BCMA CAR-T治疗复发/难治性多发性骨髓瘤患者的长期疗效和影响因素分析

目的:评价靶向B细胞成熟抗原(B cell maturation antigen,BCMA)嵌合抗原受体T细胞(chimeric antigen receptor-T cell,CAR-T)治疗复发/难治性多发性骨髓瘤(relapsed/refractory multiple myeloma,R/R MM)的长期疗效和安全性。方法:回顾性分析2018年7月至2023年7月在南昌大学第一附属医院接受BCMA CAR-T细胞治疗20例R/R MM患者的临床资料,随访日期截至2023年12月31日。应用Kaplan-Meier生存分析评估患者总生存(overall survival,OS)率和无进展生存(progression-free survival,PFS)率,并统计相关不良反应。结果:20例R/R MM患者,既往中位治疗线数为3(2~6)线,客观缓解率(objective response rate,ORR)为75%,完全缓解(complete response,CR)率为50%;中位随访时间29个月,中位PFS为26个月。10例CR的患者中,5例在末次随访时仍处于缓解状态,缓解持续时间最短为6个月,最长48个月。亚组分析中,髓外浸润、17p缺失遗传学异常和肿瘤高负荷患者PFS显著更差(P<0.05)。细胞因子释放综合征(cytokine release syndrome,CRS)是CAR-T细胞治疗最常见的不良反应,发生率为90%,3~4级CRS的发生率为35%;远期不良反应少,未发生CAR-T细胞治疗相关死亡。结论:BCMA CAR-T细胞是当前R/R MM治疗的有效方案,不良反应可控。髓外浸润和肿瘤高负荷的患者治疗有效,但持久反应欠佳,如何进一步巩固和维持患者的疗效,值得进一步设计前瞻性的临床研究并探究其差异性。

IL-7的诱导表达增强靶向GPC3 CAR-T细胞的增殖及体外抗肿瘤活性

目的:探讨IL-7的诱导表达对靶向磷脂酰肌醇蛋白聚糖3(GPC3)嵌合抗原受体基因修饰T淋巴细胞(CAR-T细胞)的增殖和体外抗肿瘤活性的影响。方法:通过无缝克隆将GPC3 CAR序列片段插入GV400载体的Bam HⅠ/Eco RⅠ位置,构建第二代CAR慢病毒载体GPC3-BBZ及GPC3-BBZ-NFAT-IL-7,以293T细胞包装相应的慢病毒载体后,感染人T细胞制备CAR-T细胞。实验分为未转导T细胞(NT)组、GPC3-BBZ CAR-T细胞组、GPC3-BBZ-NFAT-IL-7 CAR-T细胞组。采用流式细胞术检测各组CAR-T细胞中CAR的表达水平,qPCR法检测经GPC3蛋白激活的CAR-T细胞中IL-7 m RNA的表达水平,细胞计数法检测CAR-T细胞在GPC3抗原刺激下的增殖能力,ELISA检测CAR-T细胞在受到肿瘤细胞刺激后IL-7、IFN-γ和TNF-α的分泌水平。应用实时细胞分析(RTCA)技术检测CAR-T细胞对人肝癌Huh-7细胞的杀伤作用。结果:成功构建慢病毒载体GPC3-BBZ和GPC3-BBZ-NFAT-IL-7,制备出靶向GPC3的CAR-T细胞。经GPC3抗原激活后,GPC3-BBZ-NFAT-IL-7 CAR-T细胞可有效表达IL-7 mRNA(P<0.01),其表现出更强的增殖能力(P<0.05)。与GPC3-BBZ CAR-T细胞相比,GPC3-BBZ-NFAT-IL-7 CAR-T细胞与GPC3阳性靶细胞Huh-7细胞共培养后,分泌更高水平的IL-7、IFN-γ和TNF-α(P<0.01或P<0.001)。RTCA结果显示,GPC3-BBZ-NFAT-IL-7 CAR-T细胞对GPC3阳性Huh-7细胞的杀伤活性显著高于GPC3-BBZ CAR-T细胞(P<0.05)。结论:成功制备可诱导表达IL-7的靶向GPC3的CAR-T细胞,IL-7的诱导表达增强靶向GPC3 CAR-T细胞的免疫活性,在体外展现出较强的肿瘤细胞杀伤能力。

CAR-T细胞体内外扩增方法的优化策略

嵌合抗原受体基因修饰T(CAR-T)细胞免疫治疗被认为是最有前景的肿瘤治疗方法之一,效应CAR-T细胞的数量是决定CAR-T细胞疗法治疗效果的关键因素。CAR-T细胞的体外扩增耗时耗力,回输体内后,CAR-T细胞大量耗竭且难以浸润实体瘤,导致能有效抑制实体瘤的CAR-T细胞数量大幅下降。目前,CAR-T细胞的扩增方法在提高扩增特异性和治疗安全性等方面均存在问题,为CAR-T细胞疗法的临床转化造成困难。近年来,新型免疫激动剂及其下游信号的发现为CAR-T细胞扩增方案提供了更多选择,免疫激动剂给药方式的更新迭代进一步提高了其在体内扩增CAR-T细胞的安全性。本文分析了目前扩增CAR-T细胞面临的挑战,系统阐述了近年来在体内外扩增CAR-T细胞的新策略,为CAR-T细胞疗法的疗效和产能优化提供了新思路。

小鼠抗人密封蛋白18剪接变异体2(Claudin18.2)CAR-T细胞的构建及体外功能验证

目的筛选一种抗人密封蛋白18剪接变异体2(Claudin18.2)的单克隆抗体(mAb),并基于该抗体序列构建靶向Claudin18.2的嵌合抗原受体T(CAR-T)细胞,用于开发CAR-T细胞疗法。方法用人Claudin18.2抗原免疫小鼠,取小鼠脾细胞与SP2/0细胞进行细胞融合,经筛选获得小鼠抗人Claudin18.2 mAb。以抗体序列为模板PCR扩增出重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)序列,用接头(linker)连接成单链抗体(scFv),并用此scFv构建CAR。将CAR克隆至慢病毒表达载体中,用包装好的慢病毒感染T细胞制备出抗Claudin18.2 CAR-T细胞。结果筛选到的小鼠抗人Claudin18.2 mAb对人和鼠的Claudin18.2抗原都有结合能力,亲和力高于对照抗体。构建的CAR-T细胞在效靶比1∶9时,对过表达Claudin18.2的阳性靶细胞的杀伤率在50%~70%。结论制备的小鼠抗人Claudin18.2 mAb具有人鼠双种属特异性,组织特异性良好,亲和力高。构建的anti-Claudin18.2 CAR-T细胞对靶细胞具有良好杀伤效果。

c-Met作为嵌合抗原受体T(CAR-T)细胞治疗结肠癌靶点的生物信息学预测及验证

目的探索细胞间充质上皮转化因子(c-Met)作为嵌合抗原受体T(CAR-T)细胞治疗结肠癌有效靶点的可能性。方法通过生物信息学方法分析c-Met在结肠腺癌(COAD)中的特异性表达及其临床意义;使用免疫组织化学验证结肠癌临床患者肿瘤组织中c-Met的表达,采用流式细胞术检测HCT116结肠癌细胞株中c-Met的表达;使用慢病毒感染人外周血单个核细胞(PBMC)中原代T细胞,制备靶向c-Met的二代CAR-T细胞,并观察c-Met CAR-T细胞对HCT116细胞的抑制效果。结果免疫组织化学与生物信息学显示c-Met在COAD中高表达,其中相对低表达的患者生存预后较好,在正常结肠组织中低表达或不表达。流式细胞术显示c-Met在HCT116细胞中也高表达。c-Met CAR-T细胞能够靶向表达抗原的肿瘤细胞,并且在抗原刺激下,CAR-T细胞特异性增殖,起到杀伤癌细胞与释放白细胞介素2(IL-2)和γ干扰素(IFN-γ)的生物学作用。结论c-Met有成为COAD潜在治疗靶点的潜能;c-Met CAR-T细胞在体外对结肠癌细胞具有抑制作用。

靶向人表皮生长因子受体2嵌合抗原受体T(HER2-CAR-T)细胞毒性作用的体内外验证

目的 对靶向人表皮生长因子受体2嵌合抗原受体T(HER2-CAR-T)细胞进行毒理学评估,为其后期HER2-CAR-T细胞治疗的临床上评估提供安全性依据。方法 利用重组慢病毒载体制备HER2-CAR-T细胞,采用软琼脂集落形成实验,观察HER2-CAR-T细胞集落形成情况并对集落形成率进行统计分析;将HER2-CAR-T细胞悬液与兔红细胞悬液共孵,通过直接观察法以及酶标仪检测法评估红细胞溶解情况;对雄性新西兰兔耳缘静脉注射HER2-CAR-T细胞制剂,通过组织切片染色观察HER2-CAR-T细胞对动物血管的刺激作用;以pMD 2.G载体上的水泡性口炎病毒囊膜糖蛋白(VSV-G)基因为目标序列,利用荧光定量PCR进行慢病毒载体安全性的验证;取接受HER2-CAR-T细胞输注的小鼠心、肝、肺、肾,HE染色观察其病变情况。结果 成功制备了HER2-CAR-T细胞,这些细胞在体外不具备软琼脂集落形成能力,HER2-CAR-T细胞制剂对新西兰兔红细胞不产生溶血现象。新西兰兔耳缘静脉输注HER2-CAR-T细胞后未发现明显血管刺激反应,也未检测到VSV-G的特异性扩增,治疗组小鼠心、肝、肺、肾组织未见明显病变。结论 所制备的HER2-CAR-T细胞具有可靠安全性。

基于BCMA突变体构建BCMA CAR-T细胞体外杀伤功能评价模型

目的:为解决野生型B细胞成熟抗原(BCMA)被γ分泌酶切割导致表达不稳定的问题,构建抵抗γ分泌酶切割的BCMA突变体并构建靶细胞,用于评价BCMA CAR-T细胞的杀伤功能。方法:将野生型BCMA的穿膜域替换为人CD8α穿膜域,构建抵抗γ分泌酶切割的BCMA突变体(BCMA-CD8αTM),构建过表达该突变体的U266(U266^(BCMA Mut))、K562(K562^(BCMA Mut))、SKOV3(SKOV3^(BCMA Mut))和CHO(CHO^(BCMA Mut))细胞;构建装载NFAT-EGFP报告基因的BCMA CAR Jurkat细胞(BCMA-CAR-Jurkat-Reporter)与U266^(BCMA Mut)细胞共培养,采用FCM检测该细胞中EGFP表达水平以指示NFAT激活水平,荧光素酶法检测BCMA CAR-T细胞对Luciferase标记的K562^(BCMA Mut)细胞的杀伤作用,实时无标记动态细胞分析技术(RTCA)检测BCMA CAR-T细胞对SKOV3^(BCMA Mut)和CHO^(BCMA Mut)细胞的杀伤作用。结果:应用γ分泌酶抑制剂LY411575抑制γ分泌酶活性,显著增强野生型U266细胞表面BCMA表达水平,平均荧光强度上调10倍以上;但撤除抑制剂后BCMA表达水平逐渐降低(P<0.01);BCMA-CD8αTM突变体可抵抗γ分泌酶的切割作用,在U266细胞表面稳定表达(P>0.05);U266细胞及过表达BCMA-CD8αTM的U266细胞与BCMA-CAR-Jurkat-Reporter细胞共培养后都可激活Reporter系统、增强EGFP表达,但该效应在BCMA-CD8αTM过表达的U266细胞中更显著(P<0.01);BCMA-CD8αTM在BCMA表达阴性的K562、SKOV3和CHO 3种靶细胞中成功过表达,且在LY411575处理下该突变体的表达水平仅有小幅度升高;荧光素酶法检测结果显示,不同效靶比下,BCMA CAR-T细胞均可特异、高效杀伤过表达BCMA-CD8αTM的K562细胞;RTCA结果显示,不同效靶比下,BCMA CAR-T细胞均可有效识别、杀伤过表达BCMACD8αTM的SKOV3和CHO细胞,但同等效靶比下的Mock-T细胞无此效应。结论:本实验构建的BCMA-CD8αTM突变体能够抵抗γ分泌酶的切割,在多种靶细胞表面稳定表达,为评价BCMA CAR-T细胞体外杀伤的有效性和特异性提供多种检测手段。

CAR-T细胞在肿瘤临床试验中的研究进展

以嵌合型抗原受体(CAR)为基础的细胞治疗近年成为肿瘤生物治疗领域最亮丽的明星。尤其是靶向CD19分子的CAR-T细胞在B淋巴细胞恶性肿瘤的临床治疗中取得了良好的疗效。本文通过总结国内外CAR-T细胞的临床试验数据,对其临床疗效和潜在的不良反应进行统计分析,并就CAR-T细胞的发生、临床应用及存在的问题进行阐述。

CAR-T细胞免疫治疗肿瘤的毒副反应及临床对策

嵌合抗原受体T细胞(chimeric antigen receptor T cell,CAR-T)是肿瘤免疫治疗的重要手段,具有较强的抗肿瘤活性,但临床毒副反应明显。CAR-T细胞可通过识别共表达靶抗原及交叉抗原的组织等机制,引起肿瘤溶解综合征(tumor lysis syndrome,TLS)和细胞因子释放综合征(cytokine release syndrome,CRS)等全身性损伤。有效监测和及时处理是防治毒副反应的关键,本文结合多个CAR-T细胞治疗肿瘤临床研究的结果与经验,对CAR-T细胞治疗肿瘤的相关毒副反应及临床对策作一阐述。

CAR-T细胞在肿瘤治疗中的机遇与挑战

近年来,嵌合抗原受体基因修饰T(CAR-T)细胞作为"活的药物"在血液肿瘤治疗中取得了令人振奋的效果,成为肿瘤治疗新的发展方向,得到了医学界广泛的认可。纵观免疫细胞治疗技术的发展历程,任何一项新的治疗手段从实验室到临床应用都需要一个不断完善的过程,CAR-T细胞治疗技术同样如此。虽然它在血液系统恶性肿瘤的治疗中显示出前所未有的疗效,如对晚期复发难治性急性淋巴细胞白血病(ALL)治疗的完全缓解(CR)可达到90%,对慢性淋巴细胞白血病(CLL)和部分B细胞淋巴瘤的CR达到50%以上,但目前CAR-T细胞疗法在血液肿瘤的治疗过程中尚存在脱靶效应、毒副作用、体内持续时间短、复发率高等问题;在CAR-T细胞治疗实体瘤方面,其安全性和有效性已得到证实,但疗效还有待提高。针对上述问题,笔者总结出提高CAR-T细胞治疗效果的六大策略:(1)克服患者本身T细胞的缺陷;(2)选择CAR-T细胞的最佳培养条件;(3)制定靶细胞刺激的最佳方案;(4)确定化疗预处理的方案;(5)实现CAR的人源化;(6)加强共刺激信号的组合。本文对近年来CAR-T细胞治疗技术的研究进展及该领域中亟需解决的问题作一分析与展望。

CAR-T细胞治疗产品中复制型病毒的风险分析及控制

嵌合抗原受体T细胞(CAR-T细胞)因其在血液肿瘤中的显著疗效已成为肿瘤免疫治疗领域中的国际研究新热点,成为肿瘤治愈新的希望。目前,在CAR-T细胞产品的生产中,通常是利用逆转录病毒载体或慢病毒载体将CAR基因高效地导入T细胞中,但在使用这些病毒载体的同时也带来了CAR-T产品污染复制型逆转录病毒(RCR)或复制型慢病毒(RCL)的潜在风险。虽然随着病毒载体设计及生产体系的不断改进,这种风险已大大降低,但仍不能完全排除。因此,监管机构要求对于临床使用的慢病毒或逆转录病毒载体、转导的CAR-T细胞产品以及患者均要进行复制型病毒的检测。本文主要通过分析复制型病毒污染检测的必要性、降低复制型病毒污染风险的措施、复制型病毒检测的阶段以及检测方法等方面,提出在CAR-T细胞生产过程中控制RCR/RCL的策略,以供CAR-T细胞产品研发者参考。

CAR-T细胞治疗的现状与临床应用前景

嵌合抗原受体T细胞(CAR-T)疗法是肿瘤过继免疫治疗的新手段。CAR-T细胞疗法治疗B细胞急性淋巴细胞白血病(B-ALL)的完全缓解率高达90%。然而,目前CAR-T细胞疗法在血液肿瘤的治疗过程中尚存在脱靶效应、毒副作用、体内持续时间短与复发率高等问题。此外,在CAR-T细胞治疗实体瘤方面的安全性和有效性虽已得到证实,但疗效还有待提高。本文对近年来CAR-T细胞治疗的研究进展及该领域中亟需解决的问题作一分析与展望。

2017年CAR-T治疗血液恶性肿瘤的研究进展

2017年,在两款嵌合抗原受体T细胞免疫疗法(chimeric antigen receptor T-cell immumotherapy,CAR-T)细胞产品获批后,推进了全球细胞免疫治疗的研究。本文将对近一年来已发表的和第59届美国血液病学会(American Society of Hematology,ASH)会议中关于CAR-T细胞治疗血液恶性肿瘤的研究进展做一综述。

CD19-CAR-T细胞治疗难治复发急性淋巴细胞白血病的研究进展

难治复发急性淋巴细胞白血病(acute lymphocytic leukemia,ALL)预后差,生存期短,其治疗已成为国际难题。嵌合抗原受体基因修饰T(chimeric antigen receptor gene-modified T,CAR-T)细胞是目前最具应用前景的靶向免疫治疗,靶向CD19的CAR-T细胞(CD19-CAR-T)治疗儿童及成人难治复发性ALL的完全缓解率(complete remission,CR)可达90%以上,疗效远高于化疗。然而,细胞因子释放综合征(cytokine release syndrome,CRS)、严重神经毒性(serious neurotoxicity,SNT)、脱靶效应以及疾病复发等严重限制了CAR-T细胞的进一步临床应用。本文主要阐述CAR-T细胞的制备技术、预处理方案、细胞输注剂量及各种并发症防治策略等最新研究进展。

CD3ζ链引入YRHQ基序可增强靶向HER2的CAR-T细胞的抗肿瘤活性

目的:探讨在靶向HER2的CAR的CD3ζ链胞内区引入YRHQ基序对CAR-T细胞的特异性杀伤活性及免疫记忆形成的影响。方法:通过DNA合成获得包含靶向HER2的编码抗原受体H28ζ或H28ζ(YRHQ)的DNA片段,通过慢病毒载体将不同CAR的DNA片段分别转导健康人外周血T细胞,制备靶向HER2的H28ζ-CAR-T及H28ζ(YRHQ)-CAR-T细胞。扩增过程中对不同CAR-T细胞进行计数,FCM检测CAR的表达率。将CAR-T细胞分别与HER2阳性的SKOV3、MDA-MB-453或HER2阴性的MCF-7细胞共培养,LDH释放法检测其杀伤活性,ELISA法检测IL-2、IFN-γ和颗粒酶B的水平,WB法检测STAT3磷酸化水平及免疫检查点分子TIM-3和PD-1的表达,通过FCM检测CCR7、CD45RO的表达,分析CAR-T细胞的表型。结果:H28ζ-CAR-T和H28ζ(YRHQ)-CAR-T细胞扩增能力较好,体外培养7 d时扩增4~5倍。H28ζ-CAR和H28ζ(YRHQ)-CAR表达率分别为(33.3±2.85)%和(28.30±3.2)%。H28ξ(YRHQ)-CAR-T细胞的杀伤活性较H28ζ-CAR-T细胞更高(P<0.05)。经HER2抗原刺激后,与T细胞或H28z-CAR-T细胞比较,H28ξ(YRHQ)-CAR-T细胞的STAT3磷酸化水平较H28ξ-CAR-T细胞明显升高(P<0.01);而两者间PD-1和TIM-3的表达无明显差异。未经抗原刺激的CAR-T细胞CCR7和CD45RO表达与正常T细胞比较差异无统计学意义(均P>0.05),与SKOV3细胞共培养后,与T细胞或H28z-CAR-T细胞比较,H28ξ(YRHQ)-CAR-T细胞中T_(EM)细胞比例明显增加、T_(CM)细胞比例明显减少(均P<0.05)。结论:在CD3胞内区引入YRHQ基序可在一定程度上提高CAR-T细胞的杀伤潜力。

CAR-T治疗复发难治性大B细胞淋巴瘤失败后的临床分析

目的:探讨真实世界大B细胞淋巴瘤(large B-cell lymphoma,LBCL)嵌合抗原受体-T(chimeric antigen receptor-T,CART)细胞治疗失败后的结局。方法:回顾性分析2018年7月至2022年12月于南昌大学第一附属医院接受CD19 CAR-T细胞治疗后出现疾病复发/难治性16例LBCL患者的临床资料,分析其后续治疗和预后。结果:16例患者中男性10例、女性6例,中位年龄53.5(16~72)岁,其预后极差,中位总生存期(median overall survival,m OS)仅为5.7个月(95%CI:5.1~6.3)。积极后续抗肿瘤治疗患者12例(75%),mOS为9.8个月(95%CI:3.3~16.3);姑息治疗4例(25%),mOS仅为2.1个月(95%CI:0~4.8),差异具有统计学意义(P<0.05)。后续抗肿瘤方案包括Pola-BR为4例(33.3%)、BTK抑制剂4例(33.3%)、抗PD-1抗体2例(16.7%)和免疫化疗2例(16.7%),最佳疗效为部分缓解4例(33.3%)。BTK抑制剂组2例(50%)为部分缓解,mOS为10.8个月(95%CI:3.4~18.1),较其他方案似有获益趋势,但差异无统计学意义(P>0.05)。结论:CAR-T治疗后复发或进展的LBCL患者预后差,治疗手段局限,如何合理化分层使用后线治疗策略未来值得探索。

CAR-T细胞治疗引起中枢神经系统神经毒性机制的研究进展

CAR-T细胞治疗对于血液系统恶性肿瘤是1种有效的治疗方法,目前已经有2种CAR-T治疗药物被美国FDA批准应用到临床,但CAR-T疗法得以广泛应用的障碍就是输注后毒性问题的出现,包括细胞因子综合征和中枢神经系统神经毒性,其中神经毒性是引起发病率和死亡率的主要原因,目前仍缺乏这种症状的病理生理研究,本文介绍近几年国内外对CAR-T细胞治疗产生的中枢神经系统神经毒性的临床表现和病理生理发生机制,将通过靶向治疗干预CAR-T细胞治疗后毒性的发生提供新的启示。

靶向肝癌的GPC3-CAR-T细胞的构建与功能鉴定

目的:构建靶向GPC3阳性肝癌细胞的嵌合抗原受体修饰T细胞[chimeric antigen receptor-modified T cell,CAR-T cell],并评估其对GPC3阳性肝癌细胞的杀伤效能。方法:选择偏爱密码子技术改造基因序列,以增强CAR分子表达效率,设计靶向GPC3抗原的CAR分子基因并构建携带GPC3-CAR基因的慢病毒表达载体p CDH-GPC3-CAR,感染T细胞;采用Western blotting、流式细胞术、实时细胞监测和ELISA技术分别检测GPC3-CAR分子在CAR-T细胞的表达、慢病毒感染T细胞效率、GPC3-CAR-T细胞对GPC3阳性肝癌细胞的杀伤活性和特异性。结果:双酶切p CDH-GPC3-CAR重组慢病毒质粒可见分子质量和GPC3-CAR分子一致的基因片段,成功构建p CDH-GPC3-CAR慢病毒质粒。约54.38%的GPC3-T细胞表达GPC3-CAR分子,称为GPC3-CAR-T细胞。GPC3-CAR-T细胞对GPC3阳性的肝癌细胞Huh-7比GPC3阴性的肝癌细胞SK-HEP-1具有更高效的杀伤能力[(78.96±4.76)%vs(6.87±3.15)%,P<0.01]。与GPC3阳性Huh-7肝癌细胞共培养的肝癌GPC3-CAR-T细胞分泌IFN-γ水平比Mock组高效[(21 371.4±1 808.3)vs(152.8±12.5)pg/ml,P<0.01],这可能是其高效杀伤肝癌细胞的机制之一。结论:靶向肝癌的GPC3-CAR-T细胞具有高效分泌IFN-γ细胞因子并特异高效杀伤GPC3阳性肝癌细胞的能力,为进一步推进GPC3-CAR-T临床前和临床研究奠定基础。

嵌合抗原受体T(CAR-T)细胞体外培养体系及慢病毒侵染条件的优化

目的优化嵌合抗原受体T(CAR-T)细胞的体外培养体系及慢病毒侵染条件。方法CD3磁珠分离纯化健康人外周血单个核细胞(PBMC)及健康孕妇脐带血单个核细胞(UCBMC),于8种不同培养体系进行扩增培养,培养体系包括以下成分的不同组合:重组人白细胞介素2(rhIL-2)、rhIL-12、rhIL-18、rhIL-7、rhIL-21、TWS119。分别于第0、3、5、7、10、18天进行细胞计数检测细胞增殖情况,流式细胞术检测细胞程序性死亡蛋白1(PD-1)的表达,ELISA检测γ干扰素(IFN-γ)释放,优化T细胞体外培养体系。采用(0、20、50)μg/mL重组人纤连蛋白(RetroNectin^■),(250、500、1000)ng/mL抗人CD3/CD28抗体包被培养板,以感染复数(MOI)=3、5的阴性对照慢病毒侵染T细胞72 h,于荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白(GFP)表达情况,初步判断病毒侵染效率;流式细胞术检测CD3/GFP阳性率,以获得慢病毒侵染条件。包装CD19 CAR慢病毒,实时荧光定量PCR、Western blot法检测是否成功构建CD19 CAR慢病毒载体,采用以上优化的病毒侵染条件及T细胞培养体系,包括建立rhIL-2、rhIL-12联合rhIL-18培养体系,使用1μg/mL抗人CD3/CD28,20μg/mLRetroNectin^■包被培养板,制备CD19 CAR-T细胞。结果细胞增殖能力较佳体系为rhIL-2联合rhIL-18,IFN-γ释放最强体系为rhIL-2、rhIL-12联合rhIL-18。抗CD3/CD28抗体剂量为1μg/mL,RetroNectin^■20μg/mL,MOI为3时病毒侵染效率最优。该优化条件下CAR-T细胞阳性率达34%。结论获得优化的CD19 CAR-T细胞体外培养体系及慢病毒侵染原代T细胞条件。

CAR-T细胞治疗实体肿瘤的新策略

嵌合型抗原受体修饰T(chimeric antigen receptor modified T,CAR-T)细胞治疗作为一种新的过继性免疫疗法在血液肿瘤中已取得了较好的疗效。在实体肿瘤中,肿瘤微环境中存在大量免疫抑制细胞、免疫抑制分子以及胞外基质,对迁移的CAR-T细胞的细胞毒性效应产生抑制作用,在实体肿瘤内严重抑制CAR-T细胞的抗肿瘤效力。同时,大多数实体肿瘤存在肿瘤异质性且缺乏相对特异性肿瘤抗原,CAR-T细胞在实体肿瘤部位的归巢能力差并伴随着脱靶效应,使其在实体瘤中的疗效欠佳。与血液肿瘤相比,实体瘤具有复杂的生物学特性,需要针对性的策略才能保证CAR-T细胞抗肿瘤长期有效。本文就CAR-T细胞的发展、在实体瘤治疗中的困惑及治疗策略的研究进展作一阐述。