视网膜色素变性Rd1小鼠眼球中增殖细胞核抗原(PCNA)的表达

目的探讨增殖细胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen,PCNA)在Rd1小鼠视网膜上的表达情况。方法取出生后14d、21d、28d的Rd1小鼠和C57BL/6J小鼠各5只,摘出眼球进行HE染色,观察视网膜形态学结构变化;免疫组织化学染色与实时荧光定量PCR检测PCNA蛋白和基因在不同鼠龄小鼠中的表达。结果 HE染色结果显示:PCNA蛋白均在两种小鼠视网膜神经节细胞中表达; C57BL/6J小鼠视网膜结构完整;与C57BL/6J小鼠相比,Rd1小鼠视网膜发育随着鼠龄的增加,发生进行性退化。免疫组织化学染色结果显示:PCNA蛋白表达仅局限于视网膜神经节细胞,免疫阳性信号出现在第14天和第21天,而在第28天未检测到。PCR实验结果显示:与C57BL/6J小鼠相比较,鼠龄21d时Rd1小鼠PCNA基因表达水平增高,是C57BL/6J小鼠的2. 23倍;鼠龄14 d和28 d时Rd1小鼠PCNA基因表达均低于C57BL/6J小鼠(均为P <0. 05)。结论 PCNA基因参与了Rd1小鼠视网膜发育退化过程。

rd1小鼠视网膜退变中期节细胞功能的变化

目的：探讨视网膜色素变性模型rd1小鼠视网膜退变中期各类视网膜节细胞（retinal ganglion cells,RGCs）功能的变化情况。方法：运用多电极阵列（multi-electrode arrays,MEA）记录方法,记录视网膜退变中期（出生后20 d,P20）的rd1小鼠或正常对照小鼠视网膜中多个节细胞动作电位的发放,并比较自发发放和光反应特征等指标,评价幸存的节细胞功能变化。另外,采用免疫组化染色方法验证视网膜感光细胞的退化情况。结果：免疫组化的结果表明rd1小鼠视网膜感光层的厚度显著低于正常小鼠。根据节细胞光反应特性的不同,可以将其分成6类：ON sustained、ON transient、ON-OFF sustained、ON-OFF transient、OFF sustained和OFF transient RGCs,但OFF sustained RGCs所占比重极小（1.0%~3.1%）。rd1小鼠视网膜中保持光反应的节细胞比例显著低于正常小鼠。rd1小鼠节细胞的自发发放显著高于正常小鼠,而不同类型的节细胞变化情况有所不同。rd1小鼠视网膜各类节细胞的光反应强度及光敏感度均显著低于正常小鼠。结论：在rd1小鼠退变的中期,视网膜感光层明显退变;rd1小鼠退变中期的视网膜节细胞发生明显的功能退变,而且不同类型的节细胞变化情况有所不同。

细胞周期蛋白B在不同发育阶段Rd1小鼠眼球中的表达及意义

为了研究细胞周期蛋白B(CCNB)在不同发育阶段Rd1小鼠眼球中的表达及意义,采用荧光定量PCR方法对其进行检测。结果表明:与对照组(B6小鼠)相比,CCNB1在出生后21天Rd1小鼠眼球中的表达量极显著升高(P<0.01),约为对照组的146倍。两因素方差分析结果显示,两种属间CCNB1的表达量差异极显著(F=57.64,P<0.000 1),21天时试验组CCNB1的表达量与对照组相比差异极显著(t=24.23,P<0.000 1)。CCNB2在出生后7,14,28天Rd1小鼠眼球中的表达量均比对照组低,而在出生后21天Rd1小鼠眼球中的表达量极显著增加(P<0.01),约为对照组的435倍。在不同发育阶段,试验组CCNB2的表达量与对照组相比有差异。对照组CCNB3的表达量在出生后28天下降,且与对照组相比差异极显著(P<0.01)。在不同发育阶段,试验组CCNB3的表达量与对照组相比有差异。说明细胞周期蛋白B家族在Rd1小鼠视网膜神经细胞退化过程中参与了视神经细胞凋亡进程,在视神经细胞发育中可能发挥重要作用。

NOX2基因缺陷对rd1小鼠感光细胞凋亡的保护作用

目的观察NADPH氧化酶2(NOX2)基因缺陷对遗传性视网膜变性小鼠1(rd1)感光细胞的保护作用。设计实验研究。研究对象出生后14天的NOX2基因缺陷rd1小鼠(实验组)6只及同龄NOX2基因缺陷的C57BL/6N小鼠(对照组1)、无NOX2基因缺陷的rd1小鼠(对照组2)、C57BL/6N野生正常小鼠(对照组3)各6只(共24只)。方法对照组1与对照组2小鼠多次交配获得实验组小鼠并进行基因型鉴定。取该实验鼠及对照组小鼠眼球,对视网膜进行HE染色并测量视网膜外核层厚度,TUNEL染色并计算凋亡细胞占外核层细胞总数百分比、免疫荧光法CD11b抗体标记小胶质细胞并检测NOX2主要亚单位gp91^(phox)蛋白的表达。主要指标视网膜外核层厚度,感光凋亡细胞百分比,gp91^(phox)蛋白的表达量,小胶质细胞活化情况。结果与同龄对照组2相比,实验组小鼠视网膜内外核层排列整齐,其外核层厚度(36.18±2.59)μm明显大于对照组2小鼠(21.45±1.33)μm(t=8.77,P=0.001)。实验组小鼠视网膜凋亡细胞主要出现于外核层,但数量较对照组2明显减少(t=8.46,P<0.001)。与对照组3及对照组1小鼠相比,对照组2小鼠视网膜小胶质细胞明显活化外移浸润外核层,gp91^(phox)表达增加且部分位于小胶质细胞中。而实验组小鼠视网膜gp91^(phox)表达明显减少,小胶质细胞活化受到显著抑制。结论NOX2基因缺陷可有效抑制rd1小鼠视网膜小胶质细胞活化,延缓感光细胞凋亡,有可能成为治疗遗传性视网膜变性疾病的潜在靶点。