应用荧光法测定重组细胞因子中残余DNA含量

目的:建立荧光微量 DNA 含量测定方法,用于重组细胞因子的质量控制。方法:应用 PicoGreen 荧光试剂与 DNA 结合能产生可激发荧光的复合物、再用荧光酶标仪对复合物进行检测并用 SOFTmaxPRO 分析软件进行分析。结果:该荧光法 DNA检测灵敏度达到312 pg·mL^(-1),DNA 含量在0.31～80n·mL^(-1)范围内线性良好,r≥0.996。应用该法对7种重组细胞因子共13批制品的外源 DNA 含量进行测定,结果表明:除重组人 BMP 和 IL-11以外,其它重组细胞因子 DNA 含量均小于10ng·剂量^(-1),与地高辛标记的 DNA 杂交试验结果基本一致。结论:该方法具有简便、快速、自动化程度高等特点,可用于重组细胞因子残余外源 DNA 含量的常规检定。

重组DNA技术在昆虫学中的应用

重组DNA技术即基因工程,亦为人们称做基因克隆或基因操作。重组DNA技术已被应用于昆虫学的基础研究和应用研究中。本文首先对重组DNA技术及基因转移技术(在昆虫学研究中与重组DNA技术配合应用的重要手段)作一简述,然后着重介绍这些技术在昆虫学研究中的应用概况。 重组DNA技术 重组DNA技术就是将DNA从细胞中分离出来,切割成片段,与载体DNA连接,形成重组DNA分子,然后导入宿主细胞,进行复制。

基于基因库和DNA重组技术的带钢层流冷却系统多目标优化

针对层流冷却系统粗调区目标卷取温度和给定冷却速率的二维多目标优化问题,提出基于基因库和DAN重组技术优化的多目标遗传算法来获取粗调区集管的最佳开闭模式群。该算法利用Pareto前沿面的交集建立基因库,从中挖掘出集管开闭的较优模式,将其耦合至下一代种群,最大限度地消除了种群进化的随机性和漫游性。基因库的优胜劣汰机制,有利于保持种群个体在搜索空间的分布多样性,使算法可以在更广阔的空间搜索出更佳的集管开闭模式。基因库的随机抓取策略保证了Pareto前沿面在全局搜索空间的均匀分布性,增强了控制系统对多目标的均衡控制能力。最后,基于DNA重组技术强力驱动算法收敛于基于全局的最优目标解群,极大限度地提高了控制系统的控制精度。编写了基于微软基类库的仿真程序,仿真结果验证了该多目标优化策略的先进性。

NMM抗肿瘤DNA疫苗原液大肠杆菌菌体蛋白质残留量检测方法的建立与验证

目的建立并验证检测NMM抗肿瘤DNA疫苗原液中大肠杆菌菌体蛋白质残留量的双抗体夹心ELISA试验方法。方法使用双抗体夹心ELISA试验方法检测NMM抗肿瘤DNA疫苗原液中大肠杆菌菌体蛋白残留量,采用四参数logstic曲线进行回归分析,并对该方法的专属性、检测限、定量限、线性与范围、精密度、准确度、耐用性等进行验证,验证通过对5批样品进行检测。结果采用双抗体夹心ELISA试验方法进行大肠杆菌蛋白质残留量检测时,DNA疫苗原液无需进行稀释。NMM抗肿瘤DNA疫苗原液对大肠杆菌菌体蛋白质的检测无干扰及抑制作用,方法的专属性良好;本法检测限为0.41 ng/ml;定量限为0.98 ng/ml;该方法测定宿主菌蛋白质残留量在0~100 ng/ml范围内线性良好,R^(2)≥0.9999;本方法重复性试验中宿主菌蛋白质含量RSD值均低于15%,中间精密度实验中样品吸光值RSD值低于10%,精密度结果良好。在检测线性范围内加入高、中、低3种浓度的大肠杆菌菌体蛋白,回收率均值为100.35%(n=9,RSD=3.58%);本方法检测实验条件发生微小变动时(不同人员、不同批次试剂盒),对测定结果的影响在可接受范围内。应用该方法对5批NMM抗肿瘤DNA疫苗原液中大肠杆菌蛋白质残留量进行检测,大肠杆菌菌体蛋白残留量均在1 ng/mg左右,远低于相关指导原则中规定的不高于1μg/mg的质量标准。结论该方法可用于NMM抗肿瘤DNA疫苗原液中宿主菌蛋白质含量的检测。

基因重组乳链球菌防龋疫苗免疫性的实验研究

【目的】测定基因重组乳链球菌防龋疫苗的免疫原性和免疫反应性。【方法】用基因重组乳链球菌 (HL 10 7)、乳链球菌 (LM 0 2 30 )、变形链球菌Ingbritt分别灌胃免疫实验动物BALB/c鼠 ,与未免疫组作对照 ,以酶联免疫吸附实验 (ELISA)测定血清及唾液中的抗变形链球菌表面蛋白PAc的特异性IgG和IgA。【结果】基因重组乳链球菌组血清中抗PAc IgG水平明显高于乳链球菌组 (P <0 0 1)、变形链球菌组 (P <0 0 5 )和未免疫组 (P <0 0 1) ,唾液中重组乳链球菌组抗PAc IgA抗体水平明显高于乳链球菌组 (P <0 0 1)和未免疫组 (P <0 0 1) ,与变形链球菌组无差别 (P >0 0 5 ) ,血清IgA和唾液IgG的水平在 4组中均无差别 (P >0 0 5 )。【结论】基因重组乳链球菌具有变形链球菌表面蛋白的免疫原性 。

家畜繁殖生物技术研究现状及趋势

牛胚胎移植技术已趋于成熟。我国新疆牧科院用一步细管法移植牛冻胚受胎率达41%;牛和羊鲜胚四分胚移植也产下1头犊牛和6只羔羊。家畜体外受精,因卵子体外成熟和受精卵体外培养尚不过关,目前仍停留在实验室阶段。胚胎性别鉴定,1990年Koopman发现单拷贝基因,该基因是Y染色体的性决定区,命名为SRY,可利用PCR技术制成雄性特异DNA探针盒,进行马、牛、羊、猪早期胚胎性别鉴定。北京农学院等单位用PCR扩增牛SRY序列进行奶牛胚胎性别鉴定准确率达100%。英、日、法等国已获得牛胚胎细胞核移植后代;我国也获得1只核移植兔。北农大和新疆牧科院合作以绵羊精子为载体导入牛生长激素基因rMTbGH DNA成功,外源基因整合率为3%。

荧光法和DNA杂交法检测重组技术产品中残余DNA的比较

目的:对用于检测重组技术产品中残余DNA的荧光法及DNA杂交法进行比较性评价。方法:应用地高辛标记的DNA杂交法以及PicoGreen荧光法对3批重组人干扰素α2b中外源DNA残留量进行测定。结果:荧光法检测结果显示3批重组人干扰素α2b制品中DNA残留量分别为每人份剂量(0.695±0.021)ng、(0.664±0.021)ng、(0.916±0.017)ng,而用地高辛标记的DNA杂交实验由于阳性基因组DNA灵敏度偏低以至于结果无法判断。应用琼脂糖凝胶电泳和PicoGreen荧光法测得由生产单位提供的阳性DNA浓度明显偏低,与标示量不符,这说明阳性DNA含量偏低是本次DNA杂交实验失败的主要原因。通过对该阳性DNA重新定量后再进行DNA杂交检测,结果显示3批重组人干扰素α2b制品的DNA残留量均小于每人份剂量1ng,该结果与PicoGreen荧光法相一致。结论:荧光法具有简便、快速,自动化程度高,不受工程菌种类限制,能够精确定量等特点,优于传统的DNA杂交法,更适于重组制品残余外源DNA含量的常规检定。

实时定量PCR检测重组技术产品中宿主基因组DNA残留

目的:建立Real-time PCR方法,用于定量检测重组技术产品中宿主基因组DNA的残留。方法:以ABI 7500 FAST平台为基础,选择大肠杆菌23S核糖体RNA基因为靶标基因设计扩增引物,建立基于SYBRGreenI荧光染料的real-timePCR检测方法,用于重组技术产品宿主DNA残留的质量控制。结果:该法检测宿主DNA残留灵敏度可达到1fg(1×10-6ng),DNA浓度在1×10-5～100ng.μL-1范围内线性良好,其标准曲线的相关系数为0.99以上。应用该法对4批重组人粒细胞刺激因子进行测定,外源DNA残留量分别为每剂量6.699×10-3,7.948×10-3,9.362×10-3,7.506×10-3ng。结论:该方法具有操作简便、灵敏度高等优点,可用于重组产品中大肠杆菌残余DNA的定量测定。

2种定量PCR法与探针杂交法在检测重组白介素1受体拮抗剂中宿主DNA残留量的比较

目的：建立Taqman探针技术的定量PCR方法，对大肠杆菌E.coli/BL21菌株生产的重组白介素1受体拮抗剂（rhIL^-1ra）中的残留宿主DNA进行了定量分析，并与SYBR Green法和地高辛探针杂交法进行比较。方法：以BioRad Chromo 4荧光定量PCR仪为平台，选择大肠杆菌23S核糖体RNA基因为靶基因，设计引物和Taqman探针，以纯化的宿主基因组DNA为标准品，对供试品中残留DNA进行定量。同时在重复性，精密度，检测限等方面与SYBR Green方法和地高辛探针杂交法进行比较。结果：本实验建立的Taqman探针法检测限为0.01 ng·mL^-1，在0.01～1000 ng·mL^-1区间同样具有良好的线性（r=0.997），回收率89.7%～136.0%。测定4批次供试品中残留DNA浓度为0.052、0.092、0.096、0.025 ng·mL^-1。结论：Taqman探针法与SYBR Green法检测灵敏度均达到0.01 ng·mL^-1，在重复性与精密度方面效果一致，且均优于探针杂交方法。

一种磁珠提取结合实时荧光定量核酸扩增定量检测重组人血白蛋白中毕赤酵母DNA残留方法的建立

目的探索利用磁珠提取法结合实时荧光定量核酸扩增技术,建立定量测定毕赤酵母来源重组人血白蛋白中残留DNA的方法。方法将蛋白裂解后采用磁珠提取法提取样品中的残留DNA,利用Taqman探针法对样品和DNA标准品进行定量PCR测定,根据标准曲线对样品中的DNA残留量进行分析。采用重组人血白蛋白和血浆来源人血白蛋白2种基质对建立的方法进行回收率和重复性测定,评价方法准确性及精密度,并测定毕赤酵母来源重组人血白蛋白产品中残留DNA含量。结果该方法测定毕赤酵母DNA残留最低准确定量浓度为3 fg·μL^(-1),DNA含量在3 fg·μL^(-1)～300 pg·μL^(-1)内曲线线性良好,标准曲线相关系数r^2为0.998 3;以重组人血白蛋白作为基质时,100和10fg·μL^(-1)DNA加标回收率均值分别为93.58%(n=4)和215.56%(n=4);相对标准偏差RSD分别为19.6%及42.9%;以人血白蛋白作为基质时,100和10 fg·μL^(-1)DNA加标回收率均值分别为67.09%(n=3)和113.40%(n=3);相对标准偏差RSD分别为6.9%和11.1%。按该方法检测毕赤酵母来源的3批重组人血白蛋白DNA残留量均值(n=7)分别为5.98、4.16和4.49 fg·μL^(-1)(n=7);3批样品DNA残留量均小于1 ng·10 g(Pro)^(-1)。结论磁珠分离法结合荧光定量PCR方法可解决超高蛋白浓度背景下重组人血白蛋白痕迹量DNA定量测定的技术难题,准确性和重现性良好,可以用于重组人血白蛋白毕赤酵母DNA残留量的定量检测。

荧光定量PCR法测定重组人/门冬胰岛素原料中宿主DNA的残留量

目的:利用wako DNA提取试剂盒结合荧光定量聚合酶链式反应(PCR)技术,建立重组人/门冬胰岛素原料中宿主DNA残留量测定的方法并进行验证,用于对该产品进行质量控制。方法:通过wako DNA提取试剂盒提取重组人/门冬胰岛素原料中的宿主残留DNA,再利用SYBRGreen染料法对样品和标准DNA进行定量PCR测定,根据标准曲线对样品中的DNA残留量进行分析。对建立的方法进行引物特异性以及结果准确性和精密性验证,同时对本室留样的3批重组人胰岛素原料和3批重组门冬胰岛素原料中的残留DNA进行测定。结果:该方法检测酿酒酵母菌基因组DNA的最低准确定量质量浓度可达0.137 8 ng·mL^(-1),DNA质量浓度在0.137 8~137 800 ng·mL^(-1)范围内,其质量浓度的对数值与Ct值呈良好线性关系,标准曲线的相关系数(r)为0.994;DNA提取试剂盒提取不同量的加标样品回收率均在50%~200%范围内;该方法检测3批重组人胰岛素原料和3批重组门冬胰岛素原料中的DNA残留量均小于10 ng·剂量^(-1),符合进口药品注册标准中关于重组人/门冬胰岛素原料中宿主DNA残留量的要求。结论:wako DNA提取试剂盒能解决重组人/门冬胰岛素原料中样品前处理的技术难点,与定量PCR法结合能够简便、快速、准确地对重组人/门冬胰岛素原料中残留的DNA进行定量测定。

QPCR法与DNA探针杂交法检测重组人生长激素原液中残余DNA的比较

目的对重组人生长激素(recombinant human growth hormone,rhGH)原液中残余DNA检测的实时荧光定量PCR(以下简称QPCR)法和DNA探针杂交法进行对比。方法提取3批rhGH原液中残余DNA,经SYBR GREENⅠ荧光染料法对残余DNA进行QPCR检测,对建立的方法进行准确度、精密度及引物特异性验证,并与《中国药典》三部(2015版)中规定的DNA探针杂交法检测的残余DNA含量进行比较。结果 QPCR法对3批rhGH原液残余DNA含量均可定量,灵敏度可达7. 5 fg。标准品DNA浓度在7. 5 fg/μL～750 pg/μL范围内线性关系良好,R2为0. 998,加标回收率为78. 40%～106. 45%。两种方法检测的3批rhGH原液残余DNA含量均小于《中国药典》三部(2015版)中规定的10 ng/剂量的要求。结论 QPCR法高效快捷,通过DNA与染料结合可实时监控PCR过程中的每一步反应,减小污染,对样品中残余DNA可进行准确定量,比DNA探针杂交法更适用于样品中残余DNA含量的检测。

NMM抗肿瘤治疗性DNA疫苗中卡那霉素残留量检测方法的建立与验证

建立并验证检测NMM抗肿瘤DNA疫苗中卡那霉素残留量的方法。采用间接竞争ELISA方法检测卡那霉素残留量,采用四参数Logstic曲线进行回归分析,并对本方法的专属性、检测限、定量限、线性与范围、精密度、准确度、耐用性等进行验证,验证方法有效后对多批次样品进行检测。使用该方法检测卡那霉素残留量时,样品无需稀释,辅料、质粒DNA对卡那霉素的检测无干扰;本方法检测限为0.15 ng/mL;定量限为0.5 ng/mL;在0.5~40.5 ng/mL范围内线性关系良好,且符合四参数方程式:y=D+(A-D)/[1+(x/C)^(B)],R^(2)≥0.999;在检测线性范围内加入不同浓度的卡那霉素对照溶液,回收率均值在95%~115%之间(n=12,RSD=6.20%);本方法重复性试验中卡那霉素含量RSD值为4.22%(n=6),中间精密度试验中DNA疫苗中卡那霉素含量RSD值为10.95%。本方法检测实验条件发生微小变动时(不同人员、不同批次试剂盒、不同酶标仪),对测定结果的影响在可接受范围内。应用该方法对7批样品中卡那霉素残留量进行检测,结果表明,每个人用剂量(0.3 mg DNA)卡那霉素的残留量均小于0.5 ng。本方法操作简便、准确可靠、专属性强,可用于NMM抗肿瘤DNA疫苗卡那霉素残留量的检定。