猪伪狂犬病毒Real-time PCR检测方法的建立和弱毒疫苗病毒含量的检测

根据伪狂犬病毒的gB基因设计引物,将含gB基因的质粒作为标准品,绘制标准曲线,建立了伪狂犬病毒PRV的荧光定量PCR检测方法。该检测方法具有良好的重复性、敏感性和特异性,不与PCV2、PPV、CSFV、JEV和PRRSV发生反应。用该方法对不同滴度病毒液的基因拷贝数进行检测,发现病毒滴度和病毒拷贝数之间存在较好的相关性。采用该方法对7种商品化PRV弱毒疫苗进行病毒含量检测,结果显示不同商品化弱毒疫苗的病毒含量存在显著差异,与说明书标注的病毒含量基本一致。

氨纶干法纺丝状态参数的计算

根据氨纶的真实纤度和一些纺丝条件计算单个纺丝甬道的聚合物和溶剂流量,通过试验和对试验数据的分析获得热气流达到纺丝甬道上部时温度(T3)的计算公式,假设热交换在绝热条件下进行,计算纺丝甬道内流体的平衡温度(T4),从而计算出纺丝甬道内气流的平均速度。

gp64基因相应dsRNA对家蚕核型多角体病毒(BmNPV)增殖的抑制

【目的】研究gp64基因相对应的多个dsRNA对家蚕核型多角体病毒增殖的抑制效果。【方法】体外合成dsRNA,通过病毒滴度试验、实时定量RT-PCR法研究gp64基因的不同区域、不同长度与RNAi干扰效果的关系。【结果】供试的6个dsRNA的最大抑制效果相当(滴度TCID50的最大抑制差值为4.00左右);经RNAi的不同时间点的gp64mRNA表达水平均明显下调(P<0.01),其中48h的gp64mRNA的表达量约为对照的1/300。【结论】6个dsRNA均能有效地抑制病毒的基因表达和增殖;gp64ORF第1390～1499位点(G3-3)是RNAi的较佳靶位点。

温度通过影响Wolbachia滴度调控赤眼蜂生殖方式

【目的】揭示温度对宿主体内Wolbachia滴度及其调控宿主生殖作用的影响。【方法】以感染Wolbachia且营孤雌产雌生殖的食胚赤眼蜂Trichogramma embryophagum为对象,在22,25,28和31℃4个梯度温度下连续培养5代,观察生殖方式、性比等生物学特性;采用实时荧光定量PCR以Wolbachia特异基因——外膜蛋白基因(wsp)、二磷酸果糖醛缩酶基因(fbp A)和酰胺转移酶基因(gat B)为靶标对内生菌进行定量分析。【结果】22和25℃条件下连续培养5代,食胚赤眼蜂生殖方式均未发生改变(无雄蜂出现),且5代赤眼蜂群体Wolbachia滴度没有明显差异;28℃下,食胚赤眼蜂在F3代开始有雄蜂出现,至F5代雄蜂比例明显增多,且体内Wolbachia滴度在F2代开始下降,至F5代显著下降;31℃下,F2代即有雄蜂出现,至F5代已经恢复成产雄孤雌生殖,体内Wolbachia滴度也在F2代开始下降,F3代开始显著降低,到F5代Wolbachia滴度极小甚至检测不到。【结论】高温可改变营孤雌产雌生殖赤眼蜂的生殖方式及体内Wolbachia滴度,且随着处理代数的增加以及温度的升高作用显著,即高温对营孤雌产雌生殖赤眼蜂生殖方式改变程度与其体内Wolbachia滴度呈负相关。

腺病毒滴度不同测定方法比较

目的将目前测定腺病毒滴度常用的OD260法、荧光定量PCR法、绿色荧光蛋白标记法、壳蛋白免疫法、细胞病变(CPE)法进行比较研究,分析和讨论各种方法的优缺点。方法 4种重组腺病毒(Ad-G-AT2R-EGFP、Ad–CMV-EGFP、Ad-mif-shRNA-EGFP和Ad-CBA-GFP)扩增、纯化后,同时分别用OD260值法、荧光定量PCR法、绿色荧光蛋白标记法、壳蛋白免疫法及CPE法测定病毒滴度,并以壳蛋白免疫法测定结果作为标准,对各种方法所得结果进行比较研究。结果绿色荧光蛋白标记法、CPE法与壳蛋白免疫法同时测定4种腺病毒滴度,其结果无统计学差异(P>0.1)。荧光定量PCR法测定值明显高于壳蛋白免疫法(P<0.05),但与该法测定结果间存在良好的相关性(r=0.965),约为壳蛋白免疫法所测得结果的10倍。OD260法测得结果与壳蛋白免疫法测得结果间则无相关性。结论绿色荧光蛋白标记法与壳蛋白免疫法是测定腺病毒感染性滴度最为快速有效的方法,其结果客观可靠,能真实地反映病毒的实际感染力。荧光定量PCR法测定结果反映的是完整的病毒颗粒数,能够间接反映病毒的感染力,且该方法操作简单,耗时短,同样有较高的实用性。

应用实时荧光定量PCR测定AdEasy系统中重组腺病毒滴度(英文)

目的 :确立一种高效、简便的荧光实时定量PCR方法 ,对AdEasy系统中的重组腺病毒滴度进行测定。方法 :采用Stratagene公司的AdEasyTM载体系统在 2 93细胞中构建重组腺病毒 ,经 10倍梯度稀释的病毒母液用以提取基因组DNA及空斑测定。以 10倍梯度稀释的pAdEasy质粒作为标准模板进行实时PCR反应扩增六邻体基因片段 ,并绘制标准曲线。然后以上述的重组腺病毒DNA为模板 ,采用同样体系进行实时PCR反应 ,同时用琼脂糖空斑法测定病毒母液的滴度。结果 :成功构建了重组腺病毒并对其进行了空斑测定。运用标准模板进行的PCR反应显示该方法的线性范围为 10 1～ 10 8拷贝。病毒母液的DNA拷贝浓度(vg/ml)值 ,约为空斑滴度 (pfu/ml)值的 10倍。结论 :荧光实时定量PCR方法可在较大的线性范围内检测重组腺病毒滴度 ,较之空斑法更为准确地反映了重组腺病毒的实际数量。

定量PCR法在病毒滴度检测中的应用进展

定量PCR(quantitative PCR, qPCR)被广泛应用于mRNA表达、病原体检测和病毒滴定等领域, 具有快速、敏感、污染概率低和可重复的特点。此文主要对qPCR法检测各种病毒滴度的研究进展进行综述, 介绍qPCR在RNA病毒以及DNA病毒检测中的应用, 并与其他检测方法进行对比, 展现qPCR检测病毒滴度的应用前景。

肉食兽类细小病毒TaqMan-MGB荧光定量PCR方法的建立与应用

为建立检测肉食兽类细小病毒荧光定量PCR方法和探索细小病毒基因组拷贝数与病毒含量之间的相关性,在肉食兽类细小病毒VP2基因区分别设计了1对保守引物和1条TaqMan-MGB标记的水解探针,通过对貉细小病毒(RDPV)LN10-1株VP2基因上的长度为92bp的保守片段进行PCR扩增,构建标准重组质粒,由已知浓度的重组质粒通过荧光定量PCR体系建立标准曲线,建立了检测肉食兽类细小病毒基因组拷贝数的荧光定量PCR方法。结果显示,该检测方法在3.50×102～3.50×107 copies/μL范围内与Cp值呈良好的线性关系(R2可达0.999),最低检测浓度为35.0copies/μL。通过标准曲线得出RDPVLN10-1株样品的目标片段拷贝数,将拷贝数值与TCID50值进行相关性分析;分析结果显示,基因组拷贝数值与病毒TCID50值之间存在极显著的正相关关系(P<0.01),血凝效价与病毒TCID50值存在显著的正相关关系(P<0.05)。结果表明,与用血凝效价测定病毒含量的方法相比,用本试验建立的荧光定量PCR技术测得的病毒拷贝数值更能准确地代表活病毒的含量。

H5亚型禽流感灭活疫苗病毒基因的定量检测及其与HI抗体效价之间关系的分析

目的建立H5亚型禽流感病毒灭活疫苗中病毒核酸的特异、敏感、快速的定量检测方法,分析其与HI抗体效价之间的相关性。探索禽流感灭活疫苗效力体外检验的方法。方法选取H5亚型禽流感病毒(avian influenza virus,AIV)血凝素(hemagglutinin,HA)基因保守序列,使用Primer Express 2.0软件设计了特异性引物和TaqMan MGB(minor groove binder)探针,利用实时荧光PCR技术来定量检测禽流感灭活疫苗,通过体外转录,制备含有选定检测序列的RNA标准品,绘制标准曲线。对50批H5亚型禽流感灭活疫苗进行了荧光定量PCR检测,测定了疫苗的HA基因拷贝数,同时测定了50批疫苗相应的HI抗体效价。进行了疫苗的HA基因拷贝数与HI抗体效价之间相关性的分析。结果该方法的灵敏度为10拷贝/反应,标准曲线的相关系数为0.998003,对H9亚型禽流感灭活疫苗和其他禽病疫苗无交叉反应,特异性好、重复性佳。疫苗的HA基因拷贝数与HI抗体效价不相关。结论荧光定量PCR方法为H5亚型禽流感病毒灭活疫苗检测提供了一种特异、敏感、快速的定量检测方法。

肺炎支原体抗体滴度和RNA检测在儿童肺炎支原体肺炎诊疗中的应用价值

目的:评价肺炎支原体抗体滴度和RNA病原检测在儿童肺炎支原体(Mp)肺炎诊断和治疗过程中的应用价值。方法:采用观察性研究,收集2019年6至11月首都儿科研究所附属儿童医院呼吸内科因社区获得性肺炎住院的患者433例,采用颗粒凝集法检测肺炎支原体抗体滴度,采用RNA实时荧光恒温扩增技术(SAT)测定Mp-RNA,明确支原体肺炎(Mpp)感染和诊疗情况。两种方法阳性率的比较及3种因素(年龄、病程天数、大环内酯类用药)对方法阳性率的影响分析,采用χ^2检验。结果:433例肺炎患者中Mpp组303例,非Mpp组128例,Mpp组抗体滴度阳性率(≥1∶160)79.5%(241/303),Mp-RNA阳性率77.2%(234/303),两种方法诊断价值一致。SAT方法检测Mp-RNA敏感度、特异度、阳性预测值、阴性预测值分别为77.2%(234/303),96.1%(123/128),97.9%(234/239),64.1%(123/192)。抗体滴度阳性率(≥1∶160)在长病程组显著高于短病程组(χ^2=93.227,P<0.01),滴度1∶160的天数为(5.89±1.72)d。Mp-RNA阳性率在短病程组显著高于长病程组(χ^2=20.103,P<0.01)。SAT方法检测Mp-RNA可用于治疗效果监测,Mp-RNA阳性患者出院转阴率34.2%(26/76),拷贝数下降率82.9%(63/76)。结论:两种检测方法各有优劣,抗体滴度检测需要正确把握时间窗并做动态监测,SAT检测Mp-RNA应在病程早期、未使用抗菌药物时进行。两种检测方法的联合应用可取长补短、加强优势,为Mpp临床确诊、正规治疗提供有价值的实验室依据。

人3型副流感病毒滴度TaqMan实时荧光定量RT-PCR检测方法的建立

目的利用TaqMan实时荧光RT-PCR(real-time RT-PCR)技术建立测定人3型副流感病毒培养物滴度的方法。方法根据人3型副流感病毒HN基因的保守序列设计引物及探针,采用10倍系列稀释的体外转录HN RNA为模板,建立定量标准曲线。验证方法的专属性、敏感性、重复性,并对人3型副流感病毒的病毒培养液滴度进行检测。结果建立的方法对HN RNA标准品的检出灵敏度为4.7 copies/μL,标准曲线相关系数为0.998,扩增效率为105%。标准品的实验内重复性CV均<0.50%,实验间重复性CV<3.60%。系列稀释HNRNA标准品在低温(-80℃)下保存3年后,所测标准曲线的斜率和截距差异均无统计学意义(P=0.673)。用该方法对人3型副流感病毒分离株LZ17、LZ1501和LZ1728进行检测,结果均为阳性,3个病毒分离株滴度检测重复性CV均<10.00%;对7种呼吸道非人3型副流感病毒病原体检测均为阴性,表明该方法具有很高的专属性、敏感性和重复性。结论建立的TaqMan探针实时荧光定量RT-PCR技术可以快速、准确地对人3型副流感病毒滴度进行检测。