重组人肝再生增强因子可抑制肝星状细胞Ⅰ、Ⅲ型胶原的基因表达

在培养的肝星状细胞系中加入不同浓度的重组人肝再生增强因子 (hALR) ,于不同的时间点收集细胞 ,提取总RNA ,用逆转录定量PCR方法测定Ⅰ、Ⅲ型胶原的基因表达水平。结果表明 ,高 ( 0 2ng/L)、中( 0 0 2ng/L)、低 ( 0 0 0 2ng/L)浓度的hALR 3组肝星状细胞Ⅰ型胶原基因表达水平在 8、2 4、48、72h 4个时间点均明显低于对照组 ;大剂量组较中、低剂量组Ⅰ型胶原基因表达水平亦明显为低。中、低剂量hALR组肝星状细胞Ⅲ型胶原基因表达水平在 2 4、48、72h 3个时间点明显低于对照组 ;大剂量hALR组肝星状细胞Ⅲ型胶原基因表达水平在 8、2 4、48、72h 4个时间点均明显低于对照组 ,较中、小剂量组亦显著降低。提示重组人肝再生增强因子对肝星状细胞Ⅰ、Ⅲ型胶原基因表达有明显的抑制作用。

重组血管生成素-Ⅰ基因在大鼠骨髓间充质干细胞中的转染和表达

目的获得能稳定表达重组血管生成素-Ⅰ基因(Ang-Ⅰ)的骨髓间充质干细胞(MSCs),为进一步观察其对急性肺损伤的保护作用奠定实验基础。方法提取人胎盘组织总RNA,RT-PCR扩增出Ang-Ⅰ基因片段,构建Ang-Ⅰ真核表达载体pEGFP-Ang-Ⅰ,利用脂质体介导转染大鼠MSCs,Western blot法检测转基因MSCs的Ang-Ⅰ蛋白表达情况。结果成功构建Ang-Ⅰ真核表达载体,并成功地将其转入MSCs中;MSCs细胞在转染pEGFP-Ang-Ⅰ质粒后,其培养上清中Ang-Ⅰ蛋白表达量显著升高。结论 Ang-Ⅰ基因成功转染至MSCs中,并可进行有效表达,此为进一步观察Ang-Ⅰ对急性肺损伤的保护作用奠定了实验基础。

重组质粒PcDNA3.1/sTNFRⅠ在小鼠体内表达的初步研究

目的检测构建的PcDNA3.1/sTNFRⅠ真核表达载体在小鼠体内能否有效表达目的产物,为探索利用该载体基因治疗TNFα介导的炎性疾病奠定一定的实验基础。方法将PcDNA3.1/sTNFRⅠ载体直接注入小鼠胫前肌,ELISA法检测肌肉匀浆中的sTNFRⅠ表达。结果在注射后7d与10d,PcDNA3.1/sTNFRⅠ注射组小鼠肌肉匀浆中sTNFRⅠ表达的量均显著高于PcDNA3.1注射组(P<0.01),注射后第10天sTNFRⅠ表达量高于第7天sTNFRⅠ表达量(P<0.01)。结论采用直接注射法将PcDNA3.1/sTNFRⅠ载体转移入肌肉内可以使目的基因得到一定的表达。

大鼠心肌肌钙蛋白Ⅰ Asp128Tyr基因突变重组腺病毒载体的构建

目的:构建SD大鼠心肌肌钙蛋白Ⅰ(cardiac troponinⅠ,cTnⅠ)天冬氨酸(Asp,D)128酪氨酸(Tyr,Y)突变(cTnⅠD128Y)重组腺病毒载体,并鉴定。方法:构建野生型SD大鼠cTnⅠ基因全长ORF区克隆,在此基础上,采用PCR定点突变方法对cTnⅠ第128位氨基酸位点引入D128Y突变,将野生型和突变型cTnⅠ基因亚克隆至Adeno-X腺病毒载体,转染HEK 293细胞,包装形成野生型和突变型(Ad-cTnⅠD128Y)重组腺病毒载体;并采用DNA测序、免疫印迹和细胞培养等方法进行鉴定。结果:PCR及测序结果表明,重组腺病毒克隆载体序列正确,免疫印迹证明有融合突变蛋白表达,该突变病毒转染心肌细胞见绿色荧光蛋白表达。结论:本研究成功构建了大鼠cTnⅠD128Y突变重组腺病毒载体,为探讨该突变致心肌肥大的胞内信号通路研究提供了基础。

亚洲Ⅰ型口蹄疫病毒VP1基因重组犬2型腺病毒的构建

应用PCR方法扩增出亚洲Ⅰ型口蹄疫病毒的VP1基因,继而构建出真核表达载体pVAX-VP1。再将含有巨细胞启动子CMV的目的基因表达盒连接到穿梭载体pVAX△E3上,筛选出VP1表达盒方向与E3区转录方向一致的重组子,获得转移载体。再经酶切,连接等方法获得重组腺病毒质粒。利用脂质体介导将重组质粒转染DK细胞,转染3次后,细胞出现明显的腺病毒病变。经PCR扩增、测序检测及基因组酶切鉴定,证明该病毒即为重组犬2型腺病毒。命名为CAV2/FMDV。经验证,该重组毒可稳定遗传,其毒价为103.5TCID50/mL。

HLA-G5-IgGFc融合蛋白真核表达载体的克隆及鉴定

目的 构建人HLA G5 IgGFc融合蛋白真核表达载体。方法 经重组PCR将HLA G5和IgGFc基因拼接并插 入T载体。鉴定后,双酶切得到融合基因并插入真核表达载体pcDNA3.1。结果 PCR、限制性内切酶酶切和序列分析表明 已构建pcDNA3.1 HLA G5表达载体。结论 成功构建了HLA G5 IgGFc段融合蛋白真核表达载体。

人胰岛素样生长因子 Ⅰ 基因的人工半合成和克隆

利用固相亚磷酸三酯法化学合成了人胰岛素样生长因子Ⅰ（ＩＧＦⅠ）结构基因的４条寡核苷酸片段，然后通过１、２和３、４片段末端互补配对和Ｋｌｅｎｏｗ酶促补平成为完整的ＩＧＦⅠ双链ＤＮＡ片段，通过适当的酶切后，克隆于ｐＵＣ１９中，构建了ｐＵＣＩＧＦ克隆载体。经双脱氧末端终止法测序证明，ＤＮＡ序列与我们所设计的ＩＧＦ序列完全一致。

携带GALV. fus基因的重组单纯疱疹病毒-Ⅰ的构建及抗肺腺癌裸鼠荷瘤实验研究

目的探讨重组单纯疱疹病毒-Ⅰ(HSV-Ⅰ)介导的长臂猿白血病病毒致融性外膜糖蛋白(GALV.fus)基因系统对肺腺癌的体内外杀伤效果。方法扩增已成功构建的HSV-UL38P-GALV.fus、HSV-CMVP-GALV.fus、HSV-CMVP-EGFP质粒,在Vero细胞用脂质体转染、包装成重组嗜肿瘤HSV-Ⅰ,分别命名为Synco-2、Synco-1、Baco-1。重组HSV-Ⅰ的纯化采用氯化铯纯化法,病毒滴度测定采用半数组织培养感染剂量法(TCID50)。将构建成功的重组HSV-Ⅰ体外转染肺腺癌细胞(A549)及裸鼠转移瘤模型,模型分A(Control)组、B(Baco-1)组、C(Synco-1)组、D(Synco-2)组、E(Synco-2)组,观察其转染、表达状况及体内外抗肿瘤作用。结果成功包装了3种重组HSV-Ⅰ,TCID50法测得病毒滴度分别为3×1010pfu/mL、1×1011pfu/mL和4×1010pfu/mL。重组病毒对A549细胞有明显的杀灭作用,Synco-1、Synco-2组各时点细胞存活率均低于Baco-1组(P<0.01)。C、D组裸鼠肿瘤体积于第1周及以后各时点小于A、B组(P<0.01);C、D组间前3周肿瘤体积差异无统计学意义(P>0.05),4、5周D组小于C组(P<0.01)。第5周C组〔(0.544±0.07)g〕、D组〔(0.467±0.09)g〕肿瘤质量与A组〔(2.412±0.55)g〕及B组〔(1.522±0.61)g〕相比减轻(P<0.01),C、D组间差异亦有统计学意义(P<0.01)。结论成功包装、扩增及纯化3种重组HSV-Ⅰ,重组GALV.fus基因系统在有效的载体及特异性启动子调控下在体内外对肺癌细胞有强效的抗肿瘤作用,为肺癌治疗探索出一种新型基因治疗方法。

采用绿色荧光蛋白腺病毒载体表达HBsAgCTL优势表位肽MHC单链三聚体

目的采用携带GFP报告基因腺病毒载体表达HBsAg细胞毒性T细胞（CTL）表位MHC单链三聚体，为增强HBV特异性免疫提供新方法。方法构建小鼠MHCⅠ类分子（H-2L^d）限制的HBsAg优势CTL表位肽与MHCⅠ类分子重链（Ld）和β2M链（β2-microglobulin，β2微球蛋白）的单链三聚体（HBsAg—SCT）。并将HBsAg-SCT亚克隆到GFP标记腺病毒载体，以HBsAg和OVA—SCT作为对照，转染293A细胞，包装产生携带HBsAg—SCT，HBsAg和OVA—SCT的重组腺病毒。结果经双酶切和克隆测序鉴定，HBsAg—SCT能成功克隆到编码GFP标记的腺病毒载体，通过荧光显微镜观察到转染的293A细胞含有绿色荧光素蛋白。通过Western Blot进一步证实表达的重组蛋白HBsAg—SCT能与抗-Flag抗体发生反应。结论编码HBsAg—SCT的荧光蛋白腺病毒载体成功构建，并能在293A细胞中完整包装成重组腺病毒颗粒。