瓜实蝇不同发育期及组织实时荧光定量PCR内参基因筛选

【目的】筛选出适用于瓜实蝇[Zeugodacus cucurbitae(Coquillett)]抗药性分子机制及生理分子机制研究的内参基因及最优组合数,为瓜实蝇抗药性机理研究打下基础。【方法】以不同发育期的敏感品系和抗阿维菌素品系瓜实蝇及其不同组织样本为试验材料,将8个候选内参基因通过实时荧光定量PCR进行表达检测,并利用geNorm、NormFinder、Bestkeeper和RefFinder软件对内参基因表达稳定性进行综合评估分析,筛选出最稳定表达的内参基因并明确最优组合数。【结果】geNorm分析结果显示,不同发育期处理内参基因表达稳定性排序为RPS13=RpL32(0.269)>TUBE(0.623)>TBP(0.702)>β-tubulin(1.069)>G6PDH(1.366)>Actin3(1.596)>Actin2(1.923);不同组织处理内参基因表达稳定性排序为RpL32=RPS13(0.132)>TBP(0.345)>TUBE(0.442)>β-tubulin(0.552)>G6PDH(0.780)>Actin2(1.101)>Actin3(1.417),最适内参基因个数为2。NormFinder分析结果显示,不同发育期处理内参基因表达稳定性排序为RpL32(0.399)>RPS13(0.446)>TUBE(0.738)>G6PDH(0.912)>TBP(0.924)>β-tubulin(1.086)>Actin3(1.092)>Actin2(1.866);不同组织处理内参基因表达稳定性排序为RpL32(0.090)>RPS13(0.117)>TBP(0.389)>TUBE(0.445)>β-tubulin(0.705)>G6PDH(0.877)>Actin2(1.009)>Actin3(1.567)。BestKeeper分析结果显示,不同发育期处理内参基因表达稳定性排序为TUBE>TBP>RPS13>RpL32>β-tubulin>G6PDH>Actin3>Actin2;不同组织处理内参基因表达稳定性排序为β-tubulin>TBP>TUBE>RPS13>RpL32>G6PDH>Actin2>Actin3。RefFinder分析结果显示,不同发育期处理内参基因表达稳定性排序为RpL32>RPS13>TUBE>TBP>G6PDH>β-tubulin>Actin3>Actin2;不同组织处理内参基因表达稳定性排序为RPS13>RpL32>TBP>β-tubulin>TUBE>G6PDH>Actin2>Actin3。【结论】RPS13和RpL32可组合作为瓜实蝇不同发育期、不同组织及阿维菌素抗性分子机制和生理分子机制研究的内参基因。

FQ-PCR溶解曲线技术分析白血病患者PBMC中T细胞TCRα/βCDR3谱系特征

目的采用FQ-PCR溶解曲线技术分析临床白血病患者外周血单个核细胞(PBMC)中T细胞TRAV和TRBV基因各家族的CDR3谱系特征。方法提取4例健康志愿者和15例临床白血病患者PBMC中mRNA,逆转录成cDNA,FQ-PCR扩增32个TRAV基因和24个TRBV基因家族的CDR3区,FQ-PCR溶解曲线技术分析CDR3谱系特征,并测序分析单克隆家族CDR3区氨基酸序列的组成。结果 4例健康志愿者PBMC中α/βT细胞的CDR3谱系FQ-PCR溶解曲线峰型图,均表现为多峰图;而15例白血病患者PBMC中α/βT细胞CDR3谱系FQ-PCR溶解曲线峰型图,多数患者出现寡或偏峰型图、低或无峰型图、典型的单峰型图;不同白血病患者异常峰的频率不一致;单峰型图TRAV和TRBV PCR产物基因测序,未发现不同患者存在完全相同的CDR3区。结论FQ-PCR溶解曲线技术能很好的分析白血病患者PBMC中TCRα/βCDR3谱系的单、寡、多克隆性增殖;非T细胞白血病患者PBMC中TCRα/βCDR3的单峰(或寡峰)家族T细胞,可能来源于机体对肿瘤应答的T细胞,而在T细胞白血病患者,可能为肿瘤T细胞或机体抗肿瘤T细胞。本实验可为进一步研究白血病的免疫应答机制和个体化治疗提供基础。

基于锁核酸及等位位点特异性扩增技术的KRAS基因突变检测荧光定量PCR方法研究

基于等位位点特异性扩增的原理,设计锁核酸修饰KRAS基因突变特异性扩增引物,结合封阻探针技术,建立检测KRAS基因突变的荧光定量PCR方法。结果发现,锁核酸修饰的引物及探针可显著提高等位位点特异性扩增技术用于复杂样本中的微量基因突变检测的敏感度,该技术检测KRAS基因突变的敏感性可达0.01%~0.1%。进一步用建立的荧光定量PCR方法检测52例结直肠癌患者血浆标本,并用DNA测序法作为对照,同时用健康人血浆标本建立阴性检测结果判读标准,以初步评价该方法应用于循环DNA中KRAS基因突变检测的可行性。结果发现结直肠癌患者KRAS基因突变主要是G12C、G12A和G12R,而且q PCR法的阳性检出率为46.15%,高于DNA测序法(13.46%),阴性结果与DNA测序法的符合率为100%。此外,结直肠癌患者外周血KRAS基因的突变检出率与文献报道组织标本中的突变检出率及常见突变类型基本相符。上述结果说明该方法检测循环肿瘤DNA(circulating tumor DNA,ct DNA)具有较高的可靠性,可以用于肿瘤患者循环血液中KRAS基因突变的检测。

结直肠癌及癌前病变hTERT mRNA定量检测及其临床意义

目的探讨结直肠癌及癌前病变组织中人端粒酶逆转录酶(human telomerase reverse transcriptase,h TERT)mRNA的表达量及其临床意义。方法以实时荧光定量RT-PCR检测95例结直肠癌、50例结直肠腺瘤息肉、25例结直肠增生性息肉、21例溃疡性结肠炎及20例正常结直肠黏膜组织中h TERT mRNA的表达量;分析结直肠癌组织中h TERT mRNA表达量与肿瘤病理特征及预后的关系。结果结直肠癌组h TERT mRNA表达量显著高于结直肠腺瘤息肉组、溃疡性结肠炎组、结直肠增生性息肉组和正常对照组(P<0.01);腺瘤息肉中伴高级别上皮内瘤变者h TERT mRNA表达量明显高于伴低级别上皮内瘤变者(P<0.01),且两者均明显高于不伴上皮内瘤变者(P<0.05);溃疡性结肠炎组h TERT mRNA表达量明显高于正常对照组(P<0.05)。结直肠癌组h TERT mRNA表达量与肿瘤分化程度、浸润深度、淋巴结转移、术后复发及TNM分期呈正相关(P<0.05),与术后生存期呈负相关(P<0.05)。Cox多因素回归分析显示结直肠癌组织中h TERT mRNA表达量是影响术后预后的危险因素。结论结直肠癌组织中h TERT mRNA表达量与肿瘤重要病理特征相关,可成为评价结直肠癌术后预后的指标;结直肠腺瘤息肉和溃疡性结肠炎组织中h TERT mRNA高表达可能成为结直肠癌发生的预测指标。

非酒精性脂肪肝大鼠L-FABP和PPAR-α mRNA的动态表达

目的:检测非酒精性脂肪肝大鼠肝脏中L-FABP、PPAR-α mRNA的动态变化,探讨非酒精性脂肪肝的发病机制.方法:♂大鼠84只,体质量180g±10g,随机分为饮食基础饲料的正常对照组和饮食高脂饲料的实验组;各组又随机分为0、2、4、8、12、16、18wk7个时相组,其中高脂饲料组在12wk以后饮食正常饲料,使其脂肪肝处于自然恢复状态.分别于不同时相从心脏取血,测定血清中ALT、TG、CHOL、HDL-C和LDL-C的含量;收集肝脏标本,分别进行病理学检测和L-FABP和PPAR-α mRNA的动态变化检测.结果:对照组大鼠肝脏L-FABP和PPAR-α mRNA在不同时相间的表达无显著性变化.高脂饮食脂肪肝大鼠第2周时病理切片没有观察到脂肪变性.L-FABP mRNA在第4周升高(0.59±0.06vs0.52±0.03,P<0.05),第8、12周显著升高(0.91±0.07,0.92±0.08vs0.52±0.03均P<0.01),正常饮食6wk后显著下降(0.59±0.04vs0.92±0.08,P<0.01),但是与对照组比较仍升高(P<0.05).PPAR-α mRNA在第4周下降(1.05±0.09vs1.13±0.07,P<0.05),第8、12周显著下降(0.89±0.04,0.85±0.07vs1.13±0.07,均P<0.01),正常饮食6wk后显著升高(1.04±0.07vs0.85±0.07,P<0.01),但是与对照组比较仍下降(P<0.05).脂肪变性面积在第12周时最大,但未见明显的炎症反应,正常饮食6wk后脂肪变性明显好转.结论:高脂饮食脂肪肝大鼠模型L-FABP mRNA表达阈值的出现和PPAR-α mRNA表达下调可能在脂肪变性形成过程中起到重要作用,且单纯脂肪变性在一定程度上是可以通过饮食调节自然恢复的.

外周血单个核细胞多药耐药相关基因含量监测在儿童恶性肿瘤中的应用

目的:建立检测多药耐药(multi-drug resistance,MDR)相关基因荧光定量RT-PCR方法,并动态监测肿瘤患者外周血MDR相关基因(MDR1、MRP1和LRP)含量,探讨是否根据这些基因含量来指导肿瘤化疗。方法:利用Taq-Man探针方法,建立检测MDR相关基因的荧光定量RT-PCR方法。以健康对照组50例,肿瘤(含淋巴瘤、神经母细胞瘤、卵黄囊瘤等)组262例,化疗不同时期抽取患者外周血950份,提取RNA,检测单个核细胞内MDR相关基因(MDR1、MRP1和LRP)含量,分析这些基因的含量与肿瘤化疗方案的关系。结果:成功建立以Taq-Man探针为基础的MDR相关基因荧光定量RT-PCR方法。①与健康对照组相比,肿瘤组患者外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear,PBMC)MDR1基因起始含量较高,尤以神经母细胞瘤和卵黄囊瘤为甚,这2类肿瘤可能存在一定程度的原发耐药性。②对同一肿瘤患者,化疗后PBMC MDR1含量随化疗疗程增加而逐渐增高,以神经母细胞瘤和卵黄囊瘤最为敏感。结论:MDR1、MRP1和LRP含量与肿瘤的化疗方案密切相关,PBMC和肿瘤组织中MDR1的表达与化疗疗效呈显著负相关。检测外周血中MDR1基因的含量能够动态监测肿瘤患者的MDR,利用荧光定量RT-PCR方法动态监测肿瘤患者化疗前后外周血MDR相关基因(MDR1、MRP1和LRP)的含量,对化疗疗效监测及预后判定具有一定的参考价值,可以用来指导相关基因底物的肿瘤药物化疗。

7个家蚕新品系对BmNPV的抵抗力及中肠组织中Bmlipase-1的表达水平检测

为了获得对家蚕核型多角体病毒(Bm NPV)感染抵抗力较强的家蚕品系,以现行推广杂交组合粤蚕6号和两广二号的8个亲本品种为材料,给3龄起蚕添食浓度为4×107m L-1的Bm NPV多角体悬液,连续12代接种病毒筛选后获得7个对Bm NPV的抵抗能力有显著提高的新品系,其中新品系研7-N感染Bm NPV的发病率由原品种的96.30%降低至51.46%,表现出极显著差异(P<0.01)。采用荧光定量PCR方法,检测新品系及其杂交组合幼虫中肠组织中与Bm NPV抗性相关的脂肪酶1(Bmlipase-1)基因的表达水平,结果显示不同新品系间Bmlipase-1基因的表达水平差异较大,与其对Bm NPV的抵抗能力一致,其中春5-N、研7-N和湘晖-N等新品系及其杂交组合的Bmlipase-1表达水平均较原品种及其杂交组合极显著上升(P<0.01)。获得的家蚕新品系可作为抗Bm NPV育种的优良素材。

贝那普利对肝星状细胞IGFBP-2mRNA表达的影响

目的探讨血管紧张素II(Angiotensin II,AngII)及血管紧张素转化酶抑制剂贝那普利对体外培养的肝星状细胞胰岛素生长因子结合蛋白-2(insulin-like growth factor binding protein-2,IGFBP-2)mRNA表达的影响。方法采用肝星状细胞珠HSC-T6作为研究模型,将培养的肝星状细胞分为对照组、AngII组、贝那普利组和贝那普利+AngII组采用实时荧光定量PCR(Realtime fluores-cence quantitative PCR,RTFQ PCR)的方法检测肝星状细胞中IGFBP-2mRNA的表达水平。结果 (1)在体外培养的肝星状细胞中AngII组高于对照组,差异有统计学意义(P<0.05);(2)AngII+贝那普利组IGFBP-2mRNA低于AngII组(P<0.05)。结论 AngII能促进肝星状细胞IGFBP-2mRNA表达,贝那普利的抗肝纤维化作用,可能与IGFBP-2 mRNA表达降低有关。

蜡梅α-半乳糖苷酶基因的克隆和表达分析

从蜡梅中克隆α-半乳糖苷酶基因,通过对其酶学性质及基因表达分析,为研究蜡梅的低温适应的分子机理提供参考.通过PCR扩增获得α-半乳糖苷酶基金(CpGAL),构建了该基因的原核表达载体pET28a-CpGAL并转化到大肠杆菌BL21(DE3)中,诱导表达并分离纯化得到融合蛋白.利用SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR检测CpGAL基因在腊梅不同发育时期的表达差异.

四种水稻蛋白与水稻黑条矮缩病毒编码非结构蛋白P7-2的互作分析

水稻黑条矮缩病毒(RBSDV)是斐济病毒属的成员之一,可侵染玉米和水稻等作物,给亚洲地区的田间生产带来严重的损失。RBSDV有10条双链RNA(double strand RNA,dsRNA)基因组,编码12个蛋白。其中6个蛋白是病毒粒子的结构成分(P1,P2,P3,P4,P8,P10),6个非结构蛋白分别为P5,P6,P7-1,P7-2,P9-1,P9-2。在非结构蛋白中,P5,P6和P9-1已被证实参与形成毒质结构,P7-1被认为可在细胞质中形成类似管状的结构作为病毒胞间扩散的通道,P7-2和P9-2的功能目前尚不明确。文章采用Pull-Down和液相色谱—质谱联用(LC-MS/MS)等技术来鉴定水稻蛋白(日本晴)与P7-2蛋白间可能存在的互作关系。通过Pull-Down实验分析,发现有4种水稻蛋白可与P7-2相结合,其中2个蛋白为转录相关蛋白,1个为氨基转移酶,还有1个为假定的分子伴侣60前体。实时荧光定量PCR分析显示,感病寄主中的转录相关蛋白和假定的分子伴侣60前体的表达量上调,而氨基转移酶的表达量降低。

实时荧光定量PCR法研究溃疡性结肠炎患者肠道双歧杆菌属、柔嫩梭菌属及拟杆菌属量的变化

目的应用荧光定量PCR技术对人粪便内双歧杆菌属、柔嫩梭菌属及拟杆菌属进行定量检测,揭示肠道相关菌群改变在溃疡性结肠炎(ulcerative colitis,UC)发病中的作用及意义。方法分别设计双歧杆菌属、柔嫩梭菌属及拟杆菌属的特异性引物。收集溃UC患者粪便标本60份及正常对照标本60份,提取细菌基因组DNA,应用实时荧光定量PCR反应测定细菌的数量。结果 UC患者组双歧杆菌属及柔嫩梭菌属的数量较正常对照组明显减少(P<0.05),而拟杆菌属的数量较正常对照组明显增多(P<0.05),差异有统计学意义。结论 UC患者粪便中双歧杆菌属及柔嫩梭菌属的数量较正常对照明显减少,而拟杆菌属的数量较正常对照明显增多,提示肠道菌群与UC的发生、发展有一定的关系。

膀胱尿路上皮癌IDO和Bin1表达临床意义研究

目的探讨膀胱尿路上皮癌组织吲哚胺2,3一二氧化酶（indoleamine 2,3-dioxygenase,IDO）和Bin1蛋白（bridging intergrator protein-1,Bin1）表达及意义。方法收集2007-01-12-2011-07-31昆明医科大学第三附属医院手术切除后石蜡标本84例和同期新鲜标本50例,同期远离癌组织的非肿瘤性膀胱组织为正常膀胱组织共22例,所有新鲜标本采用实时荧光定量PCR检测IDO表达,石蜡标本采用SP法进行免疫组化染色检测IDO和Bin1的表达,并分析其与临床病理特征的相关性。结果膀胱尿路上皮癌组织中IDO阳性表达率为57.14%,Bin1阳性表达率为46.43%。IDO在浸润型膀胱尿路上皮癌组织中表达率明显高于非浸润型,χ2=5.600,P=0.018;随着膀胱尿路上皮癌组织分级（χ2=20.268,P〈0.001）及TNM分期（χ2=12.075,P=0.007）增高,IDO阳性表达率增高;Bin1在浸润型膀胱尿路上皮癌组织中表达明显低于非浸润型（χ2=7.685,P=0.007）,随着膀胱尿路上皮癌组织分级（χ2=15.817,P〈0.001）及TNM分期（χ2=11.104,P=0.010）增高,Bin1阳性表达率降低,差异有统计学意义。膀胱尿路上皮癌组织中IDO表达强度与Bin1表达强度呈负相关（r=-0.306,P=0.003）,与组织学分类（r=0.258,P=0.018）、组织分级（r=0.491,P〈0.001）及TNM分期（r=0.365,P=0.001）呈正相关。Bin1表达强度与组织学分类（r=-0.302,P=0.005）、组织分级（r=-0.411,P〈0.001）及TNM分期（r=-0.302,P=0.005）呈负相关。实时荧光定量PCR检测结果显示,IDO mRNA在膀胱尿路上皮癌组织中的平均表达水平为7.696 1±1.745 28,明显高于正常膀胱组织的6.397 0±1.205 17,t=2.367,P=0.023;Ta和T1期IDO mRNA在膀胱尿路上皮癌组织中的平均表达水平为6.803 4±1.567 53,明显低于T2~T4期的9.183 8±0.690 32,t=4.955,P〈0.001;IDO mRNA在Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ级膀胱尿路上皮癌组织中的平均表达水平分别为7.058 7±1.771 57、7.9342±1.530 57和9.290 7±0.574 59,差异有统计学意义,F=4.675,P=0.017。结论 IDO高表达和Bin1低表达或表达缺失与膀胱尿路上皮癌病变进展及预后不良相关,提示IDO和Bin1可能成为膀胱尿路上皮癌患者的预后因子及治疗靶点。

水中诺如病毒浓缩与应急检测研究

目的探索适合于基层实验室开展的水中诺如病毒浓缩与应急检测的方法,评估钙离子法对水体中诺如病毒的富集效果及检测灵敏度,为水源性诺如病毒突发疫情的病原检测提供可靠的检测数据。方法将不同浓度的指示病毒(GⅡ型诺如病毒)加入到不同水样中,用钙离子法进行富集,用荧光定量PCR检测,根据富集前后的病毒浓度,评估方法的回收率;根据不同梯度的检测值,评估方法的灵敏度。同时制备不同的模拟水样进行荧光定量PCR检测。结果钙离子法的平均回收率为81.6%,检测灵敏度为模拟样本中病毒浓度为10 copy/μl。而10份不同模拟水样荧光定量PCR检测阳性9份。结论钙离子法浓缩水样中的诺如病毒,回收率与灵敏度均较高,操作简单;同时,荧光定量PCR检测方法具有快速、灵敏的优点,适用于基层实验室开展水体中诺如病毒的应急检测。