应用16SrDNA克隆文库解析人工快速渗滤系统细菌种群多样性

本文通过构建16S rDNA克隆文库开展了人工快速渗滤(CRI)系统表层(10cm深)细菌种群多样性研究,结果表明,在CRI系统表层填料中细菌多样性十分丰富,存在7个主要类群,其中不可培养的酸杆菌纲(uncultured Acidobacteria)和其它不可培养细菌(uncultured bacteria)在整个克隆文库中比例最大,比例为53.72%,其次是浮霉菌纲(uncultured planctomycete)和β-变形菌纲(β-proteobacterium),分别占文库比例的13.89%和8.33%;克隆文库中反硝化菌的比例高于亚硝化单胞菌属细菌(0.925%),没有出现Nitrospira属的克隆子。本文通过16S rDNA克隆文库揭示了在生物膜上存在的优势菌为不可培养菌,而假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)和紫色色杆菌(Chromobacterium sp.)等在平板分离培养中出现的频率较高,两种方法之间的结果存在差异。本研究采用16S rDNA克隆文库方法揭示的结果,将为CRI系统生物降解的进一步提高提供依据。

用16S rDNA克隆文库法分析患病刺参幼苗的菌群结构

采用16S rDNA克隆文库法对某刺参养殖场患病刺参Apostichopus japonicus幼苗（体长为3～5 cm）表皮的菌群结构进行分析。结果表明：化皮参苗病灶组织和未明显化皮参苗表皮菌群均由γ-变形菌纲、β-变形菌纲和α-变形菌纲组成,优势菌为γ-变形菌纲,主要包括志贺氏菌Shigella sp.、不动杆菌Acinetobacter sp.和假单胞菌Pseudomonas sp.;化皮参苗病灶组织中志贺氏菌、不动杆菌和假单胞菌比例分别为49%、17%和5%,未明显化皮参苗表皮中3类菌的比例分别为20%、26%、9%。将该养殖场育苗池海水作为对照并进行菌群结构分析,结果显示,水中菌群同样由γ-变形菌纲、β-变形菌纲和α-变形菌纲组成,优势菌也为γ-变形菌纲,主要包含弧菌Vibrio sp.（75%）与志贺氏菌（12%）。此外,对化皮参苗病灶处进行细菌分离培养,得到一株优势菌,经16S rDNA初步鉴定为弧菌。研究表明,采用16S rDNA克隆文库法所得结果与传统的病原分离培养法存在差异。

应用16S rDNA克隆文库解析好氧颗粒污泥细菌菌群多样性

采用分子生物学手段16S rDNA克隆文库方法,对厌氧折流板反应器(处理黄连素制药废水)出水培养的好氧颗粒污泥进行了细菌多样性研究。从16S rDNA克隆文库中随机挑选了95个克隆子进行序列测定,对测序结果进行了Blast对比。结果表明,好氧颗粒污泥系统中的细菌群落具有高度多样性,52个克隆子分属6个不同的细菌类群,43个克隆子属于未知类群,优势类群主要为变形菌(Proteobacteria)菌群。好氧颗粒污泥中已知菌群的优势菌群为:β-proteobacteria类群、CFB group bacteria类群、α-proteobacteria类群、γ-proteobacteria类群、Enterobacteria类群和ε-proteobacteria类群。

16SrDNA克隆文库方法分析两纯系鸡回肠及盲肠黏膜细菌的组成

以1日龄纯系的优质肉鸡A系(♂,A组)和惠阳胡须鸡(♂,B组)为试验动物,研究比较两纯系鸡28日龄回肠与盲肠黏膜菌群的组成及多样性。于第28日龄分别从2组中采集鸡2个肠段并提取黏膜细菌基因组DNA,应用16S rDNA基因序列技术,建立2个肠段黏膜细菌16S rDNA V3区的随机克隆文库。回肠文库分析发现,A组文库有86个序列共产生6个OTUs()perational taxonomic units),其已知序列主要属于肠球菌属、乳杆菌属、粪球菌属及梭菌属类序列,而B组文库有97个序列共产生2个OTUs,主要属于梭菌类序列;盲肠文库分析发现,A组文库有93个序列共产生44个OTUs,其优势菌群是未分类瘤胃球菌属(18.28%)、粪球菌属(13.98%)、拟杆菌属(10.75%)、Blautia(10.75%)及未分类毛螺菌属(7.53%);B组文库有97个序列共产生42个OTUs,其优势菌群是普拉梭杆菌属(17.53%)、粪球菌属(11.34%)、拟杆菌属(9.28%)及未分类瘤胃球菌属(8.25%);2组盲肠文库中其他菌属的数量存在较大差异,且未发现与大肠杆菌相关的序列。优质肉鸡A系和惠阳胡须鸡28日龄回肠与盲肠黏膜细菌的组成差异明显,尤其是瘤胃球菌属与产丁酸菌的组成比例,这种差异可能是宿主遗传的影响所致。

16S rDNA克隆文库法分析地下水生物反硝化系统细菌种群多样性

采集地下水硝酸盐生物反硝化系统内的污泥样品,提取污泥样品中微生物的总DNA,构建细菌16S rDNA基因片段克隆文库,并通过16S rDNA序列系统发育分析,对反硝化系统内的细菌种群多样性以及菌群结构进行了研究。结果表明,地下水生物反硝化系统内细菌具有高度多样性,样品文库分为9个细菌类群,优势菌群为β-Proteobacteria(67.11%)和Bacteroidetes(15.79%),其中,β-proteobacteria为最优势菌群,以Rhodocyclaceae为主。对反硝化系统内细菌种群多样性的研究有利于确定优势菌种,为地下水硝酸盐生物反硝化修复奠定理论基础。

应用16SrDNA克隆文库解析苏铁珊瑚状根内生放线菌种群多样性

苏铁为古老孑遗植物，被誉为“植物界的大熊猫”和“活化石”。为了研究苏铁珊瑚状根内生放线菌的多样性，通过16SrDNA克隆文库开展了珊瑚状根内生放线菌种群多样性研究，从16SrDNA克隆文库中随机挑选了164个克隆子进行序列测定，对测序结果进行了Blast对比，结果表明，苏铁珊瑚状根中放线菌多样性十分丰富，存在5个目7个科10个属，主要类群为短小杆菌属Curtobacterium、利夫森氏菌属Leifsonia、考克氏菌Kocuria、鸟氨酸微菌属Ornithinimicrobium、微球菌属Micrococcus、丙酸杆菌属Propionibacterium、链霉菌属Streptomyces、拟诺卡氏菌属Nocardiopsis、芽球菌属Blastococcus；克隆得到的内生放线菌优势菌为短小杆菌属Curtobacterium，其次为拟诺卡氏菌属Nocardiopsis和链霉菌属Streptomyces。其中68株内生放线菌是能分离培养的，经16SrDNA片段测序分析，结果表明这些内生放线菌分别与GenBank中已知属相似性达97％-100％；其余的序列相似性低于97％，表明苏铁珊瑚状根中可能存在着放线菌新种。

利用16S rDNA克隆文库研究猪场污水微藻净化后菌群的变化

为促进猪场污水治理,研究微藻净化对猪场污水菌群的影响,将小球藻接种于含60%沼液与40%水的猪场污水进行批式模式培养,循环三次后将小球藻液离心,检测猪场污水、小球藻液以及离心后上清液中的水质指标及菌群变化情况。菌群采用16S rDNA克隆文库方法检测。结果显示,和猪场污水相比,小球藻液及上清液中的化学耗氧量(COD)、总氮、氨氮、总磷、铜、锌等含量极显著降低(P<0.01)。除未知菌群外,猪场污水中的主要菌群为Firmicutes群和Bellilinea群,含量分别为12.25%和11.22%;小球藻液中主要菌群为小球藻和Cytophaga群,含量分别为42.42%和12.12%;上清液中的主要菌群为Dyadobacter、Cytophaga、Algoriphagus群和Pedobacter群,含量分别为25.00%、14.00%、11.00%和10.00%。猪场污水和小球藻液中未发现共存的微生物,小球藻液与上清液中皆含有Cytophaga群和Dyadobacter、Pseudomonas、Flavobacterium、Algoriphagus、Flexibacter群。表明接种小球藻可以净化猪场污水中的氨氮、总磷以及重金属,改变污水中的菌群,污水净化可能是小球藻和其共存菌共同作用的结果。

应用16S rDNA克隆文库法分析有机物料腐熟菌剂细菌组成

应用16SrDNA克隆文库法对有机物料腐熟菌剂A和B样品中的细菌组成进行分析研究。结果表明,样品A有14个OTU,主要是融合乳杆菌(Weissella confusa)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)和短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus),其比例分别占总克隆文库的28.6%、30.4%和23.2%;样品B有43个OTU,主要是布氏乳杆菌(Lactobacillus buchneri)、香肠乳杆菌(Lactobacillus farciminis)和耐酸乳杆菌(Lactobacillus acetotolerans),占总克隆文库的比例分别为18.03%、18.86%和13.12%;所得出的结果均与产品标注存在差异,样品A未提及细菌的种类,而样品B只标注短小芽孢杆菌。研究表明这一方法在微生物菌剂细菌组成分析及其质量检测中具有良好的应用前景。

16SrDNA克隆文库解析仿刺参(Apostichopus japonicus)苗种培育池中生物絮团的细菌群落结构

通过采集东营和蓬莱地区采用生物絮团技术的仿刺参(Apostichopus japonicus)苗种培育池(DYt和PLt)及其对照池(DYc和PLc)海水样品,构建细菌16S r DNA克隆文库,对其中细菌群落的多样性和群落组成结构进行了分析。结果表明,四个文库Coverage值在34.7%—54.8%之间,文库丰富度指数(Chao)66.2—314.1,Shannon多样性指数从3.01—4.07变动,Pielou均匀度指数0.68—0.85,样品的细菌群落均具有很高的多样性,蓬莱仿刺参苗种培育池细菌多样性均高于东营;生物絮团文库中细菌包括拟杆菌门(Bacteroidetes)、变形细菌门(Proteobacteria)、厚壁菌门(Firmicutes)等八个菌门和未知类群,黄杆菌群(Flavobacteria)、α-变形菌群(Alphaproteobacteria)和芽孢杆菌群(Bacilli)为主要优势菌群;DYt和PLt处理组文库细菌多样性减少并出现特征菌群,生物絮团调控技术改变了仿刺参苗种培育环境的微生物群落结构。生物絮团的细菌群落结构研究,为揭示生物絮团的作用机制并进一步有效利用提供研究基础和依据。

16S rDNA克隆文库技术在活性污泥系统微生物组成分析中的应用

采用构建16S rDNA克隆文库方法对活性污泥系统的细菌种群多样性进行研究。随机测定了71个克隆子序列(1 500bp),BLAST比对结果表明,活性污泥中微生物群落具有高度多样性,可分为6个主要类群,其中,拟杆菌(Bacteroides)类群和γ变形菌(γ-Proteobacteria)类群在文库中所占比例最大,分别为38.03%和32.39%;其次是β-Proteobacteria,占19.72%;Firmicutes,Candidate division TM7和α-Pro-teobacteria类群所占比例相对较小,分别为4.23%,4.23%和1.04%。序列分析结果表明,活性污泥中具有可强化生物脱氮除磷效果的食酸菌(Acidovorax),包括假单胞菌(Pseudomonas),红环菌(Rhodocyclus)等细菌。

16S rDNA克隆文库法分析小龙虾肠道细菌多样性

利用16S rDNA克隆文库法对小龙虾肠道共生细菌进行系统发育分析。采用细菌16S rDNA通用引物以小龙虾全肠DNA为模板扩增共生细菌的16S rDNA并建立基因文库,对得到的基因序列进行系统发育分析。结果表明,从小龙虾肠道共得到24个不同的16S rDNA序列,系统发育分析表明这24个16S rDNA序列代表的克隆分别与柠檬酸杆菌属、拟杆菌属、梭菌属、Anaerorhabdus furcosa、Haloplasma、希瓦菌属、巨型球菌属、中慢生根瘤菌属、Brachymonas、Sinanaerobacter、Cyanobium、丹毒丝菌属菌株的16S rDNA序列最为接近,相似性为83.6%~99.4%。小龙虾肠道内细菌资源丰富,且肠道细菌在小龙虾食物消化过程中发挥一定作用,而16S rDNA克隆文库法在反映小龙虾肠道中主要微生物的物种组成,特别是样本中优势微生物类群上具有一定优势。

应用16SrDNA克隆文库法分析雪菜低盐腌制过程微生物群落的多样性

雪菜低盐腌制保藏对资源节约,减少含盐废水排放及蔬菜营养保持等具有重要意义。应用构建的16S rDNA克隆文库方法,研究低盐腌制雪菜在不同发酵时期的细菌多样性及主要指标的变化情况。结果表明,整个腌制体系微生物种类丰富,主要分为2大类:肠杆菌目(Enterobacteriales)和乳杆菌目(Lactobacillales)。随着腌制发酵时间的不同,5个不同时期环境中细菌群落组成存在较大的差异。腌制初期阶段,主要优势菌群为肠杆菌目中的肠杆菌属和欧文菌属;发酵中、后期主要优势菌群发生改变,主要为乳杆菌目中的乳杆菌属,其中植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)起主导作用。此外,雪菜腌制过程中乳酸菌数量及pH也相应地发生变化。

16S rDNA克隆文库法探索转基因香石竹对土壤细菌群落的影响

【目的】通过研究转基因香石竹对土壤细菌群落的影响,为转基因香石竹的环境安全性评价提供依据。【方法】通过构建16S rDNA克隆文库,分析种植转基因和非转基因香石竹的土壤中细菌的群落结构组成。【结果】转基因和非转基因香石竹土壤中,共有的菌群有变形菌门(Proteobacteria)、浮霉菌门(Planctomycetes)、酸杆菌门(Acidobacteria),其中α-变形菌门、β-变形菌门、浮霉菌门为优势菌群;而在放线菌门(Actinobacteria)、疣微菌门(Verrucomicrobia)及未培养菌(Uncultured bacterium clone)等菌群存在部分差异。【结论】通过16S rDNA克隆文库方法揭示了转基因香石竹的土壤中细菌多样性十分丰富,其栽培对土壤细菌群落结构影响有限。

16SrDNA克隆文库解析AO-MBR系统中细菌种群多样性

采用分子生物学手段16S r DNA克隆文库方法对缺氧/好氧膜生物反应器(AO-MBR)的好氧池与缺氧池中细菌进行了多样性研究。实验结果表明,好氧池污泥样品的克隆文库包括9个类群,其中变形菌(Proteobacteria)和拟杆菌(Bacteroidetes)在文库中所占比例最大,分别为37.04%和14.81%;其次是酸杆菌(Acidobacteria)、未培养菌(uncultured bacterium)、绿菌(Chlorobi)和未培养的绿弯菌(uncultured Chloroflexi bacterium)、浮霉状菌(Planctomycetes),分别为11.11%、11.11%、7.41%、7.41%和5.56%;硝化螺旋菌(Nitrospirae)和裸藻门(Euglenozoa)所占比例相对较小,均为1.85%。缺氧池样品克隆文库包括10个类群,其中变形菌(Proteobacteria)、拟杆菌(Bacteroidetes)和未培养菌(uncultured bacterium)在文库中所占比例最大,分别为27.91%、13.95%和12.79%;其次是浮霉状菌(Planctomycetes)、酸杆菌(Acidobacteria)和绿弯菌(Chloroflexi),在文库中所占比例分别为9.3%、9.3%和9.3%;硝化螺旋菌(Nitrospirae)、裸藻门(Euglenozoa)、芽单胞菌(Gemmatimonadetes)和放线菌(Actinobacteria)所占比例相对较少,分别为6.98%、8.14%、1.16%和1.16%。两池细菌的主要类群相似,但菌属及比例有所差异,变形菌是系统中的主要脱氮菌属。

16S rDNA克隆文库法分析两种鱿鱼墨多糖对小鼠肠道菌群多样性的影响

探讨北太平洋鱿鱼墨多糖与秘鲁鱿鱼墨多糖对化疗模型小鼠肠道菌群的影响。将40只Balb/c小鼠随机分为4组:正常组、模型组、北太平洋鱿鱼墨多糖组、秘鲁鱿鱼墨多糖组。采用环磷酰胺化疗模型,无菌收集小鼠粪便并提取细菌基因组DNA,通过构建各组小鼠肠道细菌的16S rDNA克隆文库,单酶切分型,观察鱿鱼墨多糖对肠道菌群的作用。试验结果表明:两种鱿鱼墨多糖对化疗模型小鼠肠道菌群种类有一定调节作用,且两种鱿鱼墨多糖效果不尽相同。

克隆文库方法分析厌氧氨氧化反应器中细菌群落结构

为了认识低基质浓度污水厌氧氨氧化(ANAMMOX)脱氮过程的生物学机制,为ANAMMOX脱氮工艺的优化提供理论依据,通过构建细菌16S rDNA(约1 500 bp)克隆文库和浮霉菌特有16S rDNA(约830 bp)克隆文库对ANAMMOX脱氮反应器中活性污泥的细菌群落结构进行分析。从细菌16S rDNA克隆文库中随机挑选到160个克隆子,共31个分类单元(OTU),与GenBank数据库比对结果表明,厌氧颗粒污泥中的细菌群落具有丰富的多样性,包括:变形菌门(Proteobacteria)、拟杆菌门(Bacteroidete)、硝化螺旋菌门(Nitrospira)、酸杆菌门(Acidobacteria)、绿弯菌门(Chloroflexi)、Candidate division OP10、浮霉菌门(Planctomycetes)和未知菌,其中,变形菌门和拟杆菌门为优势菌群,分别占41.9%和34.2%。在浮霉菌特有16S rDNA克隆文库的40个克隆子中,34个克隆子属于CandidatusKuenenia属的厌氧氨氧化细菌,它们是ANAMMOX脱氮过程的主要功能菌。

太湖地区典型菜地土壤微生物16S rDNA的PCR-RFLP分析

土壤微生物多样性是土壤生态功能的基础,但长期以来缺乏对高强度土地利用条件下的土壤微生物多样性的认识。作者采用间接法提取了江苏省太湖地区典型菜地土壤微生物的总DNA,以细菌的通用引物27F和1492R扩增16SrDNA片段,将扩增产物与T-载体酶连,转化大肠杆菌,建立土壤微生物16SrDNA克隆文库。PCR扩增基因文库中插入的16SrDNA外源片段,用两种限制性内切酶HhaI和RsaI分别酶切,获得该土壤173个克隆的酶切指纹图谱。结果表明,HhaI和RsaI联合酶切产生了63个基因分型,文库的覆盖度达76.30%,单一酶切产生的基因分型少,但文库的覆盖度高;克隆文库中存在两种优势类群,分别占总克隆的16%和12%。16SrDNA测序结果表明,太湖地区菜地土壤细菌在分类方面主要属于-和-变形杆菌亚门。以上结果为进一步研究太湖地区菜地土壤微生物生态功能提供了基础资料。

应用16S rDNA-RFLP方法分析宁夏地区稻田土壤细菌的多样性

水稻是宁夏地区主要粮食作物,水稻种植也具有维持生态系统平衡,防止土地荒漠化等重要的生态功能。而稻田土壤细菌是维持土壤生态功能的基础。但长期以来缺乏对干旱地区稻田土壤细菌多样性的认识。本研究采用非培养技术提取稻田土壤样品总DNA,构建其16S rDNA克隆文库,用PCR-RFLP分析进一步测序后聚类分析细菌群落的多样性。从稻田土样中分离获得了大于23kb的DNA片段。PCR-RFLP共得到74种酶切带型,序列分析发现77.3%的克隆序列与环境中未培养细菌的16S rDNA序列有较高的相似性,仅有22.7%的克隆序列与数据库中可培养细菌有较高的相似性,表明宁夏稻区土壤中的多数细菌尚未培养。系统发育研究发现74个序列分属于12个类群,其中变形细菌所占比例最大(37.8%),依次为酸杆菌(16.2%)、放线菌(12.2%)、拟杆菌(10.8%)、绿屈挠菌(10.8%)、浮游霉菌(8.1%),另外有少量厚壁菌门、芽单胞菌门和疣微菌门细菌克隆。在变形细菌的序列中包括α、β、γ和δ4个类型,比例分别为13.5%、5.4%、12.2%和6.8%。表明宁夏稻区土壤中优势细菌类群为变形杆菌和酸杆菌,且土壤细菌类群具有丰富的多样性。

北戴河近岸沉积物中微生物16SrDNA的PCR-RFLP分析

采用间接法提取了北戴河地区近岸沉积物中微生物的总DNA,以细菌的通用引物27F和1492R扩增16S rDNA片段,将扩增产物克隆到T-载体上,并转化大肠杆菌感受态细胞,构建沉积物中细菌16S rDNA克隆文库。PCR扩增基因文库中插入的16S rDNA外源片段,用两种限制性内切酶HhaI和RsaI分别酶切,获得该海洋沉积物131个克隆的酶切指纹图谱。结果表明:HhaI和RsaI联合酶切产生了41个基因分型,文库的覆盖度达74.81%,HhaI和RsaI单酶切产生的基因分型分别为30和22,但文库的覆盖度高;克隆文库中存在一种优势类群,占总克隆的23%。16S rDNA测序结果表明:北戴河近岸沉积物中的细菌在分类方面主要属于α-和γ-变形杆菌亚门。

文蛤浮游期发病幼虫细菌群落分析和致病菌的分离鉴定

为研究文蛤育苗过程中幼虫病害及其主要致病菌,实验通过构建细菌16S rDNA克隆文库、病原菌分离纯化、人工感染和药敏实验等方法对育苗场发病的浮游期文蛤壳顶幼虫样品进行了系统分析。结果显示,发病的文蛤壳顶幼虫细菌群落多样性低,地中海弧菌占比高达75%以上,推断其可能为引发此次幼虫发病的主要致病菌。从发病幼虫的匀浆组织中分离获得该优势菌株,测序及系统发育鉴定为地中海弧菌。人工感染实验确定了其致病性,菌株US2-01在1.0×10^(6) CFU/mL的菌液浓度下浸泡感染文蛤浮游幼虫,96 h累计死亡率为84%。药敏实验表明,地中海弧菌菌株US2-01在12种抗生素的测试中对常用的青霉素、氨苄西林、红霉素等抗生素具有一定的耐药性,对四环素和多西环素中度敏感,对头孢他啶、庆大霉素、卡那霉素等其余7种抗生素呈现高度敏感。本研究首次报道了地中海弧菌为文蛤浮游期幼虫致病的一种潜在病原,研究结果可为文蛤幼虫疾病研究及贝类苗种培育过程中的病害防控提供科学依据。