脱水过程中无核白葡萄转录组测序及膜脂降解代谢中关键基因的筛选

该研究以吐鲁番地区无核白葡萄为试验材料,在25℃常温和30℃热风干燥后,取失水25%、50%时褐变和未褐变的样品。利用转录组测序技术筛选出膜脂降解代谢相关的关键基因,并利用实时荧光定量PCR技术对其进行验证,研究结果显示,转录组测序共获得了11.63亿的clean data,当无核白失水50%时未褐变与褐变的相比,在快速脱水组筛选出718个差异表达基因,慢速脱水组2259个。将上述基因进行GO功能富集和KEGG富集分析后,筛选出43个膜脂代谢相关的差异基因,归类于5种代谢途径。从已获得的差异基因中最终筛选出乙醛脱氢酶7B4(Aldehyde Dehydrogenase7B4,ALDH7B4)、双半乳糖甘油二酯合成酶1(Digalactose Diglycerol Synthetase1,DGD1)、脂氧合酶(Lipoxygenase,LOX)、磷脂磷酸水解酶2(Lipid Phosphate Phosphatase2,LPP2)、二酰基甘油激酶5(Diacylglycerol Kinase5,DGK5)、非特异性磷脂酶C4(Non-specific Phospholipase C4,NPC4)、磷脂酶Dα1(Phospholipase Dα1,PLDα1)7个膜脂代谢相关的关键基因,经qRT-PCR验证,基因表达趋势与转录组测序结果基本一致。结果表明,膜脂降解代谢相关基因表达量变化对无核白脱水褐变有一定影响。

荧光实时定量PCR法检测流感病毒核酸的质控结果分析

目的分析浅析荧光实时定量PCR法检测流感病毒核酸的质控结果。方法在2021年5月至2022年11月期间,120例流感病毒感染样本进行研究。对这些样本的流感病毒RNA进行了核酸抽提,并利用PCR实时荧光定量技术进行检测以评估其效果。结果运用该技术检测到乙型流感病毒44例,甲1型40例,以及甲3型36例。所有检测结果均符合分子生物学操作的质控标准,合格率达到100.0%。结论实时核酸PCR技术在临床流感病毒检测中被广泛应用。PCR实时荧光定量检测法在流感病毒核酸检测中的表现精确且迅速,适宜作为应对突发公共卫生事件的首选检测手段。

一种新颖简便的荧光实时RT-PCR相对定量方法的建立

为建立一种新颖、简便的荧光实时RT-PCR相对定量方法,根据实时定量标准曲线,推导出相对定量基因表达的公式.公式显示相对表达指数只与CT值和标准曲线的斜率相关.构建标准曲线的标准品需要通过克隆和体外转录获得,实验过程繁琐.当人为成比例增减标准品各个稀释度的具体拷贝数时,标准曲线的斜率并不改变,说明标准曲线斜率与标准品的具体拷贝数无关.因此,新的相对定量方法可以用任何一个待测样品的总RNA(或cDNA),经系列稀释后作为标准品,来构建相对定量标准曲线,获得斜率.与绝对定量法比较,新方法获得了基本相同的斜率和非常一致的定量结果(差异小于4%),而传统的2-#$CT法却表现出较大的定量误差.这些结果表明,新的相对定量方法是一种简便、准确和高效的定量基因表达的方法.

实时荧光定量PCR技术及其在水产上的应用

实时荧光定量PCR技术是在PCR技术基础上结合荧光染料发展起来的一种核酸定量技术,能快速、灵敏,并有效地对核酸进行定量检测,已被广泛应用于生命科学的各领域。笔者就实时荧光定量PCR的检测原理、荧光染料,管家基因及其在水产上的应用作一阐述。

实时PCR技术在植物研究上的应用

实时PCR是在常规PCR基础上运用荧光共振能量转移现象,加入荧光标记探针,巧妙地把核酸扩增、杂交、光谱分析和实时检测技术结合在一起的一项新技术,具有快速、灵敏、特异性强、定量准确等特点,广泛应用于医学、检验检疫、军事、农业、基础研究等领域。着重就实时PCR技术的特性及在植物上的应用进行了讨论,并与目前常用的相关技术进行了比较。

羊口疮病毒SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR的建立及应用

为羊口疮（Orf）的分子流行病学调查、早期快速诊断及细胞培养物的检测等提供参考，根据GenBank 发表的羊口疮病毒（OrfV）B2L 基因序列设计合成1对引物，以 pMD18-T-B2L 重组质粒为阳性标准品，建立了检测 OrfV 核酸的 SYBR Green Ⅰ实时荧光定量 PCR 方法，并进行了临床应用。结果表明：建立的 SYBR Green Ⅰ实时荧光定量 PCR 的线性关系良好，标准曲线的相关系数达到-1；最低检测限为1．0x10^3 copies／μL，比常规 PCR 方法高100倍，与山羊痘和口蹄疫疫苗毒均不发生交叉反应；组内变异系数为1．061％-2．873％，组间变异系数为0．397％-3．829％。用该方法检测5例 OrfV 感染临床病例和8份不同代次的 OrfV 细胞培养物，阳性率均为100％。SYBR Green Ⅰ实时荧光定量 PCR 方法灵敏度高、特异性强、重复性好，可以用于 OrfV 的病原检测及定量分析。

放牧条件下山羊激素敏感性甘油三酯脂肪酶基因的表达

为探明放牧条件下山羊组织中激素敏感性甘油三酯脂肪酶(HSL)mRNA的分布规律,筛选出HSL mRNA表达的最主要组织,为进一步研究山羊肉质与HSL基因的关系奠定基础,使用实时荧光定量RT-PCR法检测在雷公山山区放牧的黔东南小香羊、贵州白山羊、贵州黑山羊、黔北麻羊和南江黄羊各4只山羊的肝、肾、心、肺、背最长肌、半膜肌、皮下脂肪组织中HSL mRNA的表达水平。结果表明:5种放牧山羊HSL基因的组织表达谱各有特点,皮下脂肪和心脏中HSL mRNA水平较高,肺、肾、背最长肌和半膜肌次之,肝内最低。在放牧条件下5种山羊皮下脂肪和心脏中HSL mRNA表达丰度较大,是检测mRNA变化的最适靶组织。

腹泻患者肠道菌群数量变化及ERIC-PCR指纹图谱分析

目的了解粪检有白细胞的腹泻患者与健康者肠道菌群变化及指纹图谱差异。方法提取解放军第252医院临床门诊30名健康成人和30例腹泻成人的粪便总DNA为模板,分为对照组和腹泻组。荧光定量法测定肠道内双歧杆菌、乳酸杆菌、大肠埃希菌、肠球菌的菌群数量,ERIC-PCR指纹图谱法检查各组肠道菌群组成多样性差异。结果两组肠道菌群数量:对照组粪便中双歧杆菌为(8.85±0.57)拷贝/g,乳酸杆菌为(8.36±0.45)拷贝/g;腹泻组粪便中双歧杆菌为(8.28±0.68)拷贝/g,乳酸杆菌为(7.79±0.39)拷贝/g;与对照组比较,腹泻组中该两种细菌数量明显减少(P<0.05)。大肠埃希菌和肠球菌数量在两组之间差异无统计学意义(P>0.05)。腹泻患者肠道菌群ERIC-PCR指纹图谱条带明显减少。结论腹泻患者的肠道菌群结构发生了改变,菌群数量明显减少。

腺病毒载体介导gag基因在小鼠体内的生物分布

目的研究腺病毒载体介导gag基因在C57BL/6小鼠体内的生物分布。方法经C57BL/6小鼠左后肢股四头肌部位单次注射0.05ml Ad-gag,于给药后不同时间摘取组织脏器,采用Taqman探针实时荧光定量PCR法,以小鼠β-actin基因作为内参,外标绝对定量法分别定量样本中gag和β-actin基因拷贝数。计算每104个小鼠细胞中gag基因的拷贝数,比较各脏器的分布数量。结果外标绝对定量法精密性良好。gag基因主要分布在注射位点、淋巴结、脾脏和肝脏,其他脏器没有分布。给药后3d,gag基因在靶器官分布达峰值,注射位点分布最多,伴随时间延长逐渐减少。结论Ad-gag疫苗在体内不会蓄积并产生全身的特别是生殖系统毒性。本研究可作为重要的安全性试验数据,支持药物在临床应用。

以梅花鹿P21基因为模板比较相对和绝对荧光定量PCR的准确性

实时荧光定量PCR是具有高度灵敏度和特异性的核酸分析技术,以SYBRGreen染料法为基础的相对定量和绝对定量检测方法,由于操作简单、成本较低而倍受青睐。本试验以梅花鹿P21基因为待检测基因,以β-actin作为内参基因,对不同浓度稀释的模板进行相对实时荧光定量PCR检测,然后分别对P21基因和β-actin基因进行绝对定量检测。结果表明,绝对定量的结果比相对定量结果更准确可靠,相对定量在模板256倍稀释后出现较大偏差,在模板浓度较低(低于1 000拷贝)时2种方法都会出现较大误差。因此,建议尽量用绝对定量检测目的基因,当模板浓度太低时建议对样品进行浓缩处理。

实时荧光定量PCR检测HBV-DNA测量不确定度的评定

目的探讨实验室实时荧光定量PCR检测HBV-DNA测量不确定度的评定方法,并对其临床应用进行分析评价。方法依据CNAS-TRL-001:2012《医学实验室——测量不确定度的评定与表达》,以室内质量控制评定实验室测量复现性,以有证参考物质(CRM)评定偏倚,以测量复现性和偏倚评定测量不确定度。结果高、中、低值扩展不确定度(k=2)分别为0.99、1.14、0.94(对数值),相对扩展不确定度(k=2)分别为9.15%、24.7%、31.1%。结论以复现性和偏倚评定HBV-DNA测量不确定度方法有效可行,适合实验室测量不确定度的评定,适合实验室之间测量不确定度的比较分析。

实时荧光定量PCR在HLA-B~*5801等位基因检测中的性能评价

目的:评价采用实时荧光定量聚合酶链反应(PCR)方法检测人类白细胞抗原B位点5801(HLA-B*5801)等位基因的重复性、准确性和最低检出限。方法:选取HLA-B*5801阳性和阴性样本各2例,每一样本每批内测定5次,连续测定2 d,共重复测定10次,评价方法的重复性。收集20例已知阳性和阴性样本,实时荧光定量PCR方法进行检测,同时与金标准DNA测序法的结果进行比对,评价方法的准确性。同时进一步选取其中1例阳性DNA样本进行梯度稀释后再行检测,评价方法的最低检出限。结果:4例样本重复性检测阳性和阴性符合率为100%;实时荧光定量PCR法与DNA测序法检测结果符合率为100%,收集的20例已知阳性和阴性样本中HLA-B*5801阳性8例,阴性12例;实时荧光定量PCR的最低检出限为2.5 ng/μl DNA。结论:实时荧光定量PCR可方便、快捷地检测HLA-B*5801等位基因,其准确度高,重复性好,适用于临床常规样本的检测。

实时荧光定量PCR快速检测百日咳鲍特菌方法学建立及评价

目的建立实时荧光定量PCR检测百日咳鲍特菌的方法。方法以百日咳鲍特菌的重复插入序列IS481为目的基因,设计探针和引物,以克隆的IS481基因片段为DNA模板,在荧光定量PCR仪上建立实时荧光定量PCR检测方法和标准曲线,并进行灵敏度、重复性、特异性实验。结果建立的定量标准曲线阈值循环数(Ct)与模板拷贝数呈良好线性关系(r=0.998);最低检测浓度为102 copies/μl;批内及批间变异系数均小于4%;对临床其他常见呼吸道病原体不出现特异性扩增曲线。结论实时荧光定量PCR法检测IS481基因可用于百日咳鲍特菌的快速检测,具有较好的灵敏度、特异性及重复性。

马铃薯脯氨酸转运体StProT3的序列结构及表达分析

依据马铃薯转录组数据,鉴定马铃薯脯氨酸转运体(Proline transporter,ProTs)在逆境中的作用。以马铃薯GS393(Solanum commersonii-LZ3.4-Wisconsin,United States)为材料,采用实时荧光定量PCR对StProT3基因在不同组织及激素、重金属、盐、干旱和低温处理下的表达模式进行分析。该基因CDS长度为1317 bp,编码438个氨基酸。序列比对显示与SlyProT3有96%的相似性,因而命名为StProT3(NCBI登陆号为MH027990.1)。StProT3基因在马铃薯根、茎、叶、匍匐茎以及块茎中均有表达,其中根中表达量最高;重金属(氯化汞、氯化镉、氯化铜、氯化铝)、干旱、盐渍、激素(IAA、GA3、6-BA)处理能诱导该基因表达,而低温和ABA处理则抑制该基因表达,这表明StProT3基因参与了马铃薯的激素信号传导以及非生物胁迫响应。

TaqMan实时荧光定量PCR技术在口腔微生物定量分析中的应用研究进展

实时荧光聚合酶链反应技术已逐渐应用于人类口腔微生物的定量分析,本文对TaqM an实时荧光PCR技术在牙龈卟啉单胞菌、口腔密螺旋体和致龋微生物检测方面的研究进展作一综述。

实时荧光定量PCR法检测乙肝病毒DNA的价值分析与研究

目的探讨选择实时荧光定量PCR法对乙肝病毒DNA实施检测的临床价值。方法 250例乙型肝炎患者作为此次实验对象,临床选择血清学标志物的方法实施疾病检测后最终有效确诊。对所有乙型肝炎患者临床均选择实时荧光定量PCR法实施疾病检测,对最终检测结果进行分析。结果乙型肝炎患者分别选择荧光PCR法以及血清学标志物方法实施疾病检测,最终获得的检测结果基本表现一致。临床选择实时荧光定量PCR法完成疾病检测后,最终获得的病毒DNA数据更为准确。实时荧光定量PCR法对大三阳临床最终检测阳性率达到了96%;对小三阳,临床最终检测阳性率达到了69%;而对Hbs Ag(-)、乙型肝炎表面抗体(Hbs Ab)(-)以及Hbe Ab(-)以及乙型肝炎E抗原(Hbe Ag)(-)最终检测阳性率只为2.21%。对于大三阳患者以及小三阳患者的血清PCR检测结果进行观察发现,均表现出较高的拷贝数。结论乙型肝炎患者临床选择实时荧光定量PCR法实施疾病检测,针对乙肝病毒以及相关数据完成检测后可以获得准确结果 ,从而证明对乙型肝炎患者在实施疾病检测的过程中,选择实时荧光定量PCR法以及乙肝病毒DNA方法均可以获得较为理想的效果,临床均可以广泛普及应用。

支气管哮喘患者与健康对照转录因子T-bet、GATA-3表达的比较

目的比较哮喘患者及健康对照外周血CD4^+T细胞转录因子T-bet、GATA-3表达水平。方法选取新疆医科大学第六附属医院门诊及住院哮喘患者100例;同期健康志愿者100例;获取的外周血标本中的CD4+T淋巴细胞,是采用免疫磁珠法分离提取获得;而T-bet、GATA-3转录因子m RNA表达水平,其检测用SYBR Green I实时荧光定量法。结果 T-bet基因m RNA表达含量在哮喘组中为(6.90±2.25),对照组中为(6.74±2.16)。与对照组相比,哮喘组表达含量较高,但差异无统计学意义(P>0.05)。GATA-3基因m RNA在哮喘中相对表达量为(4.22±2.03),健康对照组中相对表达量(3.15±2.22)。与对照组相比,哮喘组GATA-3m RNA明显较高,两组差异具有统计学意义(P<0.05)。结论支气管哮喘组Th2细胞转录因子GATA-3m RNA高表达,转录因子T-bet/GATA-3 m RNA的平衡破坏,进一步影响支气管哮喘的发生发展。

comE基因的表达水平与肺炎链球菌的转化率相关性研究

目的:探讨肺炎链球菌感受态形成关键基因comE的表达对肺炎链球菌转化的影响.方法:构建肺炎链球菌基因comE的缺陷菌株,将野生菌株与缺陷菌株分别进行自然转化和感受态刺激因子(CSP)诱导转化,记录不同时间段的转化率,并采用FQ-PCR技术检测其comE的mRNA表达水平.结果:comE基因缺陷菌株的自然转化和CSP诱导转化率都为0,且检测不到comE的mRNA表达.R6野生菌株的自然转化率在细菌密度A550 nm为0.3左右时最高,comEmRNA的表达水平与其转化率的相关系数为0.244.D39在不同浓度CSP的诱导下都能发生转化,但CSP浓度为100μg/L时的转化率高于10,1000μg/L两个诱导浓度.100μg/L CSP诱导10 min时comEmRNA的表达量较基础水平显著增高(P<0.05).10,1000μg/L CSP诱导时,其不同时间comEmRNA的表达量与其转化率相关性差.100μg/L CSP诱导时,其转化率与0,20 min时comEmRNA表达量的相关系数分别为0.9966和0.9984;与10 min时comEmRNA表达量的相关系数为0.7950.结论:不管是自然转化还是CSP诱导转化,comE的表达都是必需的,但其表达水平与细菌的自然转化率无显著相关性.CSP诱导转化的最佳浓度为100μg/L,此时的转化率与comEmRNA的基础表达量显著相关,而在10,1000μg/L的CSP诱导时不存在这种相关性.

飞行时间质谱与荧光定量法检测叶酸代谢基因多态性的比较

目的:评价基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(MALDI-TOF MS)技术用于叶酸代谢关键酶基因临床检测的潜力。方法:以在本院就诊不孕症患者的100份EDTA抗凝静脉全血为样本,应用MALDI-TOF MS检测体系检测叶酸代谢关键酶基因的单核苷酸多态性(SNP)位点,包括5,10-亚甲基四氢叶酸还原酶(MTHFR)基因2个多态性位点677 C>T和1298 A>C,以及甲硫氨酸合成酶还原酶(MTRR)基因1个多态性位点66 A>G。将检测结果与实时荧光定量聚合酶链式反应(RT-qPCR)检测MTHFR 677 C>T和1298 A>C的结果进行对比。结果:MALDI-TOF MS与RT-qPCR均检出677 C>T位点CC型21例,CT型43例,TT型36例;1298 A>C位点AA型78例,AC型20例,CC型2例,二者检测结果的符合率为100%;MALDI-TOF MS系统还同时检测MTRR 66 A>G位点AA型50例,AG型44例,GG型6例。结论:MALDI-TOF MS检测体系可应用于叶酸代谢关键酶基因多态性的检测,与RT-qPCR相比具有通量高、准确度高的特点。

免标准曲线定量PCR技术的探讨

目的实际应用发现,传统的定量PCR方法误差较大不能满足科学研究以及临床精确定量的需要,本文拟探讨如何选择分析使用的技术资料以降低分析误差以及分析判断误差的主要来源。方法使用PCR动力学模型模拟实时定量PCR仪器跟踪测定资料,使用不同扩增时期的荧光数值资料计算起始模板数、分析误差,并根据仪器的荧光信号测定误差随机对资料加入误差后,分析结果的误差与研究误差的分布。结果使用指数扩增期内后期的5个资料点分析,可以获得当前仪器误差水平下,相对误差最小的结果。使用的资料点一旦包含有一个线性扩增期资料,结果的误差即显著增加。该文亦给出了一般性最后一次指数扩增循环的判定方法。结论免标准曲线的定量PCR方法将成为今后定量PCR的主要技术手段。