稠李花色苷酶法制备及对H_2O_2诱导大鼠胰岛素瘤细胞损伤的保护作用

目的:探究纤维素酶酶法制备稠李花色苷的最佳条件,并研究制备的稠李花色苷对H_2O_2诱导的大鼠胰岛素瘤(Ins-1)细胞损伤的保护作用。方法:通过单因素试验和正交试验,优化得到酶法制备稠李花色苷的最佳条件;稠李花色苷处理大鼠Ins-1细胞,进行形态学观察、3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴盐[3-(4,5-dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl-2-H-tetrazolium bromide,MTT]细胞活力实验、2’,7’-二氢二氯荧光素二乙酸酯(2’,7’-dichloro dihydrofluorescein diacetate,DCFH-DA)荧光探针法检测细胞内活性氧实验研究稠李花色苷对H_2O_2诱导损伤的Ins-1细胞保护作用。结果:纤维素酶法提取稠李花色苷的最佳条件为:温度60℃、纤维素酶添加量9 mg/g、料液比1∶35(g/m L)、p H 3.5,此条件下稠李花色苷得率为(0.956±0.027)mg/g;形态学观察及MTT细胞活力实验显示,稠李花色苷对H_2O_2诱导损伤的Ins-1细胞具有较强的保护作用,DCFH-DA法检测细胞内活性氧实验说明,稠李花色苷能够显著地清除Ins-1细胞内的活性氧。结论:纤维素酶法制备稠李花色苷是一种有效的方法,制备的稠李花色苷对H_2O_2诱导的大鼠Ins-1细胞损伤具有较强的保护作用。

丝胶对链脲佐菌素作用下大鼠INS-1细胞Bax表达的调控作用

目的:观察丝胶对链脲佐菌素(STZ)致损伤大鼠胰岛素瘤细胞(INS-1细胞)Bax表达的影响。方法:INS-1细胞分为三组,正常对照组(不予任何药物处理)、STZ处理组(10mmol/L的STZ处理细胞24h)、丝胶保护组(10mmol/L的STZ、300μg/ml的丝胶共同处理细胞24h)。采用CCK-8法观察各组细胞的活力,蛋白印迹和实时荧光定量PCR法检测各组细胞Bax蛋白和mRNA的表达情况。结果:STZ处理组INS-1细胞的活力明显低于正常对照组、Bax蛋白和mRNA表达明显高于正常对照组(P<0.05);丝胶保护组INS-1细胞的活力明显高于STZ处理组、Bax蛋白和mRNA表达明显低于STZ处理组(P<0.05)。结论:丝胶对STZ致损伤大鼠INS-1细胞具有保护作用,其机制可能与下调Bax的表达有关。

大气PM2.5对大鼠胰岛素瘤细胞凋亡及胰岛素分泌的影响

目的探讨PM2.5对大鼠胰岛素瘤细胞(INS-1细胞)凋亡及胰岛素分泌的影响。方法采集并收集大气中PM2.5,用INS-1细胞建立细胞模型,用含不同浓度(200、20、2、0μg·mL^-1)PM2.5的培养基染毒,四甲基偶氮唑盐(MTT)细胞毒性实验检测不同浓度PM2.5对INS-1细胞活率的影响;葡萄糖刺激的胰岛素分泌实验(GSIS)检测不同浓度PM2.5染毒对INS-1细胞胰岛素分泌的影响;2',7'-二氯荧光黄双乙酸盐(DCFH-DA)做为荧光探针检测不同浓度PM2.5染毒对INS-1细胞活性氧(ROS)生成的影响;流式细胞Annexin V-FITC/PI双染法检测不同浓度PM2.5染毒对INS-1细胞凋亡率的影响。结果MTT实验结果显示:与0μg·mL^-1组比较,PM2.5染毒INS-1细胞24 h,20、200μg·mL^-1 PM2.5组INS-1细胞活率均降低(P均<0.05);当PM2.5染毒INS-1细胞48 h和72 h时,2、20、200μg·mL^-1组的INS-1细胞存活率均降低(P均<0.05)。GSIS实验结果显示:在基础葡萄糖浓度(5.6 mmol·L^-1)和高浓度葡萄糖(16.7 mmol·L^-1)刺激下,200μg·mL^-1组胰岛素分泌水平低于0μg·mL^-1组(P<0.05)。ROS含量检测实验结果显示:200μg·mL^-1组INS-1细胞内ROS含量高于0μg·mL^-1组(P<0.05)。流式细胞术实验结果显示:与0μg·mL^-1组比较,2、20、200μg·mL^-1组细胞晚期凋亡率均升高,20、200μg·mL^-1组细胞总凋亡率均升高(P均<0.05)。结论PM2.5可使INS-1细胞活力降低,胰岛素分泌水平降低,可能与ROS水平增高、进而诱导了INS-1细胞凋亡有关。

青钱柳不同溶剂提取物对高糖诱导大鼠胰岛细胞损伤的保护作用

目的:观察青钱柳不同溶剂提取物对高糖诱导大鼠胰岛细胞瘤细胞(INS-1)损伤的保护作用。方法:用高糖诱导INS-1细胞损伤模型。MTT法检测青钱柳水提物、30%、60%和90%醇提物对INS-1细胞增殖的影响,荧光酶标仪检测青钱柳不同溶剂提取物对胞内活性氧(ROS)含量的影响,用ELISA法测定其胰岛素分泌能力,比色法测定上清液中乳酸脱氢酶(LDH)和一氧化氮(NO)及细胞内超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)活性及丙二醛(MDA)含量;比色法测定INS-1中Caspase-3、Caspase-9活性,荧光定量PCR测定Bcl-2和Bax mRNA表达,并计算Bcl-2/Bax比率。结果:33 mmol/L葡萄糖处理INS-148 h后可见INS-1细胞数目明显减少、细胞边缘模糊、触角收缩聚集、形态变圆,LDH释放量增加,与正常对照组比较,培养液中的NO和细胞内的ROS、MDA含量、Caspase-3、Caspase-9活性和Bax mRNA表达明显升高,胰岛素分泌量和细胞内SOD、GSH-Px、CAT活性和Bcl-2 mRNA表达及Bcl-2/Bax比率明显降低(P<0.01)。与模型对照组比较,用青钱柳不同溶剂提取物干预后INS-1细胞凋亡被显著抑制,培养液或细胞中NO、ROS、MDA含量,Caspase-3、Caspase-9活性,LDH释放量及Bax mRNA表达明显降低,胰岛素分泌和细胞内SOD、GSH-Px、CAT活性、Bcl-2 mRNA表达及Bcl-2/Bax比率明显增加(P<0.05或者P<0.01)。结论:青钱柳不同溶剂提取物对高糖诱导INS-1细胞损伤有保护作用,其作用机制与增强内源性抗氧化系统功能、抑制线粒体依赖性凋亡密切相关;其作用效果由强到弱依次为青钱柳水提物、30%、60%和90%醇提物。

脂多糖对大鼠胰岛素瘤细胞INS-1自噬和凋亡的影响

目的研究脂多糖（LPS）对大鼠胰岛素瘤细胞INS-1自噬和凋亡的影响及其可能机制。方法取处于对数期生长的INS-1细胞用于实验，分别用0．1、1．0、10．0mg／LLPS处理细胞，24h后用磺酰罗丹明B（SRB）染色法检测LPS对INS-1细胞增殖的影响，用二氯荧光素双醋酸盐（DCFH-DA）作为荧光探针检测细胞内活性氧的水平变化，应用Western blotting法检测细胞自噬体膜上自噬标志分子微管相关蛋白1的轻链3-Ⅱ（Map1LC3-Ⅱ）和凋亡标志蛋白聚腺苷二磷酸-核糖多聚酶（PARP）切割带的变化。将INS-1细胞的自噬必需基因7（A增7）通过siRNA介导的RNA干扰手段进行沉默，然后以1．0mg／LLPS处理细胞，24h后应用Western blotting检测细胞中Atg7、Map1LC3-Ⅱ和PARP切割带的水平。先用400μmoL／L的活性氧清除剂N-乙酰半胱氨酸（NAC）处理INS-1细胞，1h后加入10．0mg／L的LPS，24h后应用Western blotting法检测细胞Map1LC3-Ⅱ蛋白和PARP切割蛋白的水平。组间数据比较采用方差分析和t检验。结果与对照组（0．755±0．030）比较，0．1、1．0、10．0mg／LLPS组INS-1存活率降低，差异有统计学意义（分别为0．658±0．042、0．658±0．015、0．634±0．029，F=30．98，P〈0．01）；与对照组（0．447±0．012）相比，0．1、1．0、10．0mg／LLPS组Map1LC3-Ⅱ蛋白水平增加，差异有统计学意义（分别为0．992±0．030、0．949±0．020、0．982±0．013，F=525．79，P〈0．01）；与对照组（0．055±0．001）相比，0．1、1．0、10．0mg／LLPS组PARP切割蛋白水平增加，差异有统计学意义（分别为0．313±0．007、0．390±0．011、0．500±0．033，F=327．09，均P〈0．01）；与对照组比较，10mg／LLPS组活性氧产生明显增多。与对照组比较，转染Atg7siRNA组Atg7、Map1LC3-Ⅱ和PARP切割蛋白水平均显著下降，差异均有统计学意义（t=156．069、123．154、103．246，均P〈0．01）。与LPS10．0mg／L组比较，LPS10．0mg／L＋NAC组Map1LC3-Ⅱ和PARP切割蛋白水平均显著下降，差异均有统计学意义（t=66．37、26．84，均P〈0．01）。结论LPS可诱导INS-1细胞的自噬和凋亡，且其所诱导的凋亡依赖于自噬的发生；活性氧参与了LPS诱导的INS-1细胞的自噬和凋亡。

亚砷酸钠诱导大鼠胰岛素瘤细胞自噬性死亡作用

目的探讨自噬在亚砷酸钠(NaAsO2)诱导大鼠胰岛素瘤细胞(INS-1)死亡过程中的作用及分子机制。方法实验设阴性对照组,NaAsO2(30、15、5μmol/L)组;NaAsO2作用INS-1细胞24 h后,采用CCK8比色法检测INS-1细胞的存活率;透射电子显微镜观察INS-1细胞超微形态;激光扫描共聚焦显微镜观察转染质粒GFP-LC3后INS-1细胞内荧光的表达;蛋白印迹法(WB)法检测LC3、P62、mTOR、PI3K蛋白表达。结果经NaAsO2作用后,INS-1细胞存活率明显下降;NaAsO2组INS-1细胞中可见双层膜自噬小体与自噬空泡明显增多;转染质粒GFP-LC3后NaAsO2组荧光显微镜下可见绿色点状荧光斑点聚集增多。WB结果表明与阴性对照组LC3Ⅱ/LC3Ⅰ[(0.93±0.04)]、P62[(0.57±0.01)]、mTOR[(1.44±0.03)]、PI3K[(1.26±0.07)]比较,30、15、5μmol/L NaAsO2组INS-1细胞中LC3Ⅱ/LC3Ⅰ蛋白表达量[分别为(1.34±0.02、1.16±0.02、1.13±0.04)]升高,P62蛋白表达量[分别为(1.89±0.14、1.08±0.06、0.71±0.03)]升高,mTOR蛋白表达量[分别为(0.46±0.04、0.92±0.06、1.15±0.06)]降低,PI3K蛋白表达量[分别为(0.78±0.04、0.87±0.03、0.91±0.04)]降低,差异具有统计学意义(P<0.05)。结论NaAsO2暴露可诱导INS-1细胞自噬性死亡,其机制可能与调控PI3K/mTOR信号通路有关。

香菇多糖抑制STZ诱导的INS-1细胞凋亡的作用及机制

目的探讨香菇多糖（lentinan，LNT）对链脲佐菌素（streptozoein，STZ）诱导的大鼠胰岛素瘤细胞系（INS-1）细胞凋亡的影响，并探索其可能的作用机制。方法四甲基偶氮唑盐微量酶反应比色（MTT）法观察STZ单独处理、STZ和不同浓度LNT共同处理INS-1细胞24h后细胞活力的改变：AnnexinV-PI双染法检测细胞凋亡；Hoechst33258染色和末端转移酶介导的dUTP切口末端标记（TUNEL）法验证STZ和LNT的处理对INS-1细胞凋亡的影响；放免法检测经药物处理后INS-1细胞贮存、分泌胰岛素的功能；Western印迹分析经STZ、LNT处理后INS-1细胞相关信号通路蛋白PDX-1、Bcl-2（抗凋亡基因）、Bax和Cleavedeaspase-3（促凋亡基因）的表达差异。结果与空白组相比，LNT能浓度依赖性地抑制STZ引起的INS-1细胞活力下降，浓度为200μg／ml时开始有统计学差异（P〈0．05）；LNT能抑制STZ诱导的INS-1细胞凋亡；LNT可抑制STZ诱导的INS-1细胞贮存、分泌胰岛素功能受损和PDX-1蛋白表达量下降；LNT能影响细胞凋亡信号通路相关蛋白Bcl-2、Bax、Cleavedcaspase．3表达水平。结论香菇多糖能抑制STZ诱导的INS-1细胞凋亡，可能是通过影响凋亡信号通路中相关蛋白分子的水平实现的。

血管紧张素Ⅱ2型受体重组腺病毒的扩增及其在INS-1细胞中的转染

目的利用人胚肾(HEK)293A细胞株扩增含有大鼠血管紧张素Ⅱ2型受体(AT2R)基因的重组腺病毒,并在大鼠胰岛素瘤细胞INS-1细胞株中进行转染,构建AT2R高表达的胰岛β细胞模型。方法利用293A细胞株扩增重组腺病毒Ad-G-AT2R-EGFP和对照病毒Ad-CMV-EGFP,并测定病毒滴度。在INS-1细胞中瞬时转染后利用实时PCR、Western印迹以及免疫荧光和激光共聚焦技术检测细胞中AT2R与AT1R的表达。结果扩增后得到重组腺病毒Ad-G-AT2R-EGFP和Ad-CMV-EGFP的滴度分别为9×109和8×109pfu/ml。在INS-1细胞中转染Ad-GAT2R-EGFP后,AT2R mRNA的表达随病毒感染复数(multiplicity of infection,MOI)值的增加呈剂量依赖性增加。当MOI值为10时,AT2R mRNA的表达达到峰值(P<0.05),同时AT2R蛋白的表达明显高于转染了Ad-CMV-EGFP的细胞和未转染细胞,但AT1R的表达无显著变化。结论成功扩增并得到高滴度且携带有AT2R基因的重组腺病毒载体,并将其转染入INS-1细胞中构建出AT2R高表达的胰岛β细胞模型,为下一步探讨AT2R在胰岛β细胞中的作用奠定了基础。

miR-149靶向抑制胰岛β细胞中FGF21表达对胰岛素分泌的影响及机制研究

【目的】探讨胰岛β细胞中miR-149对成纤维细胞生长因子21(fibroblast growth factor 21,FGF21)靶向调控作用及抑制胰岛素分泌的作用机制,以期更好地了解糖尿病发病机制并为糖尿病诊断治疗提供新靶点。【方法】生物信息学预测靶向调控FGF21的miRNA;双荧光素酶报告基因检测实验验证靶向调节关系;q PCR检测大鼠胰岛素瘤细胞株(rat insulin-secreting betacell line,INS-1)胰岛β细胞中miR-149与FGF21 mRNA表达;应用酸醇提取INS-1胰岛β细胞中胰岛素,放射免疫法检测细胞内胰岛素含量;分别用5.6、16.7 mmol/L葡萄糖建立基础糖刺激胰岛素分泌模型(basal insulin secretion model,BIS)、高糖刺激胰岛素分泌模型(high glucose stimulates insulin secretion model,GSIS),放射免疫法测定各处理组胰岛素分泌量;western blotting检测INS-1胰岛β细胞中FGF21、JNK、p-JNK、ERK、p-ERK的表达。【结果】MiR-149是潜在靶向调控FGF21的miRNA,其过表达可显著抑制FGF21荧光素酶活性,FGF21 3'URT中miR-149结合位点突变后荧光素酶活性恢复。过表达miR-149靶向抑制FGF21 mRNA与蛋白表达,进而降低INS-1细胞内胰岛素含量及分泌量,而外源过表达FGF21恢复了miR-149的抑制作用。MiR-149可靶向FGF21表达抑制其下游JNK、ERK信号通路活性。【结论】本研究揭示了在INS-1胰岛β细胞中,miR-149可通过直接靶向FGF21阻断其下游JNK、ERK信号通路抑制胰岛β细胞分泌胰岛素,进一步揭示了糖尿病发生发展恶化机制,为临床诊断治疗提供了新思路。