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猪δ冠状病毒RBD蛋白多肽抗体的制备与鉴定
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作者 张国庆 姜宇航 +8 位作者 张爽 李乐天 郝嘉翼 陈竞 邹万成 李昌 李太元 高旭 金宁一 《中国畜牧兽医》 CAS CSCD 北大核心 2023年第4期1575-1583,共9页
【目的】设计合成猪δ冠状病毒(Porcine deltacoronavirus,PDCoV)受体结合结构域(receptor binding domain,RBD)的抗原表位,制备并鉴定多克隆抗体。【方法】为了特异性检测PDCoV RBD抗原,应用生物信息学技术预测其潜在抗原表位,将表位... 【目的】设计合成猪δ冠状病毒(Porcine deltacoronavirus,PDCoV)受体结合结构域(receptor binding domain,RBD)的抗原表位,制备并鉴定多克隆抗体。【方法】为了特异性检测PDCoV RBD抗原,应用生物信息学技术预测其潜在抗原表位,将表位氨基酸序列与δ冠状病毒属中的其他15株病毒株以及14株其他猪冠状病毒株进行相似性比对,将筛选的优势抗原表位与载体蛋白血蓝蛋白(keyhole limpet hemocyanin,KLH)偶联,合成多肽并免疫小鼠,制备PDCoV RBD特异性抗体。通过Western blotting试验对不同系统表达的PDCoV RBD以及PDCoV、TGEV和PEDV感染ST细胞表达的S蛋白进行鉴定,通过间接ELISA方法测定抗体效价。【结果】经序列比对,利用生物信息学技术预测合成的表位抗原与δ冠状病毒属中的其他15株病毒株(0~14.28%)以及14株其他猪冠状病毒株(0~7.14%)序列相似性非常低,具有良好的保守性;Western blotting结果显示,制备的多肽抗体1∶500、1∶1000、1∶2000倍比稀释后均能特异性识别转染pcDNA3.1-PDR-Strep的Expi293F表达的PDCoV RBD蛋白、杆状病毒感染SF9细胞表达的PDCoV RBD蛋白,1∶1000稀释后能够检测到PDCoV感染ST细胞表达的PDCoV S蛋白,而在TGEV和PEDV感染的细胞中未检测到特异性蛋白的表达;ELISA检测抗血清中多肽特异性抗体的效价可以达到1∶12800。【结论】利用生物信息学技术成功预测PDCoV RBD蛋白抗原表位,免疫后获得的抗体具有较好的特异性。 展开更多
关键词 猪δ冠状病毒(PDCoV) 受体结合结构域(rbd) 抗原表位 多肽抗体
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新型冠状病毒RBD蛋白原核表达及多克隆抗体的制备 被引量:2
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作者 彭晓燕 陆盼盼 胡祖权 《生物技术进展》 2023年第1期102-106,共5页
为原核表达严重急性呼吸综合征冠状病毒2(简称新型冠状病毒,severe acute respiratory syndrome-coronavirus 2,SARS-CoV-2)S蛋白受体结合域(receptor binding domain,RBD)并制备多克隆抗体,利用基因克隆技术将RBD基因连接到原核表达载... 为原核表达严重急性呼吸综合征冠状病毒2(简称新型冠状病毒,severe acute respiratory syndrome-coronavirus 2,SARS-CoV-2)S蛋白受体结合域(receptor binding domain,RBD)并制备多克隆抗体,利用基因克隆技术将RBD基因连接到原核表达载体pGEX-6p-1和pET-32a(+)上,电转化至大肠杆菌XL1-Blue感受态细胞,利用优化后的表达条件大量表达重组蛋白,经亲和层析纯化后通过SDS-PAGE检测蛋白的表达情况。利用GST-RBD融合蛋白作为免疫抗原免疫小鼠制备多克隆抗体,ELISA和Western blot分析抗血清的效价和特异性。PCR鉴定和序列测定结果显示,成功构建了重组载体pGEX-RBD和pET-RBD,在大肠杆菌中实现了GST-RBD和RBD-His融合蛋白的可溶性高效表达。研究获得的多克隆抗体的滴度达到约1∶3000,并具有良好的结合特异性。原核表达的可溶性新型冠状病毒RBD重组蛋白具有良好的免疫原性,为后续制备基因工程抗体奠定了实验基础。 展开更多
关键词 新型冠状病毒 受体结合域 原核表达 融合蛋白 多克隆抗体
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两种表达系统来源新冠病毒RBD蛋白免疫小鼠后的IgG抗体水平对比研究 被引量:2
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作者 胡立强 苏涛 +3 位作者 张勇 杨浩 陶怡然 陶泽 《中国生物化学与分子生物学报》 CAS CSCD 北大核心 2022年第8期1053-1061,共9页
当前新冠肺炎疫情仍在全球蔓延,给中国及世界的公共卫生安全和经济发展带来了严峻挑战。SARS-CoV-2病毒入侵机体的关键过程是刺突蛋白受体结合域RBD通过结合宿主细胞ACE2受体实现感染,而此过程与病原快速检测、疫苗以及药物干预等主要... 当前新冠肺炎疫情仍在全球蔓延,给中国及世界的公共卫生安全和经济发展带来了严峻挑战。SARS-CoV-2病毒入侵机体的关键过程是刺突蛋白受体结合域RBD通过结合宿主细胞ACE2受体实现感染,而此过程与病原快速检测、疫苗以及药物干预等主要抗病毒策略的研究与开发密切相关。因此,本研究旨在比较哺乳细胞和昆虫细胞重组表达来源的新冠病毒刺突蛋白受体结合结构域RBD免疫小鼠后产生IgG抗体水平的变化,评估不同来源和不同剂量抗原的抗体滴度水平和持续时间,希望将有助于疫苗、药物以及病原检测等相关研究。通过SDS-PAGE和质谱技术鉴定出昆虫和哺乳动物细胞表达系统制备的bRBD和hRBD蛋白质的分子量略有差异,主要为糖基化修饰不同所致;流式细胞术检测发现,bRBD和hRBD与ACE2受体过表达细胞结合率分别为88.5%和92.7%,表明二者均具有较好的活性;利用Quick Antibody免疫佐剂通过肌肉注射对Balb/c小鼠进行免疫接种,设置10μg、20μg 2个免疫抗原的剂量,共接种2次,并在初次免疫后第2、4、6、8、12、24周从尾部取血,分离获得血清;酶联免疫吸附结果显示,10μg和20μg的bRBD和hRBD蛋白质免疫均能够快速引起小鼠的免疫反应产生IgG抗体,4~6周抗体滴度达到峰值;2种抗原均具有良好的免疫持久性。2种抗原及2个免疫剂量诱导小鼠产生的抗体滴度无明显差异;血清抗体中和试验发现,bRBD和hRBD蛋白质免疫小鼠后产生的特异性抗体,均能够抑制SARS-COV-2 Spike假病毒对ACE2阳性细胞的感染。这些结果表明,昆虫细胞和哺乳动物细胞表达系统生产的RBD蛋白,通过良好的佐剂接种均能快速引起机体有效的体液免疫应答,产生特异性中和抗体,有望用于各种RBD突变体抗体的制备。 展开更多
关键词 新型冠状病毒 刺突蛋白 受体结合区蛋白 抗体 疫苗
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SARS-CoV-2广谱中和抗体性质鉴定
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作者 陈秀婷 汪毅祯 +2 位作者 商慧娴 王思令 郑子峥 《中国免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2024年第4期693-697,共5页
目的:对严重急性呼吸综合征冠状病毒2(SARS-CoV-2)广谱中和抗体XMA09进行性质鉴定,探究其广谱中和突变株的潜在机制,为SARS-CoV-2的疫苗设计与广谱中和抗体筛选提供参考。方法:通过ExpiCHO真核表达系统与Protein A层析柱表达纯化XMA09蛋... 目的:对严重急性呼吸综合征冠状病毒2(SARS-CoV-2)广谱中和抗体XMA09进行性质鉴定,探究其广谱中和突变株的潜在机制,为SARS-CoV-2的疫苗设计与广谱中和抗体筛选提供参考。方法:通过ExpiCHO真核表达系统与Protein A层析柱表达纯化XMA09蛋白;冷冻电镜技术确定XMA09识别的受体结构域(RBD)上的关键氨基酸位点;间接ELISA与表面等离子共振(SPR)技术检测XMA09对SARS-CoV-2及其突变株Spike蛋白的亲和力;采用基于水疱性口炎病毒(VSV)的假病毒系统检测XMA09对SARS-CoV-2野生型及突变株的中和能力。结果:本研究发现XMA09识别的表位较为保守,对多种突变株Spike蛋白均具有强结合能力,能广谱中和关切突变株(VOCs),包括广泛流行的Omicron亚突变株BA.4/5。结论:XMA09是SARS-CoV-2广谱中和抗体,具有作为SARS-CoV-2治疗性抗体的潜力,并可为SARS-CoV-2的广谱疫苗设计与抗体药物开发提供参考意义。 展开更多
关键词 SARS-CoV-2 受体结合结构域(rbd) 广谱中和抗体
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TGEV-RBD基因在昆虫杆状病毒中的表达及鉴定 被引量:4
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作者 伊立超 李乐天 +6 位作者 郝嘉翼 时小双 张爽 徐鹏 任世斌 高旭 李昌 《动物医学进展》 北大核心 2021年第9期65-70,共6页
旨在获得具有天然结构且有反应原性的猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)受体结合域(RBD)蛋白。受体结合域是决定病毒宿主和嗜性的关键因素。根据猪传染性胃肠炎病毒纤突蛋白(S)序列(GenBank:ABC72414.1),设计、优化并合成其受体结合域(RBD)部分... 旨在获得具有天然结构且有反应原性的猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)受体结合域(RBD)蛋白。受体结合域是决定病毒宿主和嗜性的关键因素。根据猪传染性胃肠炎病毒纤突蛋白(S)序列(GenBank:ABC72414.1),设计、优化并合成其受体结合域(RBD)部分,亚克隆至杆状病毒pFastBacTMDual上,获得重组质粒,命名为pFBD-TGR。将该质粒转化DH10Bac感受态细胞中,筛选较大的白色菌落,获得重组杆状质粒Bacmid-TGR,转染至sf9细胞中进行拯救病毒,转染后5 d~7 d,收上清,传至第3代,应用间接免疫荧光法(IFA)和Western blot检测sf9细胞上清,进行目的蛋白表达鉴定。结果显示,重组穿梭质粒Bacmid-TGR构建成功,Western blot结果证明,杆状病毒表达了TGEV-RBD蛋白且能与Strep tag抗体和抗猪传染性胃肠炎病毒多克隆抗体发生特异性反应,间接免疫荧光结果证明,成功地表达了TGEV-RBD蛋白,为进一步开展猪传染性胃肠炎病毒抗体研究以及新型疫苗的研发奠定了基础。 展开更多
关键词 猪传染性胃肠炎病毒 杆状病毒 受体结合域 蛋白表达
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新型冠状病毒S蛋白RBD肽段的原核表达与纯化 被引量:3
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作者 侯江厚 张灵霞 +2 位作者 黄国红 詹晓燕 杨奕梅 《生物技术通讯》 CAS 2020年第3期292-296,共5页
目的:利用原核系统对新型冠状病毒S蛋白的受体结合域(RBD)肽段进行克隆、表达和纯化,制备高纯度的RBD肽。方法:在RBD肽段N端加入肠激酶位点序列(DDDDK),对应的核酸序列参照原核系统表达偏好进行全基因合成,构建pET-DsbC-RBD融合表达载体... 目的:利用原核系统对新型冠状病毒S蛋白的受体结合域(RBD)肽段进行克隆、表达和纯化,制备高纯度的RBD肽。方法:在RBD肽段N端加入肠激酶位点序列(DDDDK),对应的核酸序列参照原核系统表达偏好进行全基因合成,构建pET-DsbC-RBD融合表达载体,通过原核表达和亲和纯化获得DsbC-RBD融合蛋白,用肠激酶对融合蛋白进行酶切和二次亲和纯化,获得高纯度新冠病毒S蛋白RBD肽。结果:构建了pET-DsbC-RBD表达载体,融合蛋白DsbC-RBD在大肠杆菌中实现了高效表达,经亲和层析纯化,重组融合蛋白DsbC-RBD相对分子质量为58×103,纯度约90%。用肠激酶对融合蛋白进行酶切,酶切效率近100%,通过二次亲和纯化获得了RBD肽,相对分子质量为25×103,纯度92%以上。结论:利用原核表达系统获得可溶性DsbC-RBD融合蛋白,采用亲和纯化和肠激酶酶切联用的方法制备获得高纯度的新冠病毒S蛋白RBD肽,为后续抗体制备和抗病毒药物筛选奠定了基础。 展开更多
关键词 新型冠状病毒S蛋白 受体结合域(rbd) 原核表达 肠激酶 纯化
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糖基化修饰对新型冠状病毒刺突蛋白受体结合区(Spike RBD)与受体ACE2结合影响的非变性质谱研究 被引量:1
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作者 罗宇翔 黄静 李惠琳 《质谱学报》 EI CAS CSCD 北大核心 2022年第6期687-696,I0003,共11页
新型冠状病毒肺炎(新冠)疫情给人类生命安全和社会发展带来巨大威胁。新冠病毒表面的刺突(spike)蛋白受体结合区域(RBD)和宿主细胞膜表面的血管紧张素转化酶2(ACE2)结合是病毒入侵的关键步骤。表征RBD和ACE2结合时的结构基础和动态变化... 新型冠状病毒肺炎(新冠)疫情给人类生命安全和社会发展带来巨大威胁。新冠病毒表面的刺突(spike)蛋白受体结合区域(RBD)和宿主细胞膜表面的血管紧张素转化酶2(ACE2)结合是病毒入侵的关键步骤。表征RBD和ACE2结合时的结构基础和动态变化有利于理解病毒入侵的机制,为药物研发提供思路。结构质谱是蛋白质结构表征中广泛应用的方法,本工作通过非变性质谱(native MS)研究糖蛋白RBD和ACE2样品及其复合物。首先,优化了使用PNGase F切除RBD N-糖时的条件,对切糖后RBD蛋白的异质性进行分析,并进一步考察了切糖前后RBD与ACE2形成蛋白复合物的稳定性。结果表明,RBD N-糖的切除会导致其与ACE2形成的复合物稳定性降低。本工作可为RBD的N-糖基化作用分析提供参考,并为后续实验RBD是否需要切N-糖处理提供指导建议。 展开更多
关键词 新型冠状病毒肺炎(COVID-19) 刺突蛋白 受体结合区域(rbd) 血管紧张素转化酶2(ACE2) 糖蛋白 N-糖酰胺酶F 非变性质谱
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Therapeutic Implications of Monoclonal Antibody
8
作者 Mohammad Shane Alam Farhana Riyaz Shah +3 位作者 Muntser Mohammad Fadoul Alhassen Saif Elden B. Abdalla Abdul Mateen Md. Shakir Ahmad 《Journal of Biosciences and Medicines》 CAS 2023年第3期85-104,共20页
Background: The coronavirus disease 2019 (COVID-19) pandemic is a distinct public health issue that calls for the quick development of novel treatments and viral detection. Due to their high specificity and reliabilit... Background: The coronavirus disease 2019 (COVID-19) pandemic is a distinct public health issue that calls for the quick development of novel treatments and viral detection. Due to their high specificity and reliability, monoclonal antibodies (mAbs) have emerged as useful diagnostic and therapeutic tools for a variety of diseases. As a result, several scientists have jumped right into developing Ab-based assays for the identification of SARS-CoV-2 and Ab drugs for use as COVID-19 therapy agents. Since the receptor-binding domain (RBD) of the SARS-CoV-2 spike protein is essential for viral infection and has a known precise structure, it has become a key target for the creation of therapeutic antibodies. The use of Ab cocktails is anticipated to be a key component of an efficient COVID-19 treatment plan since SARS-CoV-2 is an RNA virus with a high mutation rate, particularly when subjected to the selection pressure of aggressively applied preventive vaccinations and neutralizing Abs. Furthermore, SARS-CoV-2 infection could provoke an overzealous immune response, leading to a cytokine storm that accelerates the onset of a severe disease. Abs to counteract cytokine storms are also actively being researched as COVID-19 therapies. Abs are now used in SARS-CoV-2 detection assays, including immunoglobulin and antigen tests, in addition to their use as medicines. In order to stop the spread of COVID-19, such Ab-based detection tests are essential surveillance tools. In this article, we’ll go over several important ideas related to mAb-based COVID-19 pandemic detection tests and treatments. Objective: To understand the role of hybridoma technology in therapeutic implications. 1) To study the basic concepts and options in hybridoma technology;2) To study the applications of hybridoma technology;3) To explore how hybridoma technology is applied in diagnostic histopathology. Method: For this method generally there is use of mouse or mammals are transfect with the Ags to find out the formation of antibody afterwards isolate the antibody which has been formed after injecting the antigens for a number of weeks. Following are the steps for mAbs: Step 1: In this step immunization of mouse is done;Step 2: Spleen is used for the isolation of B cells;Step 3: Cultivation of cancerous cells;Step 4: Merging of B cells with Myeloma cells;Step 5: This step cell lines are separated;Step 6: in the next step screening the suitable cell lines;Step 7: observation of multiplication in vitro as well as in vivo;Step 8: Harvesting. Discussion: Now a day there are many diseases which has been cured easily at the mean time it’s very difficult to diagnose and get the treatment. Due to advancement of monoclonal antibodies are used in the diagnosis and treatments such as COVID-19, SARS and SARS COV-2. Therefore important part of the monoclonal antibodies are its used in the diagnosis as well as in the treatment tools. 展开更多
关键词 Monoclonal Antibody Cancerous Cell receptor-binding domain (rbd) Immune System SARS-CoV-2 and COVID-19
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信号肽对SARS-CoV-2 S1、RBD、RBD二聚体蛋白在Expisf9昆虫细胞中分泌表达的影响
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作者 吴清胜 李媛媛 姚春萍 《中国生物制品学杂志》 CAS CSCD 2024年第3期280-286,共7页
目的比较不同信号肽对SARS-CoV-2 S1、受体结合域(receptor binding domain,RBD)、RBD二聚体蛋白在Expisf9昆虫细胞中分泌表达的影响。方法选取SARS-CoV-2 S1(M1-E661)、RBD(R319-P545)、RBD二聚体(R319-K537串联)3种蛋白的基因序列,按... 目的比较不同信号肽对SARS-CoV-2 S1、受体结合域(receptor binding domain,RBD)、RBD二聚体蛋白在Expisf9昆虫细胞中分泌表达的影响。方法选取SARS-CoV-2 S1(M1-E661)、RBD(R319-P545)、RBD二聚体(R319-K537串联)3种蛋白的基因序列,按照N-端信号肽序列不同[内源(Endo)、蜂素honeybee melittin(HBM)、GP64、GP67、几丁质酶chitinase(Chi)、HIV-ENV]和C-端标签序列的不同,分为25组。通过Bac-to-Bac系统构建25种重组杆状病毒,建立25组三级毒种库。将B2和C4病毒分别接种至对数生长前期细胞(2.8×10^(6)个/mL)和对数生长中期细胞(1.2×10^(7)个/mL)。将各组病毒培养至100 mL(500 mL摇瓶),进行蛋白表达,并取样进行SDS-PAGE、Western blot和ELISA检测。S1、RBD、RBD二聚体蛋白各选择表达量较高的2组,进行重复验证。结果B2、C4病毒接种至高密度细胞,分泌表达量未提高,接毒后培养4和5 d的分泌表达量存在显著差异。A7(Endo-S1-tag)的分泌表达量明显低于A9(HIV-ENV-S1-tag),A4(Gp67-S1-tag)分泌表达量最高,A1(Endo-Endo-S1-tag)分泌表达量显著低于A7(Endo-S1-tag);B6(HIV-ENV-RBD-tag)分泌表达量显著高于B4(Gp67-RBD-tag)及其他信号肽组;C4(Gp67-RBD-dimer-tag)分泌表达量明显高于C3(Gp64-RBD-dimer-tag)。分别选择每种蛋白表达量较高的2组(A4、A9;B4、B6;C3、C4)进行重复验证确定,结果显示,A4、B6、C4的分泌表达量最高。结论S1、RBD二聚体蛋白分泌表达量最高的信号肽相同,是GP67信号肽,而RBD蛋白的最适信号肽是HIV-ENV信号肽。表明N-端序列会影响蛋白的分泌,信号肽序列有一定的通用性,但也与要表达的目的蛋白序列有关。 展开更多
关键词 信号肽 分泌表达 SARS-CoV-2 S1蛋白 受体结合域 杆状病毒-昆虫细胞系统
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PDT/GR-ΔLBD融合蛋白的表达、纯化及穿膜特性的鉴定 被引量:1
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作者 张方 施毅 +2 位作者 李子玲 胡波 宋勇 《解放军医学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2011年第1期27-30,共4页
目的构建穿膜肽(PDT)和缺失结合配体结构域的小鼠糖皮质激素受体(GR-ΔLBD)融合基因表达载体,经原核表达、纯化后,进行穿膜特性的鉴定。方法质粒pEGFP-GR-ΔLBD经双酶切,获得目的基因片段GR-ΔLBD,将该基因片段亚克隆入原核表达载体pGEX... 目的构建穿膜肽(PDT)和缺失结合配体结构域的小鼠糖皮质激素受体(GR-ΔLBD)融合基因表达载体,经原核表达、纯化后,进行穿膜特性的鉴定。方法质粒pEGFP-GR-ΔLBD经双酶切,获得目的基因片段GR-ΔLBD,将该基因片段亚克隆入原核表达载体pGEX-PDT,获得pGEX-PDT/GR-ΔLBD融合基因表达载体。将表达载体转化大肠杆菌,经IPTG诱导表达、谷胱甘肽-琼脂糖树脂处理、谷胱甘肽洗脱液洗脱后,获得PDT/GR-ΔLBD融合蛋白,SDS-PAGE分析融合蛋白;采用荧光素FITC体外标记PDT/GR-ΔLBD融合蛋白(终浓度分别为0、500、1000nmol/L),与小鼠肺上皮细胞TC-1共培养2h,在荧光显微镜下观察其穿膜特性。结果成功构建了融合基因原核表达载体pPDT/GR-ΔLBD,并能表达蛋白产物,大小约78.6kD,与融合蛋白PDT/GR-ΔLBD的理论计算值(80kD)相符。随着PDT/GR-ΔLBD浓度的增加,进入TC-1上皮细胞的PDT/GR-ΔLBD明显增多,并可在胞核中浓聚。结论 PDT/GR-ΔLBD融合蛋白具有良好的可溶性和穿膜特性,为进一步研究PDT/GR-ΔLBD融合蛋白在抗炎过程中的作用奠定了基础。 展开更多
关键词 受体 糖皮质激素 配体结合结构域 胞间信号肽类和蛋白质类 人工基因融合
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SARS冠状病毒S蛋白受体结合域的克隆测序
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作者 高俊 肖洪广 林勇平 《广州医药》 2006年第5期49-52,共4页
目的从来源于人和果子狸的SARS冠状病毒S蛋白基因中,获得受体结合域(RBD)基因的克隆。方法用PCR方法扩增RBD基因,将其克隆到pGEM-T Easy载体,转化后挑取阳性克隆进行酶切和测序鉴定,并分析RBD基因序列。结果获得了人和果子狸来源的RBD... 目的从来源于人和果子狸的SARS冠状病毒S蛋白基因中,获得受体结合域(RBD)基因的克隆。方法用PCR方法扩增RBD基因,将其克隆到pGEM-T Easy载体,转化后挑取阳性克隆进行酶切和测序鉴定,并分析RBD基因序列。结果获得了人和果子狸来源的RBD的基因片段,长度为579 bp,两者具有高度的同源性。结果RBD是SARS冠状病毒与靶细胞结合的部位,本工作成功克隆了SARS冠状病毒的RBD基因,为该基因的表达和功能研究奠定了基础。 展开更多
关键词 SARS冠状病毒 受体结合域 克隆 测序
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PEDV-RBD基因在昆虫杆状病毒中的表达与鉴定 被引量:3
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作者 伊立超 李乐天 +6 位作者 郝嘉翼 时小双 张爽 高子函 金宁一 娄安钢 李昌 《中国兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2021年第9期1710-1715,1733,共7页
受体结合域是决定病毒侵入宿主及其嗜性的关键因素。该研究目的在于获得具有天然构象且反应原性良好的猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)的受体结合域(receptor-binding domain,RBD)蛋白。根据PEDV S蛋白序列(Gen... 受体结合域是决定病毒侵入宿主及其嗜性的关键因素。该研究目的在于获得具有天然构象且反应原性良好的猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)的受体结合域(receptor-binding domain,RBD)蛋白。根据PEDV S蛋白序列(GenBank登录号:AKN45969.1),设计、优化并合成其RBD部分基因序列,并将其亚克隆至杆状病毒双表达载体pFastBacTMDual上,得到了重组质粒pFBD-PER。将pFBD-PER转化到大肠杆菌DH10BacTM感受态细胞中,进行蓝白斑筛选,获得重组杆状质粒Bacmid-PER,通过脂质体转染至Sf9细胞中进行病毒拯救。转染120 h后,收取上清病毒液,盲传3代后收取Sf9细胞,利用间接免疫荧光法(IFA)及Western blot确定PEDV-RBD蛋白是否表达。结果显示,重组质粒pFBD-PER酶切验证正确,重组杆粒Bacmid-PER成功构建,杆状病毒能够表达PEDV-RBD蛋白,且能与strep tag抗体发生特异性反应。IFA鉴定出现特异性绿色荧光。结果表明,成功表达了PEDV-RBD蛋白且具有反应原性,为深入开展PEDV抗体制备、新型疫苗研发奠定基础。 展开更多
关键词 猪流行性腹泻病毒 S蛋白 杆状病毒 受体结合域 蛋白表达
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功能性新型冠状病毒RBD结构域在毕赤酵母表面的展示
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作者 于璐 胡暄 +2 位作者 张小鹃 牛安娜 张晓鹏 《中国生物工程杂志》 CAS CSCD 北大核心 2022年第6期30-38,共9页
目的:设计并构建新型冠状病毒(SARS-CoV-2)受体结合结构域(receptor binding domain,RBD)在毕赤酵母表面的展示体系,并对表面展示的RBD进行功能性评价,从而为以RBD为靶点的高通量药物筛选平台奠定基础。方法:将四种锚定分子与新冠病毒RB... 目的:设计并构建新型冠状病毒(SARS-CoV-2)受体结合结构域(receptor binding domain,RBD)在毕赤酵母表面的展示体系,并对表面展示的RBD进行功能性评价,从而为以RBD为靶点的高通量药物筛选平台奠定基础。方法:将四种锚定分子与新冠病毒RBD融合,电转化至毕赤酵母中;通过细胞免疫荧光分析,筛选能够成功展示RBD的锚定系统;进一步分析其与血管紧张素转化酶2(angiotensin-converting enzyme 2,ACE2)受体的亲和力,证明展示在细胞表面RBD分子的功能。结果:仅Sed1p锚定分子能够有效呈递RBD至毕赤酵母细胞表面,展示效率约为70%;亲和力分析结果表明,ACE2受体和表面展示RBD的亲和力(K_(D)=30.42 nmol/L)与溶液中RBD的亲和力(K=16.00 nmol/L)较为接近。结论:这一体系能够在毕赤酵母表面高效地展示具有生物学功能的RBD,可用于抗新冠病毒RBD药物的高通量筛选和评价。 展开更多
关键词 表面展示 新型冠状病毒 毕赤酵母 受体结合结构域 亲和力
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新型冠状病毒S蛋白RBD区的重组猫疱疹病毒的构建及鉴定
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作者 王凤杰 周鑫韬 +4 位作者 齐宇 韩桪 蒋依倩 陈腾 扈荣良 《黑龙江畜牧兽医》 CAS 北大核心 2022年第23期72-77,135,共7页
为了开发一种猫用新型冠状病毒(SARS-CoV-2)重组猫疱疹病毒活载体疫苗,试验以猫疱疹病毒Ⅰ型(FHV-Ⅰ)为病毒载体,采用同源重组技术将亲本病毒FHV-Z的gI和gE基因替换为SARS-CoV-2刺突蛋白(S蛋白)的受体结合域(RBD)和增强型绿色荧光蛋白(E... 为了开发一种猫用新型冠状病毒(SARS-CoV-2)重组猫疱疹病毒活载体疫苗,试验以猫疱疹病毒Ⅰ型(FHV-Ⅰ)为病毒载体,采用同源重组技术将亲本病毒FHV-Z的gI和gE基因替换为SARS-CoV-2刺突蛋白(S蛋白)的受体结合域(RBD)和增强型绿色荧光蛋白(EGFP蛋白)串联表达盒;利用Overlap PCR方法构建包含RBD-EGFP串联表达盒的重组质粒pUC19-RBD-EGFP,并用该重组质粒与FHV-Z基因组共同转染F81细胞,通过有限稀释法和绿色荧光病变灶筛选完成重组病毒rFHV-RBD的纯化;经PCR、测序、间接免疫荧光试验(IFA)和Western-blot方法分析重组病毒rFHV-RBD;用1×10^(7.0)TCID_(50)/mL的重组病毒rFHV-RBD滴鼻免疫猫,利用ELISA方法监测免疫后第0,7,14,21天猫体内特异性抗RBD抗体变化情况。结果表明:试验成功拯救了重组病毒rFHV-RBD,该重组病毒连续传代15代仍能检测到RBD-EGFP串联表达盒,遗传稳定性较好,重组病毒rFHV-RBD的生长特性与亲本病毒FHV-Z无明显差异,能够在重组病毒感染的F81细胞中正确表达S-RBD蛋白,滴鼻免疫猫后第21天特异性抗RBD抗体极显著升高(P<0.01)。说明试验获得的重组病毒rFHV-RBD具有良好的免疫原性,可用于开展猫新型冠状病毒肺炎疫苗的研究。 展开更多
关键词 新型冠状病毒 刺突蛋白 受体结合域 猫疱疹病毒Ⅰ型 免疫原性
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抗SARS-CoV-2刺突糖蛋白受体结合域单链抗体的筛选及鉴定 被引量:1
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作者 金佳佩 蔡雪飞 《中国生物制品学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2023年第3期295-305,共11页
目的 构建抗严重急性呼吸综合征冠状病毒2(severe acute respiratory syndrome coronavirus 2,SARS-Co V-2)刺突糖蛋白(spike protein,S)受体结合域(receptor-binding domain,RBD)的单链抗体(single-chain fragment variable,scFv)噬菌... 目的 构建抗严重急性呼吸综合征冠状病毒2(severe acute respiratory syndrome coronavirus 2,SARS-Co V-2)刺突糖蛋白(spike protein,S)受体结合域(receptor-binding domain,RBD)的单链抗体(single-chain fragment variable,scFv)噬菌体展示文库,筛选特异性scFv,并进行功能鉴定。方法 提取RBD蛋白免疫小鼠的脾细胞m RNA,逆转录为c DNA,以其为模板扩增scFv的重链可变区(hight chain fragment of variable,VH)和轻链可变区(light chain fragment of variable,VL)基因,经过重叠延伸PCR扩增(splicing overlap extension PCR,SOE-PCR)组装为scFv基因片段。将scFv基因片段插入噬菌体载体,构建scFv噬菌体展示文库。经4轮生物淘洗,筛选出与RBD结合能力较强的scFv基因,进行重组表达、纯化和生物活性鉴定。结果 构建的scFv噬菌体文库滴度为6.0×10^(11)pfu/m L。经4轮生物淘选后,共筛选出4株与RBD结合较强的scFv,分别为scFv11、scFv12、scFv25、scFv28。scFv相对分子质量约为27 000,多以包涵体形式存在,纯化后可与HRP标记的鼠抗His单克隆抗体发生特异性结合,浓度达2.4 mg/m L,纯度约90%。4株scFv均可与RBD重组蛋白发生特异性结合;除scFv28外,其他3株scFv均可与野生型和多突变株S蛋白结合;与RBD均存在剂量依赖性相互作用,亲和力动态拟合解离常数(K_(D))分别为8.9、5.92、10.67、2.36 nmol/L,稳态拟合解离常数(K_(D))分别为5.3、6.5、8.7、5.8 nmol/L;scFv11、scFv12和scFv25可同时识别3个独立的RBD多肽,包括RBD2(S^(334~353))、RBD9(S^(439~458))和RBD13(S^(499~518));在线服务器SWISS-MODEL对scFv进行同源建模的模型质量良好,可用于分子对接;scFv11及人肺泡上皮细胞表面血管紧张素转换酶2(human angiotensin converting enzyme 2,ACE2)与RBD相互作用的界面仅部分重合,scFv12和scFv25与RBD的相互作用界面和ACE2与RBD相互作用界面存在较大差异。结论 本研究通过构建抗SARS-Co V-2 RBD的scFv噬菌体文库,筛选并制备了可与SARS-Co V-2 RBD特异结合的scFv,为进一步抗SARS-Co V-2药物和检测试剂的研发提供了实验依据。 展开更多
关键词 严重急性呼吸综合征冠状病毒2 单链抗体 刺突糖蛋白 受体结合域 噬菌体文库
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表达SARS-CoV-2 Delta突变株S蛋白受体结合域和N蛋白的重组腺病毒的构建及鉴定
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作者 宋泽鑫 周艳 +5 位作者 林晓晨 赵永美 施鹏 王学付 张朝武 李鸿钧 《中国生物制品学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2023年第9期1025-1031,共7页
目的构建表达严重急性呼吸综合征冠状病毒2(severe acute respiratory symptom coronavirus 2,SARS-CoV-2)Delta突变株S蛋白受体结合域(receptor binding domain,RBD)和N蛋白的重组腺病毒,并进行鉴定。方法将SARSCoV-2 RBD和N基因片段... 目的构建表达严重急性呼吸综合征冠状病毒2(severe acute respiratory symptom coronavirus 2,SARS-CoV-2)Delta突变株S蛋白受体结合域(receptor binding domain,RBD)和N蛋白的重组腺病毒,并进行鉴定。方法将SARSCoV-2 RBD和N基因片段分别克隆至pcDNA3.0BA载体上,构建重组质粒pcDNA3.0BA-RBD-N,PCR扩增RBD-CMVN片段,连接至穿梭载体pShuttle-CMV上,将穿梭质粒pShuttle-RBD-N与pAdeasy-1进行同源重组,获得重组质粒pAdeasy-1-RBD-N,转染HEK293细胞进行重组腺病毒Ad-RBD-N包装,RT-PCR法检测重组腺病毒中RBD和N基因在HEK293细胞中的转录,Western blot和免疫荧光法检测重组腺病毒中RBD和N蛋白的表达。将Ad-RBD-N通过肌肉注射免疫12只雌性BALB/c小鼠,免疫剂量为5×10^(9)copies/只,免疫后14 d经尾静脉采血,ELISA法检测血清抗体效价。结果重组腺病毒RBD和N基因能在HEK293细胞中正常转录,RBD和N蛋白能在MA104细胞中正常表达。免疫重组腺病毒的小鼠可产生针对RBD和N蛋白的特异性IgG抗体。结论成功构建了表达SARS-CoV-2 Delta突变株S蛋白RBD和N蛋白的重组腺病毒,为Delta突变株疫苗的后续研究奠定了基础。 展开更多
关键词 严重急性呼吸综合征冠状病毒2 S蛋白 受体结合域 N蛋白 腺病毒
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基于多肽阵列技术构建穿膜肽靶向抑制Fyn与突触后致密物蛋白95相互作用的实验研究 被引量:3
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作者 杨秀环 马彤彤 +4 位作者 李舒愉 贾济 彭捷 陆建华 屠伟峰 《国际麻醉学与复苏杂志》 CAS 2016年第10期865-870,共6页
目的探讨基于多肽阵列技术合成的穿膜肽离体条件下抑制非受体酪氨酸激酶Fvn与突触后致密物蛋白(postsynaptic density protein,PSD)95相互作用,进而抑制含N-甲基-D-天冬氨酸受体2B亚基(N-methyl D-aspartate receptor subtype2B,N... 目的探讨基于多肽阵列技术合成的穿膜肽离体条件下抑制非受体酪氨酸激酶Fvn与突触后致密物蛋白(postsynaptic density protein,PSD)95相互作用,进而抑制含N-甲基-D-天冬氨酸受体2B亚基(N-methyl D-aspartate receptor subtype2B,NR2B)的N-甲基-D-天冬氨酸受体(N-methyl D-aspartate receptor,NMDAR)过度磷酸化,减轻慢性疼痛的可行性。方法①通过多肽阵列技术的overlapping平台确定Fyn的SH2结构域与PSD95的PDZ3结构域相互作用的结合基序,合成含此结合基序的短肽FynP,并与人类免疫缺陷病毒human immunodeficiencv virus,HIV).Tat蛋白转导结构域连接形成可进入细胞的穿膜肽FynP-Tat,同时合成乱序穿膜肽mFynP-Tat。②原代培养sD大鼠胎鼠脊髓背角神经元,通过免疫荧光检测不同浓度组(10、20、30μmol/L)多肽内化细胞的效率。③用CCK8法检测不同浓度(10、20、100μmol/L)穿膜肽分别孵育神经细胞(6、24、48h)的细胞毒性。④将神经细胞分为穿膜肽组(FynP-Tat组)、乱序穿膜肽组(mFynP-Tat组)和PBS组(对照组)进行孵育,用谷胱甘肽转移酶(glutathione S-transferase,GST)pull-down和Western blot验证抑制Fvn与PSD95相互作用的效率。结果①通过overlapping确定Fyn与PSD95相互作用的结合基序为KGAYSL。②与FynP-Tat10μmol/L组[(77.3±1.4)%]比较,FvnP-Tat20μmol/L组[(91.5±2.0)%]和FvnP-Tat30μmol/L组[(93.4±2.2)%]的内化效率较高,差异有统计学意义(P〈0.05);与mFynP-Tat10μmol/L组[(75.0±3.6)%]比较,mFynP-Tat20μmol/L组[(91.4±1.3)%]和mFynP-Tat30μmol/L组[(92.7±2.1)%]的内化效率较高,差异有统计学意义(P〈0.05);③与FynP-Tat(100μmol/L,6h)组[(82.5±3.0)%]比较,FynP.Tat(100μmol/L,24h)组和FynP-Tat(100μmol/L,48h)组细胞活力[(75.1±1.5)%和(68.5±1.2)%]降低(P〈0.05);与mFynP-Tat(100μmol/L,6h)组[(83.3±2.0)%]比较,mFynP-Tat(100μmol/L,24h)组和mFynP-rat(100μmol/L,48h)组细胞活力[(75.6±2.9)%和(68.1±0.7)%]降低(P〈0.05);④与mFynP-Tat组、PBS组比较结果显示,FvnP-Tat能够抑制PSD95结合到GST-Fyn融合蛋白上(P〈0.05),但不会抑制PSD95结合到GST-NR2B融合蛋白上(P〉0.05)。结论离体条件下,基于多肽阵列技术合成的穿膜肽FvnP-Tat能够进入神经细胞,细胞毒性低,可有效抑制Fyn与PSD95的相互作用。 展开更多
关键词 蛋白转导结构域 N-甲基-D-天冬氨酸受体2B亚基 多肽阵列 结合基序
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表达人冠状病毒NL63棘突蛋白不同片段的重组痘苗病毒的制备与表达分析 被引量:1
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作者 赵国霞 周为民 +6 位作者 陆柔剑 王惠娟 赵敏 张庭瑛 邓瑶 高基民 谭文杰 《病毒学报》 CAS CSCD 北大核心 2011年第3期250-256,共7页
HCoV-NL63是新近发现的人冠状病毒,对其外膜糖蛋白-棘突蛋白的表达及功能的研究仍有待深入。本研究利用天坛株痘苗病毒载体,克隆构建可表达HCoV-NL63棘突蛋白四个片段(N端棘突蛋白:S1;C端棘突蛋白:S2;受体结合区大片段:RL;受体结合区小... HCoV-NL63是新近发现的人冠状病毒,对其外膜糖蛋白-棘突蛋白的表达及功能的研究仍有待深入。本研究利用天坛株痘苗病毒载体,克隆构建可表达HCoV-NL63棘突蛋白四个片段(N端棘突蛋白:S1;C端棘突蛋白:S2;受体结合区大片段:RL;受体结合区小片段:RS)的重组痘苗病毒(vJSC1175-S1;vJSC1175-S2;vJSC1175-RL;vJSC1175-RS),酶切测序证实表达载体构建正确,免疫荧光分析(IFA)各重组痘苗病毒中棘突蛋白不同片段的表达与定位,Western-Blot分析表明各种重组蛋白表达正确。分析结果显示:4种重组蛋白均能有效表达,S1、RL及RS蛋白的荧光主要分布在细胞膜上,而S2蛋白的荧光则主要分布于细胞浆,各个片段的分子量大小与文献报道相同,并可进行正确的翻译修饰(糖基化)。本研究首次采用痘苗病毒天坛株载体构建制备了表达HCoV-NL63棘突蛋白不同片段的重组痘苗病毒,为进一步分析人冠状病毒HCoV-NL63棘突蛋白的结构功能及探索其抗原性和免疫原性奠定了基础。 展开更多
关键词 人冠状病毒NL63 棘突蛋白 受体结合区 重组痘苗病毒 表达
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人冠状病毒NL63受体结合区蛋白的原核表达纯化与鉴定 被引量:2
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作者 常慧 伊瑶 +7 位作者 赵敏 周为民 赵国霞 王慧娟 毕胜利 高基民 刘冰 谭文杰 《病毒学报》 CAS CSCD 北大核心 2013年第2期106-111,共6页
人冠状病毒NL63受体结合区蛋白是其免疫学诊断和疫苗研究的主要靶点,在受体吸附、病毒进入细胞及膜融合中起关键作用。本研究在E.coli系统中进行人冠状病毒NL63受体结合区(RBD)大、小蛋白的表达纯化,并对其进行免疫学鉴定。首先密码子... 人冠状病毒NL63受体结合区蛋白是其免疫学诊断和疫苗研究的主要靶点,在受体吸附、病毒进入细胞及膜融合中起关键作用。本研究在E.coli系统中进行人冠状病毒NL63受体结合区(RBD)大、小蛋白的表达纯化,并对其进行免疫学鉴定。首先密码子优化设计合成了HCoV-NL63的RBD大片段(RL:232-684aa)与小片段(RS:476-616aa)的编码基因,并将其克隆进硫氧还蛋白表达载体pM48,构建了人冠状病毒NL63的受体结合区蛋白(RBD)大(RL)、小(RS)片段与硫氧还蛋白的融合表达质粒;转化E.coli BL21pLys S,利用IPTG进行诱导表达,用镍亲和层析对蛋白进行纯化,并以表达HCoV-NL63RL与RS蛋白的重组痘苗病毒免疫小鼠血清对重组蛋白进行免疫印迹鉴定。结果表明在37℃,0.8mM IPTG诱导4h时,蛋白表达量达到最高,融合蛋白主要以包涵体形式表达,纯化后纯度可达95%以上。Western blot显示,两个融合蛋白均与痘苗病毒(天坛株)表达的HCoV-NL63RL与RS蛋白免疫的小鼠血清发生特异性反应。本研究首次在国内用原核系统表达纯化并鉴定了人冠状病毒NL63受体结合区大小蛋白(RL和RS),为人冠状病毒NL63感染的免疫学检测与疫苗研究提供了基础。 展开更多
关键词 HCoV NL63 受体结合区蛋白 重组蛋白 表达 大肠杆菌
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血必净注射液调节线粒体N-甲酰肽/NLRP3炎症通路对重症急性胰腺炎大鼠模型的治疗机制 被引量:6
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作者 肖懿 冯志乔 +5 位作者 张桂贤 沈洪昇 李文畅 李霞 高瑞芳 刘洪斌 《中国实验方剂学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2022年第7期88-94,共7页
目的:探讨血必净注射液(XBJ)对牛磺胆酸钠(Na-Tc)诱导重症急性胰腺炎(SAP)大鼠模型的治疗作用。方法:将40只大鼠随机均分为5组,分别为假手术组、SAP模型组、XBJ低、中、高剂量组(4、8、12 mL·kg·d^(-1))。以胆胰管内逆行注射N... 目的:探讨血必净注射液(XBJ)对牛磺胆酸钠(Na-Tc)诱导重症急性胰腺炎(SAP)大鼠模型的治疗作用。方法:将40只大鼠随机均分为5组,分别为假手术组、SAP模型组、XBJ低、中、高剂量组(4、8、12 mL·kg·d^(-1))。以胆胰管内逆行注射Na-Tc(1 mL·kg^(-1))制备SAP模型,XBJ在造模前3 d和造模后0.5 h进行腹腔注射给药。测量大鼠腹水量和胰腺组织湿质量比;采用苏木素-伊红(HE)染色观察胰腺组织病理变化;采用免疫组化检测胰腺组织甲酰肽受体1(FPR1)和核苷酸结合寡聚化结构域样受体3(NLRP3)的蛋白表达水平;采用蛋白免疫印迹法(Western blot)检测大鼠血浆中NADH-泛素氧化还原酶链1~6(MT-ND1、MT-ND2、MT-ND3、MT-ND4、MT-ND5、MT-ND6)的表达情况。结果:与假手术组比较,SAP模型组腹水量和胰腺湿质量比明显增加(P<0.05),胰腺组织病变严重,病理总评分明显上升(P<0.05),胰腺组织FPR1和NLRP3表达明显增多(P<0.05),血浆中MT-ND2表达明显降低(P<0.05),MT-ND1、MT-ND3和MT-ND6均明显增加(P<0.05),MT-ND4和MT-ND5无明显变化;与SAP模型组比较,XBJ各剂量治疗组大鼠腹水量和胰腺湿质量比显著减少(P<0.01),胰腺病变均有不同程度地改善,且胰腺组织FPR1和NLRP3表达均显著降低(P<0.01),血浆中MT-ND1、MT-ND3和MT-ND6表达均显著下降(P<0.01),MT-ND4表达下降,其中XBJ高剂量组尤甚(P<0.01),MT-ND5表达差异无统计学意义。结论:血必净注射液可有效治疗大鼠SAP,其机制可能与拮抗部分线粒体N-甲酰肽和FPR1/NLRP3介导的过度炎症反应相关。 展开更多
关键词 重症急性胰腺炎 血必净注射液 线粒体N-甲酰肽 甲酰肽受体1 核苷酸结合寡聚化结构域样受体3 血府逐瘀汤
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