凋亡情况。血管生成实验检测SW620细胞血管生成拟态形成情况。采用RT-qPCR检测SW620细胞RhoA、ROCK mRNA表达。采用Western blot检测SW620细胞RhoA、ROCK、血管内皮生长因子(VEGF)蛋白表达。结果:与对照组比较,飞燕草素低、中、高浓度组SW620细胞存活率、侵袭细胞数、迁移率、血管生成拟态管状结构数、RhoA和ROCK mRNA及蛋白表达水平、VEGF蛋白表达水平呈浓度依赖性降低,凋亡率呈浓度依赖性升高(均P<0.05)。与飞燕草素高浓度组比较,飞燕草素高浓度+RhoA过表达组SW620细胞存活率、侵袭细胞数、迁移率、血管生成拟态管状结构数、RhoA和ROCK mRNA及蛋白表达水平、VEGF蛋白表达水平升高,凋亡率降低(均P<0.05)。结论:飞燕草素可能通过抑制RhoA/ROCK信号通路减弱结肠癌细胞恶性生物学行为及血管生成拟态形成,并促进细胞凋亡。

上调c-Ski基因表达对青光眼兔术后瘢痕形成及TGF-β、RhoA/Rock信号通路的影响

目的探讨上调c-Ski基因表达对青光眼兔术后瘢痕形成及转化生长因子(TGF)-β、Ras同源家族成员A(RhoA)/Rho相关激酶(Rock)信号通路的影响。方法取30只新西兰大白兔建立青光眼模型,并进行青光眼滤过手术。将其随机分为A组(仅造模及手术,不给药)、B组(结膜下注射400μg空白质粒)、C组(结膜下注射100μg c-Ski质粒)、D组(结膜下注射200μg c-Ski质粒)和E组(结膜下注射400μg c-Ski质粒),每组6只。分别于术后2 d、4 d、7 d、14 d和28 d检测各组兔的眼压、滤过道组织中Ⅰ型和Ⅱ型胶原面积占比。术后28 d采用实时荧光定量PCR检测各组兔滤过道组织中c-Ski、TGF-β1、Rock和RhoA mRNA表达水平,采用Western blot检测各组兔滤过道组织中TGF-β1、Rock及RhoA蛋白表达水平。结果术后2 d、4 d、7 d、14 d、28 d,C组、D组及E组兔眼压均低于A组和B组,D组和E组兔眼压均低于C组(均P<0.05)。术后2 d、4 d、7 d、14 d、28 d,C组、D组及E组Ⅰ型胶原面积占比依次降低且均低于A组和B组(均P<0.05);术后14 d,C组、D组及E组Ⅱ型胶原面积占比依次降低且均低于A组和B组(均P<0.05)。术后28 d,C组、D组、E组兔滤过道组织中c-Ski mRNA表达水平均高于A组和B组,TGF-β1、Rock及RhoA的mRNA和蛋白表达水平均低于A组和B组,且C组、D组、E组c-Ski mRNA表达水平依次升高,TGF-β1、Rock及RhoA的mRNA和蛋白表达水平依次降低(均P<0.05)。结论上调c-Ski基因表达能够降低青光眼兔术后的眼压,减少胶原合成,抑制瘢痕形成,这可能与其抑制TGF-β1及RhoA/Rock信号通路有关。