梨火疫病菌的RPA快速检测技术的研发

梨火疫病菌Erwinia amylovora是我国进境植物检疫性有害生物,主要侵染梨、苹果、山楂、海棠等多种蔷薇科植物引起梨火疫病。该病自1780年在美国被发现以来,已经传播到世界多个国家,对我国的果树生产也构成一定的威胁。严格植物检疫是全球防控梨火疫病菌扩散危害的重要方法之一,目前我国植物检疫部门主要从实验室分离鉴定、分子检测和田间症状识别及快速检测方面开展工作。本研究基于重组酶聚合酶扩增(RPA)技术和E.amylovora 16S-23S ITS区间的保守序列设计的引物和探针,建立了实时荧光RPA和侧流层析试纸条RPA两种检测方法。经测试,在39℃条件下,这两种检测方法都具有良好的特异性,分别能在20 min和10 min内完成扩增。实时荧光RPA对E.amylovora菌株DNA的检测阈值为1.38×10^(-2)ng/μL;侧流层析试纸条RPA对E.amylovora菌悬液和DNA的检测阈值分别为10^(4)cfu/mL和1.38×10^(-3)ng/μL。侧流层析试纸条RPA体系因反应快速、读取结果方便、不需要复杂仪器操作可以满足现场快速检测的需求。

基于RPA技术的优惠商品信息实时收集平台研究

随着电子商务的蓬勃发展和各种购物平台的涌现,商品信息的数量和种类呈现爆炸式增长,给用户带来了巨大的信息搜索压力。面对海量的商品数据,用户在网购时获取商品信息的效率不高,并在比对商品价格时耗费大量的精力,为此文章提出一种基于RPA技术的优惠商品信息实时收集平台,采用RPA机器人流程自动化技术实时抓取各个购物平台的商品信息(价格、优惠信息和用户评价等),并进行信息整合和数据可视化,从而为用户提供更多的选择和参考,帮助他们做出明智的购物决策,极大地提升了用户的购物体验和满足感。

非洲猪瘟病毒MGF-505R基因缺失株双重荧光RPA检测方法的建立及应用

旨在建立一种快速现场筛查非洲猪瘟病毒(ASFV)基因缺失株的方法,以便鉴别我国复杂的ASFV感染情况。通过分析国内ASFV流行态势,选择MGF-505R基因及B646L基因,设计特异性引物及exo探针,对其进行敏感性、特异性分析,并进行临床应用。利用双重-重组酶聚合酶扩增(RPA)方法检测ASFV MGF-505R及B646L基因,结果显示:检测时间在15 min内,最低检测限均为10 copies/反应,且与猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪圆环病毒2型等均无交叉反应;利用所建立方法对266份临床样品进行检测,结果与世界动物卫生组织(WOAH)推荐荧光PCR检测方法的符合率为100%。建立的ASFV MGF-505R基因缺失株的荧光RPA检测方法适配可移动式荧光RPA检测仪,具有快速、灵敏度高、特异性强的优点,适用于ASFV现场快速临床检测,为非洲猪瘟疫情防控提供一种新的筛查手段。

食品中蜡样芽胞杆菌实时荧光RPA检测方法的建立与应用

为实现简便快速地检测蜡样芽胞杆菌(Bacillus cereus),根据Gen Bank中蜡样芽胞杆菌16 S RNA序列设计特异性引物和exo探针,建立了一种实时荧光重组酶聚合酶扩增方法,在39℃恒温下仅需20 min即可完成检测。该方法特异性扩增蜡样芽胞杆菌16 S RNA基因片段,对其他芽胞杆菌和非芽胞杆菌无扩增;以蜡样芽胞杆菌基因组DNA作为模板,该方法的检测灵敏度为1.0×10-3ng/μL,同已发表的real-time PCR方法一致。人工污染实验表明,当大米饭中蜡样芽胞杆菌污染量≥1.5×104CFU/g时,即可通过real-time RPA方法检出,所需时间仅为6~13min;而当污染量≥1.5×105CFU/g时,才能通过real-time PCR方法检出,所需时间至少为30 min(Ct值为20~31)。

非洲猪瘟病毒实时荧光RPA快速检测方法的建立

非洲猪瘟是一种跨境动物疫病,对世界养猪业危害严重。目前,该病的流行范围越来越广。为防止该病传入我国,当前急需建立快速、简便、可靠的检测方法。本研究通过分析非洲猪瘟病毒B646L基因保守区域,设计并合成了特异性引物和exo探针,建立了检测非洲猪瘟病毒的实时荧光RPA方法。利用该方法可在20 min内完成检测过程,最低可检测到16拷贝/反应;与猪的其他常见病原核酸无交叉反应;与荧光PCR方法具有相似的灵敏度和特异性;利用该方法对100份国内临床样品进行检测,结果均为阴性。本研究所建立的非洲猪瘟病毒实时荧光RPA检测方法具有简单、快速、敏感性高、特异性强的优点,在临床鉴别诊断、检验检疫和病原监测等方面具有广泛的应用价值。

口蹄疫病毒实时荧光RT-RPA快速检测方法的建立

为建立一种简单、快速、特异的口蹄疫病毒(FMDV)分子检测方法,本研究基于FMDV的3D基因,设计特异性引物和exo探针,建立了用于FMDV快速检测的等温实时荧光反转录重组酶聚合酶(Real-time RT-RPA)方法。该方法采用便携式等温扩增仪-Genie Ⅲ实时监测扩增结果,40℃20 min即可完成检测。结果显示,FMDV RT-RPA方法能够特异性扩增FMDV 3D基因,而对水泡性口炎病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪瘟病毒、脑心肌炎病毒等均无扩增;以体外转录的FMDV 3D RNA作为模板,该方法在95%置信区间检出下限为1.0×10~2拷贝/μL,组内和组间变异系数均小于1%;使用43份含有灭活FMDV的模拟临床样品分析显示,RT-RPA对FMDV的检出率为34.9%(15/43),略低于荧光定量RT-PCR的检出率(39.5%,17/43),而两种方法的符合率为95.3%(41/43)。RT-RPA能够在6 min～16 min内完成检测,而实时荧光RT-PCR则需要30 min～51 min。本研究所建立的实时荧光RT-RPA方法反应快速,特异性强,灵敏性高,操作简单,结合便携式具有荧光检测功能的等温扩增仪Genie Ⅲ,组建了FMDV快速检测平台,在基层兽医部门,尤其在野外及疫情现场的FMDV检测中具有极大的应用潜力,为设备仪器有限的实验室和田间对FMDV的快速检测提供了一种有效的方法,对于条件有限地区FMD的防控具有重要意义。

西瓜细菌性果斑病菌现场快速双模荧光RPA检测方法的建立

瓜类细菌性果斑病菌(bacrerial fruit of blotch,BFB)是中国检疫性病害,其传播非常迅猛,且目前没有商品化抗病品种。为建立西瓜果斑病菌现场快速荧光重组酶聚合酶扩增(recombinase polymerase amplification,RPA)检测方法,针对细菌性果斑病菌特异性序列设计并筛选出了RPA最佳的引物和探针组合,利用两种模式[实时荧光监测RPA(real time RPA,RT-RPA)和终端荧光可视化检测RPA(end point RPA,EP-RPA)]对RPA的结果进行分析,并与实时荧光定量PCR(qRT-PCR)结果进行对比。结果显示,建立的细菌性果斑病菌双模荧光RPA检测方法特异性强,且其对病原物的检测灵敏度与qRT-PCR的灵敏度相当。在实际样品检测中,RT-RPA、EP-RPA和RT-PCR的检测结果一致性为100%。在检测时间上,EP-RPA的检测时间为20 min,RT-RPA平均检测时间约为5 min,qRT-PCR的平均检测时间约为44 min;RPA的检测速度最快,而且不依赖大型的仪器,方便快捷,适用于现场检测。该恒温快速检测方法的建立为植物病害的现场检测提供了新的技术支持。

非洲猪瘟病毒实时荧光重组酶聚合酶扩增技术(RPA)检测方法的建立

非洲猪瘟(African swine fever,ASF)是由非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)感染引起的一种急性、热性、高度接触性传染病,给养猪业造成了严重的经济损失。本研究利用重组酶聚合酶扩增技术(RPA),针对ASFVB646L(p72)基因设计了3组引物和探针,并进行筛选、反应条件优化、灵敏性、特异性和重复性试验,建立了实时荧光RPA方法。结果显示,该方法在39℃、20 min内即可检测10个拷贝的DNA分子,且与猪瘟病毒、猪圆环病毒2型、猪细小病毒、猪伪狂犬病病毒均无交叉反应,检测5.5×106至5.5×100拷贝/μL共7个稀释度样品在各时间点的荧光强度,变异系数范围在0.38%~28.30%。该等温、快速扩增方法可用于ASFV的定性检测,为中国ASFV感染的早期诊断提供技术支持,对疫情暴发后相应控制方案的制定具有重要意义。

致病性小肠结肠炎耶尔森氏菌实时荧光RPA检测方法的建立

本研究建立了致病性小肠结肠炎耶尔森氏菌的实时荧光重组酶聚合酶扩增(real-timeRecombinasePolymerase Amplification,real-time RPA)检测方法。根据致病性小肠结肠炎耶尔森氏菌黏附侵袭位点ail致病基因序列设计特异性引物和exo探针,在37℃恒温下20 min内即可完成检测,方法特异性高,对目的DNA的检测限为0.1 ng/μL。在稳定性实验中,对10 ng/μL、0.1ng/μL、0.01 ng/μL、0.001 ng/μL的目的DNA各进行8个平行的测试,0.1 ng/μL及以上浓度的DNA均可稳定检出;当DNA为0.1 ng/μL时,8个平行的阈值时间和最大荧光值的相对标准偏差(relative standard deviation,RSD)最低且≤7.06%。致病性小肠结肠炎耶尔森氏菌在奶粉和牛肉的人工污染样品中初始污染量为3 CFU/25 g时,培养20 h后,可用本方法检出。对20份各种类实际样品进行检测,本方法与国标方法结果一致。本方法对致病性小肠结肠炎耶尔森氏菌的常温现场快速定性检测具有重要意义。

非洲猪瘟实时荧光RPA诊断方法建立及应用

【目的】非洲猪瘟(African swine fever,ASF)自2018年首次暴发于我国沈阳后,迅速扩散至全国,对我国养猪业造成了沉重打击。研究针对其病原非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)建立一种快速核酸检测技术,为及时发现、准确处理ASF疫情提供一种快速诊断方法。【方法】针对ASFV保守的B646L(p72)基因,设计并筛选合适的引物、探针组合,利用基于重组酶-聚合酶扩增(recombinase polymerase amplification,RPA)的实时荧光RPA方法,对反应体系、反应条件、样品处理步骤等进行优化;利用质控品,对检测方法的特异性和灵敏度进行评价。对1 009份临床样品进行检测,并利用OIE推荐的实时荧光定量PCR方法(qPCR)和病毒分离,进一步验证该方法的检测结果。【结果】筛选得到一套合适的引物、探针,建立了针对ASFV p72基因的实时荧光RPA检测方法,优化后的反应体系总体积为25μL,在实时荧光定量PCR仪器上,最适反应条件为39℃10 s,39℃20 s,40个循环,扩增反应时间约20 min;室温裂解法可取代传统核酸提取方法作为本检测的样品处理方法;使用优化后的条件,可在30 min内实现样品处理、核酸扩增和结果判定的整个过程,特异性评价结果显示本方法对猪细小病毒(PPV)、伪狂犬病毒(PRV)、圆环病毒1型/2型(PCV1/2)、猪瘟病毒(CSFV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)样品扩增结果均为阴性;敏感性评价结果显示本方法对基因I型、II型、IX型ASFV的模拟样品均可检出,对II型ASFV阳性模拟血样品可检测至10拷贝/μL,对已知阳性临床组织样品可检至1:103.0稀释度,与OIE推荐的实时荧光定量PCR(qPCR)方法的检测灵敏度一致。通过对1 009份临床样品进行检测,实时荧光RPA诊断方法检出17份阳性,其结果与qPCR方法完全一致;病毒分离获得17份阳性培养物。【结论】建立的实时荧光RPA核酸检测方法操作简便,耗时短,具有较高的灵敏度和特异性,为临床提供了一种新型、简单、特异、快速诊断非洲猪瘟的方法。

食品中检测志贺氏菌的实时荧光RPA方法的建立与应用

本研究旨在建立志贺氏菌的实时荧光重组酶聚合酶扩增技术real-time RPA检测方法。根据志贺氏菌侵袭性质粒抗原H基因(ipaH)的保守序列设计引物及exo探针,利用荧光检测设备实时监控反应进程,在39℃恒温下20 min即可完成检测。该方法特异性扩增志贺氏菌,对非志贺氏菌无扩增;以志贺氏菌基因组DNA为模板,该方法的检测灵敏度为3.5×10^-3 ng/μL,同已发表的real-time PCR方法一致。人工污染试验表明,当鸡肉、西兰花样品污染量为9 CFU/25g,增菌时间为8 h时,即可通过real-time RPA方法检出志贺氏菌。在人工污染试验中,real-time RPA和real-time PCR检测结果一致,而前者仅需7~12 min,后者则至少需要35 min(Ct值为27~34之间)。本研究建立的志贺氏菌real-time RPA方法特异性强,灵敏性高,反应时间短,操作方便,为食源性致病菌检测提供了一个新的技术平台。

出血性大肠埃希菌O157:H7可视化和实时荧光RPA检测方法的比较

目的以检测出血性大肠埃希菌(EHEC)O157:H7为目的,基于重组酶聚合酶扩增(RPA)技术,分别建立可视化RPA检测方法和实时荧光RPA检测方法。方法根据出血性大肠埃希菌O157:H7的rfbE基因设计引物和探针,进行特异性、灵敏度检测,建立实时荧光RPA检测方法。结合SYBR Green I在核酸反应中的颜色变化特征,设计可视化RPA检测方法。结果建立的实时荧光RPA检测方法和可视化RPA检测方法,分别在35℃时反应不超过25 min即可检测EHEC O157:H7。设计的引物和探针仅对EHEC O157:H7出现特异性结果。两种检测方法的检测限低于10-5 ng/μL。结论EHEC O157:H7的可视化RPA检测方法和实时荧光RPA检测方法操作简便,且特异性强、敏感性高,可为EHEC O157:H7的现场快速检测和实验室检测提供新方法。

菊花B病毒和番茄不孕病毒RT-RPA双重荧光实时检测体系的构建与性能评价

菊花B病毒(Chrysanthemum virus B, CVB)和番茄不孕病毒(Tomato aspermy virus, TAV)是危害菊花的2种主要优势病毒。为构建一种同步检测CVB和TAV逆转录重组酶聚合酶恒温核酸扩增(Reverse transcriptionrecombinase polymerase amplification, RT-RPA)双重荧光实时检测方法,本研究以CVB和TAV编码外壳蛋白(coat protein, CP)基因保守区域作为靶标设计RIA引物和探针,CVB和TAV探针的5’端分别标记FAM和VIC荧光素,通过对商业化的RT-RPA试剂筛选,引物探针的组合筛选,扩增体系的优化和扩增条件的摸索试验,构建了一种可同时用于CVB和TAV检测的RT-RPA双重荧光实时检测方法。并对该体系进行优化,优化后RT-RPA双重荧光扩增体系中CVB和TAV的最优引物浓度为400 nmol/L,最优探针浓度分别为100 nmol/L和120 nmol/L;最适反应温度为39℃,最适反应时间为15 min。在此扩增体系和条件下,对CVB和TAV的检测敏感性均为1拷贝/μL;对烟草花叶病毒、黄瓜花叶病毒、马铃薯Y病毒、马铃薯X病毒、菊花矮化类病毒和褪绿斑驳类病毒核酸检测结果为阴性,对菊花B病毒、番茄不孕病毒核酸检测结果为阳性;对1.0×10^(4)拷贝/μL和10拷贝/μL的高、低两种浓度的质粒平行检测10次,检测荧光出现阳性扩增拐点所需的时间T变异系数均小于5%,重复性好。采用RTRPA和RT-qPCR方法同步对实验室留存的有症状的100株菊花进行核酸提取并检测,检出6例CVB病毒株和4例TAV病毒株,总符合率100%。因此,本研究建立了一种能同时检测CVB和TAV的快速、灵敏的RT-RPA双重荧光实时检测方法。

斑点叉尾鮰、半滑舌鳎和低眼无齿巨鲶实时荧光RPA快速检测方法研究

斑点叉尾鮰、半滑舌鳎和低眼无齿巨鲶在肉质和产品形态上十分相似,相互难以区分,市场上商品名称混乱,进出口货物中标签和实物不符等现象屡有发生。本实验根据3种鱼的保守基因序列,设计并筛选出3对特异性重组酶聚合酶扩增(recombinase polymerase amplification,RPA)的引物和探针,建立了基于实时荧光RPA技术的斑点叉尾鮰、半滑舌鳎和低眼无齿巨鲶的物种成分快速检测方法,并对方法进行特异性和灵敏性分析。结果表明,建立的实时荧光RPA检测方法具有较好的特异性和灵敏性,且简单、快速,整个扩增时间仅需20 min,为相关产品的物种成分鉴定提供了快捷、准确的检测依据。

转基因玉米Bt11品系特异性荧光RPA检测

重组酶聚合酶介导的等温扩增(recombinase polymerase amplification,RPA)作为一种新型等温扩增技术,具有反应时间短、灵敏度高、特异性强等特点,在转基因检测领域得到了广泛关注。本研究针对转基因玉米Bt11外源插入链接区域设计筛选了特异性引物和探针,建立了快速准确的荧光RPA检测方法,在39℃条件下,20 min内完成扩增并且能够实时监测,可以准确有效地检测到50个拷贝的靶标片段。而且,对于背景复杂的植物基因组DNA能够得到准确的扩增曲线。本研究不仅可以满足常规实验室检测,通过RPA便携式仪器,还可以满足转基因植物现场检测,具有广阔的应用前景。

胞内劳森菌实时荧光RPA方法的建立及初步应用

本研究基于胞内劳森菌(Lawsonia intracellularis)16S rRNA基因保守序列,设计特异性引物和exo探针,建立了一种能够快速检测胞内劳森菌的实时荧光重组酶聚合酶扩增方法(real-time RPA)。进一步对real-time RPA方法的特异性和灵敏性进行了分析,对临床疑似病例的猪粪便和回肠样品进行了检测,并同real-time LAMP和real-time PCR检测结果进行了比较。结果表明,该方法能够在39℃等温条件下,20 min内实现对胞内劳森菌的有效检测;所建立的方法特异性强,仅对L.intracellularis产生特异性扩增,对其他常见引起猪腹泻的病原均无扩增;灵敏性高,以L.intracellularis基因组DNA为模板,检出限为1.4×10^2fg/μL;在60份临床样品中,该方法对L.intracellularis的检出率为66.7%(40/60),同real-time LAMP和real-time PCR方法一致。本研究所建立的real-time RPA方法反应快速、特异性强、灵敏性高,可用于猪场胞内劳森菌的快速检测。

3种病原菌多重IMS-荧光RPA检测体系的建立及初步应用

建立一种同时检测沙门氏菌、大肠杆菌O157:H7和布氏杆菌的快速、灵敏、高通量的检测方法。利用特异性免疫磁珠,在37℃条件下从200 mL样液体系中循环捕获目标致病菌。磁珠液提取DNA后,对3种病原菌进行多重IMS-荧光RPA检测。结果表明:针对沙门氏菌、大肠杆菌O157:H7和布氏杆菌的检测限分别达到3.0、4.5和8.7 CFU/mL。使用新建多重IMS-荧光RPA方法对人工感染60份皮张、毛皮纺织品DNA样本进行扩增,结果显示与预期结果一致;对60份公共场所收集的皮张、毛皮、纺织品DNA样本进行扩增,结果显示有2个样本沙门氏菌阳性、1个样本大肠杆菌O157:H7阳性,3份阳性样品送测序,测序结果与GenBank检索沙门氏菌、大肠杆菌O157:H7 DNA序列一致。得出结论:建立的多重IMS-荧光RPA检测体系灵敏度、特异性、准确度符合要求,能够在2 h内完成对3种病原菌检测,可以作为快速应对此三类病原菌安全突发事件的检测手段。

单核细胞增生李斯特氏菌实时荧光RPA检测方法的建立及应用

本研究旨在建立一种快速检测单核细胞增生李斯特氏菌(Listeria monocytogenes,LM)的实时荧光重组酶聚合酶扩增(real-time RPA)方法。基于LMhly A基因保守序列,设计合成特异性RPA引物和exo探针,所建立的LM real-time RPA方法能够在37℃等温条件下20 min内完成扩增。该方法仅对LM基因组DNA为阳性扩增,对其它20种致病菌基因组DNA的扩增均为阴性;以LM纯培养菌液的基因组DNA进行10倍列梯度稀释,并以之作为模板,其灵敏性可达到5×10-1 pg,与实验室已建立的real-time PCR方法一致。人工污染实验中,对于LM接菌量为3 CFU/25 g的羊肉和生菜样品,增菌14 h即可通过建立的real-time RPA方法检出,与传统培养方法和real-time PCR检测结果均一致,但是前者所需时间明显少于后者。本文建立的LM real-time RPA方法特异性强,灵敏性高,操作简单,反应迅速,并能够摆脱对价格昂贵的荧光PCR仪和专业实验室的需求,可应用于食品突发事件中LM的现场快速检测,对保障我国食品安全具有重要意义。

实时荧光重组酶聚合酶扩增快速检测临床常见曲霉菌方法的建立

目的:针对曲霉菌属转录间隔区ITS1设计引物、探针,利用实时荧光重组酶聚合酶扩增(Real-time RPA)技术建立一种快速、准确、经济的临床常见曲霉菌检测鉴定方法。方法:利用建立的实时荧光重组酶聚合酶扩增体系对标准菌株及临床标本提取的DNA进行扩增,验证该方法的性能。结果:本研究针对曲霉菌属转录间隔区ITS1设计引物、探针利用RPA试剂盒(荧光型)建立了Real-time RPA扩增体系,在15分钟内即可检测出临床常见的四种曲霉菌;特异性试验结果显示反应体系只对烟曲霉、黄曲霉、土曲霉、黑曲霉四种曲霉呈现出明显的扩增曲线,而其它细菌和真菌均无扩增曲线。灵敏性试验显示最低检出限为10-3 ng/μL。临床验证试验的12份曲霉菌均有较高的扩增效应。结论:本研究建立的Real-time RPA方法能快速、特异、灵敏地检出烟曲霉、黄曲霉、土曲霉、黑曲霉等临床常见曲霉菌,为曲霉菌的快速、现场检测提供了一种新的思路。

绵羊痘病毒和山羊痘病毒实时荧光重组酶聚合酶检测方法的建立

为建立一种快速、敏感鉴别诊断绵羊痘病毒(SPPV)和山羊痘病毒(G TPV)的方法,本研究根据SPPV和GTPV基因组保守区,分别设计特异性引物和探针,建立了SPPV和GTPV实时荧光RPA (real-time fluorescent recombinase polymerase amplification)检测方法。结果显示,该方法仅对SPPV和GTPV的靶基因扩增呈阳性,而对牛结节性皮肤病病毒(LSDV)、传染性脓疱病毒(O RFV)、蓝舌病病毒(BTV)、小反刍兽疫病毒(PPRV)、水疱性口炎病毒(VSV)、A型口蹄疫病毒(FM DV type A)、O型口蹄疫病毒(FMDV type O)、亚洲1型口蹄疫病毒(FMDV Asia 1)等相关病毒检测结果均为阴性,特异性良好;对SPPV和GTPV检测的灵敏度分别为4.72×10~2copies/μL和4.35×10~2 copies/μL;利用该方法对临床样品进行检测,与OIE推荐的普通PCR检测结果符合率为100%。结果表明,建立的SPPV和GTPV实时荧光RPA方法灵敏、快速、特异性强,为SPPV和GTPV感染的早期诊断提供了技术支持,适用于SPPV和GTPV的检疫、疫情监测及流行病学调查,对疫情暴发后相应控制方案的制定具有重要意义。