N-糖基化改造提高Aspergillus fumigatus生淀粉糖化酶的催化效率

生淀粉糖化酶(raw starch glucoamylase,RSGA)可以直接作用于未糊化淀粉颗粒。该研究基于Aspergillus fumigatus来源RSGA氨基酸序列分析发现,Asn121、Asn422和Asn610位点均为Asn-Xaa-Ser形式的糖基化基序,具有将其突变为Asn-Xaa-Thr形式糖基化基序的潜力。首先,利用NetNGlyc 1.0 Server评估突变序列N-糖基化的可能性,并获得突变体S123T(Asn121-Pro122-Thr123)、S424T(Asn422-Gly423-Thr424)和S612T(Asn610-Arg611-Thr612)。突变体在Komagataella phaffii中表达并完成糖基化,利用去糖基化酶EndoH处理进一步验证突变体均成功被糖基化。在此基础上,以生玉米淀粉为底物,在40℃,pH 4.6的条件下分析了突变体S123T、S424T和S612T的催化效率(k cat/K m),分别是RSGA的1.31、1.29和1.15倍,这主要是由于K m值降低导致突变体对底物的亲和力增加造成的。此外,蛋白浓度及十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰氨凝胶电泳(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE)分析显示突变体S123T表达量提高了9.3%,且糖基化效果显著。酶学性质分析结果显示,重组酶的最适反应温度从70℃降低到60℃。研究结果表明,N-糖基化基序改造是一种有效的提高RSGA的催化效率的策略。

生淀粉糖化酶高产菌的选育

从土壤及霉变淀粉质等样品中分离出对生淀粉具有降解作用的菌种约 6 0株 ,其中生淀粉糖化酶最高的一株根霉OR 1 ,其酶活为 90U/mL ,通过一次紫外和亚硝基胍诱变 ,酶活分别达到 2 0 0U/mL、 3 2 5U/mL ,RDA值分别为 70 %、 6 5 %。诱变株是一株产生淀粉糖化酶较高的根霉。

生淀粉糖化酶的菌种筛选及酶学研究

摘要从自然界分离到一株高酶活的生淀粉糖化酶菌株黑曲霉Sx。在最适产酶条件:固体培养基pH6.5,固水比1∶1.6,30℃发酵24h酶活达382u/g。经纸层析鉴定酶解产物为葡萄糖。粗酶液在贮藏时,当酶液中的SDS浓度达6mg/ml时,30℃保藏10天,酶活保持不变。分析经初步分离提纯的酶的性质得:以玉米淀粉为底物时,该酶最适pH4.5,最适酶反应温度为60℃。pH4.0～7.0范围内酶活力稳定。酶具有较强的热稳定性,80℃保温1h以后,酶活力仍能保持15%。金属离子等对酶的影响为:Ag+、Sn2+对酶有强烈抑制作用;Hg2+、Zn2+、Mn2+、Cu2+有抑制作用;EDTA、Ca2+、Fe2+对酶无影响;Co2+、K+有一定的激活作用。

生淀粉糖化酶产生菌Aspergillus niger(6#)的分离筛选及其产酶条件

从大曲中分离到了1株降解生淀粉能力较强的黑曲霉Aspergillusniger(6#).固体发酵酶活可达2461U/g,RDA值为21.47%;液体发酵酶活可达353U/mL,RDA值为20.30%.以6#菌为实验材料,进一步考察了氮源、碳源及pH对生淀粉糖化酶形成的影响.实验结果表明,无机氮源NaNO3较有机氮源蛋白胨更有利于生淀粉糖化酶的形成;pH是影响生淀粉糖化酶形成的重要因素,低pH会阻遏生淀粉糖化酶的形成;玉米粉和麦芽糖较其它碳源更有利于生淀粉糖化酶的形成.

耐酸生淀粉糖化酶的菌种筛选、酶的性质及发酵条件

从大曲中分离到一株在酸性条件下降解生玉米淀粉能力较强的菌株AspergillusMS-09。该菌产生的生淀粉糖化酶在pH3.6的条件下对生玉米淀粉有较好的分解作用,可达到其最适pH条件下酶活的95%以上。通过对AspergillusMS-09菌的形态和18S rDNA分析,确定该菌是一株烟曲霉。对粗酶液的性质进行初步研究发现,酶的最适作用温度为65℃,最适作用pH为4.6。进一步考察了碳源、氮源对形成耐酸生淀粉糖化酶(Acidproof Raw Starch-d igesting G lucoamylase,ARSDG)的影响,发现生玉米粉(2%,w/v)和蛋白胨(1.5%,w/v)更有利于ARSDG的形成。在最佳条件下,液体发酵酶活在pH3.6的条件下可达到80U/mL。

复合淀粉酶酶解生淀粉机理探讨

以生土豆淀粉为原料,考察了复合生淀粉酶水解机制。发现单个糖化酶的酶解遵循Michaelis-Menten机制,而α-淀粉酶的酶解不遵循Michaelis-Menten机制;水解过程中复合酶酶解产物d[G]/dt的变化说明α-淀粉酶能很好地协同糖化酶水解生淀粉,其效果不仅仅是两者的简单相加。

生淀粉高浓度酒精发酵的研究

本研究利用国内常用的糖化酶制剂糖化生玉米面中的淀粉,同时接种酵母菌,在30℃下,探讨了玉米淀粉的高浓度酒精发酵工艺。选择到了一株产高浓度酒精酵母菌,H0菌株。发酵温度为30℃、pH4—5、加糖化酶量为每克原料300单位、酵母接种量3％(v/v)和原料加量为33.0％(w/v)时,这株酵母菌在70小时内可产生17.5％(v/v)的乙醇。如果原料加量为36.0％(w/v)时,该菌株在96小时内可以产生18.0％(v/v)的乙醇。在前一种加料情况下,成熟发酵醒中的pH为5、残还原糖为0.19％、残总糖为3.5％。在后一种加料情况下,成熟发酵醪中的pH为5、残还原糖为0.81％、残总糖为5.1％。

响应面法优化产低温生淀粉糖化酶发酵培养基

在单因素实验确定显著因素的基础上,采用响应面法优化气单胞菌(Aeromonas sp.)RS01的发酵培养基。单因素实验确定碳源玉米生淀粉浓度为40g/L,氮源牛肉膏的浓度为12g/L,氯化钠的浓度为3g/L。响应面法优化得到玉米生淀粉、牛肉膏、氯化钠3个显著因素的最佳浓度分别为43.21g/L、12.01g/L、3.21g/L,此条件下低温生淀粉糖化酶酶活达到98.42U/mL,比优化前提高了51.67U/mL,与模型预测值100.32U/mL基本吻合。牛肉膏与NaCl交互作用不显著,玉米生淀粉与NaCl、玉米生淀粉与牛肉膏交互作用显著。

黑曲霉S_1生淀粉糖化酶生物合成的调节研究

本文对黑曲霉S_1(Aspergillus niger S_1)生淀粉糖化酶生物合成调节进行了初步研究,认为该菌生淀粉糖化酶的合成与菌体生长呈负相关,即酶的合成过程是典型的选择性合成过程。该菌生淀粉糖化酶的合成受降解物阻遏调控,缓慢供给低浓度易利用碳源和添加环腺苷磷酸(cAMP)可使酶的合成消阻遏,通过研究放线菌素C_1(Actinomycin C_1)等抑制剂对酶合成的影响而推断黑曲霉S_1生淀粉糖化酶合成的阻遏调控发生在转录水平上。

黑曲霉G-1125生淀粉糖化酶基因的克隆与序列分析

从黑曲霉Aspergillus niger G-1125克隆到了生淀粉糖化酶菌基因的DNA及c DNA序列。序列分析表明,该生淀粉糖化酶基因组DNA序列编码区长2172 bp,c DNA编码区长1923 bp,该基因含有4个内含子,共编码640个氨基酸,前18个氨基酸为信号肽序列,该氨基酸序列中共含有2个潜在的糖基化位点,软件预测出该酶的分子质量约为68 ku,等电点为p H值4.07。

黑曲霉S_4生淀粉糖化酶纯化组分的性质及其动力学常数

生淀粉糖化酶是可以水解生淀粉的葡萄糖糖化酶(Ec3.2.1.3,α-1.4-糖苷酶),它是近代工业中极为重要的酶类之一。虽然对生淀粉糖化酶可水解淀粉中所有的D-糖苷键已经清楚,由单糖逆合成寡糖的动力学研究也比较深入,但有关它对各种常用生淀粉材料的水解动力学以及各生淀粉糖化酶组分之间的相互关系的研究却很少。本研究通过在不同温度和pH下,生淀粉糖化酶的三个组分对寡糖和各种生淀粉作用的动力学常数。

生淀粉酶细菌菌株的筛选及其酶学性质研究

分离筛选到一株生淀粉酶酶活较高的菌株QD006,通过形态和常规生理生化鉴定,初步确定该菌为Staphylococcus intermedius。该菌产生的生淀粉酶最适温度为50℃,最适pH为6.5,该酶具有良好的热稳定性。Na+、K+、Ca2+对该酶有激活作用,Fe3+、Zn2+和Cu2+对该酶有抑制作用。

黑曲霉S4生淀粉糖化酶的分离纯化及其特性

用酒精沉淀、Sephadex G-100凝胶过滤和离子交换柱层析等步骤对黑曲霉(Aspergillusniger)S4的生淀粉糖化酶进行了分离,纯化出三个电泳纯组分(GⅠ、GⅡ和 GⅢ),纯化倍数分别为5.4、6.0和1.9;酶活收率分别为10.2%、10.7%和1.9%。三个组分均为酸性糖蛋白,其糖含量分别为11.68%、8.6%和3.6%;pI 值分别为4.0、3.9和3.6;分子量分别为138000、62000和57500。通过对这三个组分的性质和它们对生淀粉作用的 V(max)/K_m 值的测定,探讨了生淀粉糖化酶的作用机理。

玉米原料无蒸煮酒精发酵工艺的研究

在玉米原料无蒸煮酒精发酵过程中，添加少量的纤维素酶，酸性蛋白酶可提高糖化酶对生淀粉的糖化作用，减少糖化酶用量。在料水比1：2．5，糖化酶加量200u／g，纤维素酶加量5u／g，酸性蛋白酶加量0．01％、30℃、pH3．5条件下，No.2141菌株经96h发酵，浮液酒精度达12．8％。淀粉利用率达92．1％。

生淀粉糖化酶产生菌1-16的选育研究

对生淀粉糖化酶产生菌黑曲霉进行了初步诱变选育，得到一株具有较高生淀粉糖化酶生产能力的１一１６菌株，其生淀粉糖化酶平均发酵单位较原菌株提高了３９％。

无蒸煮生淀粉糖化酶菌的选育

从２３份土样中筛选出１０５株野生型霉菌，其中有１０株具有较高的糖化生淀粉的能力，尤以Ａ—４（Ⅱ）、Ｃ和Ｅ６３株菌酶活力最高，分别达１１２５２，８２５１和８２５１个酶活性单位；对Ｃ株菌进行紫外光诱变，从诱变后的菌株中筛选出有较大正向突变的２株菌株Ｃ（１）和Ｃ（５），与诱变前相比，Ｃ（１）菌的生淀粉糖化酶活力提高了２７３％，经生淀粉酒精发酵试验，相同条件下酒精度提高了２２４％；Ｃ（５）菌的生淀粉糖化酶活力提高了１２１％，酒精度提高了５９７％。

生淀粉结合域SBD及糖化酶基因在毕赤酵母中的融合表达

【目的】研究生淀粉结合域SBD及糖化酶基因在毕赤酵母中的融合表达，提高酶的表达量和水解生淀粉的能力。【方法】利用In-fusionTMPCR克隆技术将淀粉结合域SBD无缝隙插入到黑曲霉糖化酶基因glu的5’端构建融合表达质粒pPICgK-psg，实现融合酶基因psg在毕赤酵母GSll5中的高效表达，并进行酶学性质研究。【结果】融合酶的最适作用条件及热稳定性均与原始酶无明显差别，但反应温度及pH值的范围更为宽泛，在反应温度6O～70℃，pH值为4．0～7．0时均较稳定；融合酶PSG降解生淀粉的能力较原始酶PG提高29．6％，比原始菌株提高86．5％。【结论】淀粉结合域SBD的融合提高了糖化酶水解生淀粉的能力。

一株产生淀粉糖化酶的拟青霉

从土壤中分离筛选到一株降解生淀粉能力较强的菌株,通过固体发酵其生淀粉糖化酶活为2237U/g(按U/g麦麸计),RDA值为15.25%。根据形态学特性初步鉴定该菌属于拟青霉属(Paecilomyces sp.)。其最适生长温度为30℃,最适生长起始pH5。其粗酶液24h水解生玉米淀粉的水解率为86.88%;对不同来源的生淀粉的水解能力不同,为玉米粉>面粉>米粉>木薯粉>甘薯淀粉;其最适作用pH为4,最适作用温度为70℃。

生淀粉糖化酶高产菌株诱变选育

以细菌Aeromonas.sp.CNY01为出发菌株,通过紫外(UV)和硫酸二乙酯(DES)诱变,获得产酶较高的菌株CNY01-27-13,酶活达到98.42 U/mL,比原始菌株酶活提高了110.52(,菌株经过9次传代,酶活较稳定。

一株木薯生淀粉糖化酶菌株的分离及酶学性质研究

从腐烂的木薯中分离得到1株降解生淀粉能力较强的菌株ITBB FC2,经形态学鉴定和18S rDNA序列分析,初步鉴定属于黑曲霉（Aspergillus niger）。该菌株用2%生木薯粉培养基摇瓶,37℃,200 r/min培养3 d后,发酵液葡萄糖含量为970 mg/L,生淀粉酶活力为495.04 U/mL。采用固体产酶培养基（麸皮∶水=1∶1）培养,所得酶活力为6 330 U/g。酶反应最适pH为4.0~5.0。Ca2＋对酶活力有一定的促进作用。