川芎嗪对rd和rds小鼠视网膜光感受器细胞干预作用的光镜观察

目的通过rd和rds小鼠视网膜光感受器细胞的病理变化探讨盐酸川芎嗪对遗传性视网膜色素变性小鼠可能的治疗作用。方法rd和rds新生鼠各84只,随机分为两组,实验组和对照组,每组42只小鼠。实验组小鼠从出生当天开始,ip盐酸川芎嗪80mg/kg,每日2次,至出生后35d;对照组ip等量生理盐水。分别于0d和注射后3、7、14、21、28、35d取眼球,立即经10%中性甲醛固定,光学显微镜下观察水平视网膜近赤道部位光感受器细胞的厚度。结果病理结果显示,经盐酸川芎嗪治疗后14、21、28、35d,与未用药的对照组相比较,rd和rds小鼠光感受器细胞层数明显增加(P<0.01)。结论川芎嗪可延缓rd和rds小鼠视网膜光感受器细胞的破坏。

葛根素对遗传性视网膜色素变性rd小鼠的干预作用及其抗凋亡机制研究

目的观察葛根素对视网膜色素变性rd小鼠外核层细胞和视网膜光感受器外段的病理、超微结构、凋亡和Bcl-2表达的影响,探讨葛根素对rd小鼠的干预作用和干预机制。方法rd新生小鼠随机分为2组,实验组和对照组。实验组小鼠从出生时腹腔注射葛根素80mg.kg-1,每天2次,至生后35d,对照组同时注射等量生理盐水。分别在用药后当日和3、7、14、21、28、35d取眼球,固定后,常规病理和电镜观察。用TUNEL方法检测视网膜光感受器细胞的凋亡,用免疫组化方法测定Bcl-2在视网膜的表达。结果病理结果显示,经葛根素治疗后14、21、28、35d,rd小鼠光感受器细胞层数与未用药的对照组相比较明显增加,P<0.01。电镜结果显示,葛根素可减缓rd小鼠光感受器细胞及其外段盘膜部位线粒体的病变,减少盘膜和外界膜的破坏。rd小鼠经葛根素药物治疗后d7、14、21、28、35,光感受器细胞的凋亡率比未用药的对照组明显减少,P<0.01;d3、7、14、21、28、35,Bcl-2在视网膜外核层及光感受器细胞外段的表达明显增强,P<0.05或P<0.01。结论葛根素可延缓rd小鼠视网膜外核层细胞和视网膜光感受器外段损伤。

小胶质细胞活化与rd小鼠遗传性视网膜变性

目的研究小胶质细胞活化与rd小鼠遗传性视网膜变性的关系。方法对出生后8、10、12、14、16及18d的rd小鼠及对照小鼠视网膜进行感光细胞凋亡TUNEL法检测及形态计量学分析。CD11b免疫组织化学染色标记视网膜小胶质细胞。结果rd小鼠出生后10d视网膜感光细胞层开始出现TUNEL染色阳性细胞,第16d达到高峰。视网膜小胶质细胞在rd小鼠出生后10d开始活化,第14d达到高峰。小胶质细胞向感光细胞层的迁移与感光细胞凋亡之间存在紧密的时间和空间关系。结论rd小鼠视网膜变性以感光细胞凋亡为主。小胶质细胞活化可能在视网膜变性过程中发挥重要作用。

遗传性视网膜变性rd小鼠及其感光细胞凋亡研究

目的 研究遗传性视网膜变性rd小鼠感光细胞层的发育变化及细胞凋亡。方法 对出生后 5d到4 0d的rd小鼠及对照小鼠视网膜感光细胞层进行光镜及超微结构观察、TUNEL法检测及形态计量学分析。结果 与同龄对照鼠相比 ,rd小鼠出生后第 10d视网膜开始变性 ,尔后 1周内感光细胞迅速减少 ,第 18d时只残留一层视椎细胞。rd小鼠出生后第 10d感光细胞层开始出现TUNEL染色阳性细胞 ,第 14d及 16d达到高峰。电镜下变性高峰期rd小鼠视网膜感光细胞层可见大量浓缩核、染色质边聚及凋亡小体。结论 rd小鼠视网膜感光细胞在发育过程中变性 ,并通过凋亡的方式死亡。

中药复方制剂对rds小鼠感光细胞凋亡的干预作用研究

目的观察中药复方制剂对先天性视网膜变性小鼠视网膜感光细胞凋亡的影响。方法以黄芪等药组成复方制剂1。对先天性视网膜变性动物模型rds小鼠,采用原位末端转移酶标记(TUNEL)方法及组织病理学技术,观察复方制剂1作用后,小鼠视网膜感光细胞数量及感光细胞凋亡的变化。结果仔鼠2周时,中药组小鼠视网膜感光细胞核数与对照组相比无明显差别,两组感光细胞凋亡率分别为1.6%及6.5%,组间差异有显著性(P<0.01);4周时中药组感光细胞核数目较对照组多,差异有显著统计学意义(P<0.01),两组感光细胞凋亡率分别为3.3%及8.5%,组间差异有显著统计学意义(P<0.01)。结论中药复方制剂1可以延缓rds小鼠视网膜色素变性过程中感光细胞凋亡的发展。

rd小鼠出生后5周内视网膜外核层细胞及其外段的光镜和电镜观察

目的观察遗传性视网膜色素变性rd小鼠视网膜外核层细胞层的病理和超微结构变化,为进一步应用rd小鼠进行实验研究提供数据。方法rd新生鼠42只,分别在第0、3、7、14、21、28、35d取眼球,立即经10%中性甲醛固定,光学显微镜下观察眼球水平位视网膜赤道部外核层细胞的厚度;另取眼球经2.5%戊二醛溶液固定,电镜观察。结果病理结果显示,rd小鼠视网膜外核层细胞层数或密度从第14d开始减少2.14层±0.60层,第21d减至近单层1.30层±0.37层,第35d减至0.57层±0.25层。电镜结果显示,rd小鼠视网膜光感受器细胞层生后第14d出现凋亡;外段盘膜部位线粒体从第7d开始出现部分溶解、减少,逐渐加重;外界膜也从第7d开始变为较连续,第21d后不连续。结论视网膜光感受器细胞外段的线粒体和外界膜对于视网膜盘膜的形成起重要作用。这一结果为进一步开展rd小鼠的研究提供了科学依据。

母婴分离应激对rd新生小鼠行为的影响

目的 rd小鼠是一种出生1周左右自发致盲的遗传性视网膜变性小鼠。通过母婴分离应激实验,检测其对rd新生小鼠的焦虑样和抑郁样行为的影响,初步评价rd小鼠能否成为眼部疾病与焦虑抑郁研究新的模型。方法将出生第1天的rd小鼠分为母婴分离组(n=9)和对照组(n=9)。母婴分离组每天与母鼠分离4 h,共分离28 d。从第29天开始行为测试实验,通过Smart3动物行为跟踪软件检测母婴分离组和对照组在旷场实验和十字高架实验中的焦虑样行为,在强迫游泳实验和悬尾实验中的抑郁样行为。结果在旷场实验中,母婴分离组在旷场中心的时间比例(0.88%)和运动距离(28.17±5.65)cm均明显少于对照组(2.61%,109.9±9.79 cm;P=0.04,P=0.001);在十字高架实验中,母婴分离组在开放臂的时间(40.64±4.13)s明显少于对照组(91.73±11.26 s,P<0.01);在强迫游泳实验中,母婴分离组的不动时间(126.5±10.22)s明显多于对照组(77.75±16.83s,P=0.02);在悬尾实验中,母婴分离组的不动时间(21.56±6.83)s多于对照组(7.37±3.22 s,P=0.03)。结论rd小鼠母婴分离28 d应激,能够明显增加rd小鼠的焦虑样行为和抑郁样行为。

脑苷肌肽对rd小鼠视网膜细胞保护作用的研究

目的观察脑苷肌肽(cattle encephalon glycoside and ignotin,CEGI)对体外分离的rd小鼠视网膜细胞的保护作用,旨在探求CEGI对视网膜以及视神经损伤相关疾病的治疗效果,为临床用药提供客观依据和指导。方法采用体外分离rd小鼠视网膜细胞悬液,用MTT和台盼蓝染料排斥法观察CEGI和神经生长因子(NGF)对细胞活性的影响。结果 MTT实验示CEGI8.00mg·L-1、0.04g·L-1、0.20g·L-1和NGF0.04mg·L-1、0.20mg·L-1对视网膜细胞活性有促进作用,尤其以CEGI0.04g·L-1和NGF0.20mg·L-1最为明显,细胞增殖率分别为130.0%±21.8%和124.0%±13.3%。若将二者组合使用,可使细胞增长率达到132.0%±9.1%,与药物空白对照组100.0%±10.1%相比差异均有统计学意义。台盼蓝染料排斥试验结果显示0.04g·L-1CEGI组活细胞比例在除5min外的各时间点,都明显高于对照组,而0.20mg·L-1NGF组也可保护视网膜细胞,主要以短时间点为主(5min～1d),与对照组相比差异均有统计学意义(均为P<0.05)。结论 CEGI有促进视网膜细胞生长发育作用,对rd小鼠视网膜细胞有一定的保护作用。

川芎嗪对视网膜色素变性rd小鼠的干预作用及其抗凋亡作用机制研究

目的观察川芎嗪对视网膜色素变性rd小鼠视网膜外核层细胞的病理、超微结构、凋亡和Bcl-2表达的影响,探讨川芎嗪对rd小鼠的干预作用和干预机制。方法rd新生小鼠84只随机分为实验组和对照组,每组42只。实验组小鼠从出生时腹腔注射盐酸川芎嗪80mg/kg,每天2次,至生后35天,对照组同时注射等量生理盐水。分别在用药后0、3、7、14、21、28、35天取眼球,立即经10%中性甲醛固定,常规病理切片。另取眼球经2.5%戊二醛溶液固定,电镜观察。用TUNEL方法检测视网膜外核层细胞的凋亡,用免疫组化方法测定Bcl-2在视网膜的表达。结果病理结果显示,经盐酸川芎嗪治疗后14、21、28、35天rd小鼠外核层细胞层数与未用药对照组比较,明显增加(P<0.01)。电镜结果显示,川芎嗪可减缓rd小鼠外核层细胞和视网膜光感受器细胞外段盘膜部位线粒体的病变,减少盘膜和外界膜的破坏。rd小鼠经盐酸川芎嗪药物治疗后第7、14、21、28、35天外核层细胞的凋亡率明显低于未用药对照组(P<0.01);第3、7、14、21、28、35天Bcl-2在视网膜外核层及光感受器细胞外段的表达明显增强(P<0.05或0.01)。结论盐酸川芎嗪可延缓rd小鼠视网膜外核层细胞的减少,其作用机制可能是通过上调视网膜外核层及光感受器细胞外段Bcl-2的表达延缓rd小鼠视网膜光感受器细胞的凋亡。

应用双向电泳对 rds和 C3B鼠视网膜蛋白质组的初步研究

目的 应用蛋白质组分析技术 ,分离 rds鼠视网膜中与视网膜色素变性 (RP)相关的特异表达蛋白质。方法 分别取不同时期的 rds鼠和正常 C3B鼠视网膜 ,用双向电泳(2 - DE)技术 ,对比、分析其表达蛋白质点的差异 ,寻找 rds鼠视网膜中与色素变性相关的蛋白质。结果 用化学裂解法结合超声波粉碎 ,可以裂解视网膜神经组织 ,使其大部分蛋白质得到溶解 ;采用载体两性电解质 p H梯度等电聚焦为第一向 ,垂直板 SDS- PAGE为第二向分离视网膜蛋白质 ,得到蛋白质组表达谱。 37d的 rds和 C3B鼠视网膜蛋白质组成有较大的差异 ,有些蛋白质仅在 rds小鼠或正常小鼠视网膜中表达 ,有些蛋白质在 rds小鼠视网膜中表达降低或升高 ,整体上视网膜色素变性鼠的蛋白质较正常鼠表达减少。结论 双向电泳可以有效分离、显示视网膜特异表达蛋白质。通过双向电泳 ,我们发现 rds鼠视网膜蛋白质表达与正常鼠相比有质和量的差异。

NADPH氧化酶抑制剂对遗传性视网膜色素变性感光细胞凋亡的抑制作用

背景 我们先前的研究表明,rd小鼠遗传性视网膜色素变性（RP）过程中小胶质细胞活化与感光细胞的凋亡密切相关.研究显示,小胶质细胞中烟酰胺二磷酸腺苷（NADPH）氧化酶的活化在小胶质细胞活化及神经元损伤中发挥重要作用,但NADPH氧化酶在RP过程中作用机制及其抑制剂的作用有待探讨.目的 探讨rd小鼠发生RP过程中NADPH氧化酶产生活性氧簇（ROS）的活化反应及其抑制剂对感光细胞的保护作用. 方法 按抛掷硬币法将60只SPF级rd小鼠随机分为香荚兰乙酮注射组和PBS对照组,香荚兰乙酮注射组小鼠于出生后9d（P9）腹腔内注射NADPH氧化酶抑制剂香荚兰乙酮10 mg/kg（0.01 ml/kg）,每日1次,连续5d（至P13）;PBS对照组rd小鼠以同样方式注射等容量的PBS;C57 BL/6N小鼠10只不注射任何药物作为rd小鼠的野生对照鼠.各组小鼠于出生后14 d（P14）处死并制备视网膜冰冻切片,采用二氢乙锭（DHE）荧光染色法检测3个组小鼠视网膜中ROS的表达;采用实时定量PCR（real-time PCR）法测定2个组rd小鼠视网膜感光细胞中视紫红质mRNA的定量表达;采用苏木精-伊红染色法检查2个组rd小鼠视网膜外核层厚度.结果 DHE荧光染色表明,小鼠视网膜中ROS表达呈红色荧光,注药组小鼠视网膜外核层中ROS的红色荧光明显强于C57BL/6N野生鼠,但明显弱于PBS对照组.Real-time PCR检测表明,香荚兰乙酮注射组小鼠感光细胞中视紫红质mRNA相对表达量为4.21 ±0.33,明显低于PBS对照组的0.93±0.24,差异有统计学意义（t=2.360,P=0.000）;香荚兰乙酮注射组小鼠视网膜外核层厚度为（35.95±1.63） μm,明显厚于PBS对照组的（23.17±1.38） μm,差异有统计学意义（t=3.850,P=0.016）.结论 在rd小鼠视网膜感光细胞变性过程中,NADPH氧化酶生成ROS的活化反应明显增强;香荚兰乙酮能够延缓rd小鼠感光细胞的凋亡过程.

中药对体外培养视网膜神经细胞的干预作用研究

目的 观察中药对体外培养新生小牛及先天性视网膜变性小鼠rds小鼠视网膜细胞生长的干预作用。方法 采用MTT法观察单味中药、复方、中药单体成分对新生小牛和rds小鼠体外培养视网膜神经细胞增殖率的影响。结果 复方 1、枸杞、枸杞多糖、当归、阿魏酸对牛视网膜神经细胞有明显的促增殖作用 ,黄芪、黄芪多糖、bFGF的保护作用较为温和 ,丹参无明显促增殖作用。各药物对rds小鼠的作用趋势与新生小牛视网膜细胞基本相同 ,复方 1对 2个种系的视网膜细胞均作用最强 ,浓度 5 g·L-1时新生小牛视网膜的增殖率为 16 2 % ,浓度 10g·L-1时rds小鼠视网膜的增殖率为 188.0 2 % ,bFGF对rds小鼠视网膜神经细胞无明显作用。结论 复方 1等中药对体外培养视网膜神经细胞生长有较好的保护作用。

夜明颗粒对视网膜色素变性小鼠光感受器细胞保护作用的实验研究

目的:探讨夜明颗粒制剂对遗传性视网膜色素变性小鼠的作用机理。方法:我们取4周龄、12周龄、24周龄rds鼠各9只,随机分为三组,夜明颗粒组4只、杞菊地黄丸组3只和对照组2只。给药28d后取眼球,立即经10%中性甲醛固定,光学显微镜下观察水平视网膜近赤道部位光感受器细胞的厚度。结果:经夜明颗粒治疗后,光镜结果显示,rds小鼠光感受器细胞层数明显增加,与对照组和空白组比较,组间差异有显著性(P<0.05)。结论:夜明颗粒可延缓rds小鼠视网膜感光细胞凋亡的发展。

脑苷肌肽对视网膜变性小鼠发育过程的影响

目的:观察脑苷肌肽(CEGI)对视网膜变性模型(rds小鼠)发育过程的影响,旨在探求CEGI治疗视网膜变性类疾病的治疗效果,为临床用药提供客观依据和指导。方法:采用组织病理学技术(光、电镜)和原位末端转移酶标记(TUNEL)方法观察脑苷肌肽腹腔给药干预后视网膜组织形态、超微结构、感光细胞凋亡的变化。结果:生后14d(P14)是rds鼠视网膜发育最完善阶段,随后28～56d,视网膜外核层及内核层细胞层数逐渐减少,感光细胞凋亡细胞数逐渐增多,电镜观察有凋亡核变化以及内节和纤毛崩解。给予CEGI治疗后28d和56d,视网膜细胞层数较同日龄对照组增厚,凋亡细胞数减少,有统计学差异(P<0.05)。神经生长因子(NGF)与CEGI作用相似。结论:脑苷肌肽有促进视网膜细胞生长发育作用,对rds小鼠视网膜变性过程有一定的缓解作用。

视网膜变性小鼠视网膜组织中FasL蛋白表达的动态变化

背景视网膜移植是治疗视网膜变性性疾病的新方法，但如何避免或减少视网膜移植后的免疫排斥反应是亟待解决的问题之一。目前的实验研究中常将正常C57BL／6小鼠视网膜作为供体，视网膜变性（rd）小鼠作为受体。研究表明视网膜中Fas配体（FasL）蛋白通过FasL／Fas途径诱导Fas＋炎症细胞凋亡，推测可能与视网膜移植后的免疫排斥反应密切相关。目的探讨FasL蛋白在不同鼠龄C57BL／6小鼠和rd小鼠视网膜中的表达特点，揭示小鼠视网膜的免疫特性，为视网膜移植免疫排斥反应的研究提供参考依据。方法分别将出生后（PN）-0周（出生日）、PN-1周、PN-2周、PN-3周、PN-4周的正常C57BL／6小鼠和rd小鼠处死制备眼球冰冻切片，采用免疫荧光技术摄片，并经激光扫描共焦显微镜采集图片，用图像分析软件对各鼠龄不同品系小鼠间视网膜中FasL蛋白表达的荧光强度（FI）变化进行半定量分析。结果PN．1周C57BL／6小鼠视网膜发育尚不完善，FasL蛋白在视网膜各层均呈阳性表达。PN-2、3、4周C57BL／6小鼠已发育成10层的视网膜结构，FasL蛋白在视网膜色素上皮（RPE）、内节段（IS）、外界膜（OLM）、外丛状层（OPL）、内核层（INL）、内丛状层（IPL）及节细胞层（GCL）呈阳性表达。PN-1周rd小鼠视网膜结构与同龄C57BL／6小鼠接近，FasL蛋白在视网膜各层均呈阳性表达。PN．2周至PN-4周rd小鼠视网膜中外核层（ONL）细胞随着鼠龄增大逐渐减少，FasL蛋白在RPE、OPL、INL、IPL及GCL呈阳性表达；PN-2、3、4周rd小鼠RPE中FasL蛋白表达FI值分别为184．199±16．747、186．797±7．904和184．319±18．795，均明显高于同龄C57BL／6小鼠的160．402±22．851、160．995±22．799和105．787±17．676，差异均有统计学意义（t=-3．360，P=0．002；t’=-4．277，P=0．000；t=-12．175，P=0．000）；各周龄rd小鼠与C57BL／6小鼠间视网膜IPL中FasL蛋白表达的FI值差异均无统计学意义（均P〉0．05）。结论rd小鼠随着鼠龄增加视网膜ONL细胞逐渐减少，其RPE内免疫赦免相关抗原FasL蛋白的表达强度明显高于同龄C57BL／6小鼠。

细胞因子Ⅱ在遗传性视网膜色素变性的转基因小鼠视网膜的表达研究

目的探讨细胞因子Ⅱ（ｃａｌｐａｉｎ Ⅱ）在视网膜色素变性过程中表达的变化，以此窥视遗传性视网膜色素变性的转基因小鼠（ ｒｄｓ 小鼠）发病的某些可能因素。方法以 Ｃ３ Ｂ 小鼠为对照，选择不同生长时期的ｒｄｓ小鼠的视网膜组织，用免疫组化方法检测Ｃａｌｐａｉｎ Ⅱ在不同生长阶段的小鼠模型视网膜中的是否表达及表达情况。结果１周即可见Ｃａｌｐａｉｎ Ⅱ在ｒｄｓ小鼠视网膜神经节细胞层的表达， ２周左右内核层也见表达， ４周后外核层也开始出现由强至弱的ｃａｌｐａｉｎ Ⅱ强阳性表达，最终至全部视网膜剩余组织中均可见ｃａｌｐａｉｎ Ⅱ的表达。结论只有高钙才能激活ｃａｌｐａｉｎ Ⅱ的表达，研究中ｃａｌｐａｉｎ Ⅱ参与了ｒｄｓ小鼠视网膜细胞的变性死亡。因此，高钙是ｒｄｓ小鼠视网膜变性的一个可能因素。

β趋化因子受体CCR1在遗传性视网膜变性小鼠视网膜中的表达

目的探讨β趋化因子主要的受体之一β趋化因子受体1(CCR1)在视网膜变性模型小鼠(rd小鼠)的视网膜变性过程中的表达及其在感光细胞凋亡中的病理作用。设计实验研究。研究对象出生后8、10、12、14、16及18天的rd小鼠各10只(共60只)及同龄C57BL/6N对照小鼠各10只(共60只)。方法小鼠断颈处死,取双眼眼球制作冰冻切片或分离新鲜视网膜组织。逆转录多聚酶链反应(RT-PCR)测定各鼠龄rd小鼠及对照鼠视网膜CCR1mRNA的表达水平。免疫组织化学法观察CCR1蛋白在各鼠龄rd小鼠视网膜的定位表达。CCR1在感光细胞及凋亡细胞中的表达由免疫荧光双标法确定。主要指标视网膜CCR1mRNA及蛋白的表达、CCR1的细胞定位及与凋亡细胞的关系。结果 CCR1mRNA在对照组及各鼠龄rd小鼠视网膜中均有表达,但在出生后12、14天rd小鼠视网膜中表达明显升高(光密度值分别为0.986±0.17和1.152±0.22,P=0.010和0.008)。CCR1阳性染色细胞开始出现于出生后8天的rd视网膜外核层,并于12及14天达到高峰。对照组视网膜外核层无CCR1阳性染色。CCR1与视紫红质、CD11b或TUNEL染色免疫荧光双标结果显示,CCR1表达于感光细胞而非小胶质细胞中,部分CCR1表达于凋亡的感光细胞中。结论在rd小鼠视网膜中CCR1表达于感光细胞并随其变性程度加重表达升高。CCR1的活化可能在rd小鼠感光细胞凋亡中发挥作用。(眼科,2013,22:383-388)