PHOⅠ信号肽在毕赤酵母中引导分泌表达天然N-端rBPTI

目的:在毕赤酵母(Pichia pastoris)中分泌表达天然N-端rBPTI。方法:将PHOⅠ/bpti基因克隆到真核表达载体pPICZα,电转化毕赤酵母菌株X-33。结果:构建了含PHOⅠ/bpti基因的表达质粒,并在X-33中分泌表达rBPTI。用胰蛋白酶抑制实验筛选出表达rBPTI的工程菌。表达上清经阳离子交换层析分离纯化为单一组份,SDS-PAGE显示相对分子质量为6 500。结论:PHOⅠ信号肽在毕赤酵母中成功地诱导分泌表达了具有正确N-端氨基酸序列的rBPTI。

重组牛胰蛋白酶抑制剂对小鼠急性肝损伤的保护作用

目的观察重组牛胰蛋白酶抑制剂(rBPTI)对小鼠急性肝损伤的保护作用。方法小鼠60只随机分成6组:正常对照组、模型组、rBPTI的3个剂量组(分别为3、6、12×104kIU·kg-1)、抑肽酶组(6×104kIU·kg-1)。每天腹腔注射给药,7d后体外注射CCl4建立小鼠急性肝损伤模型。末次给药后眼眶取血测定小鼠血清ALT、AST活性,观察肝脏组织病理改变。结果各剂量rBPTI可不同程度降低小鼠血清ALT、AST活性,降低肝组织MDA含量,与模型组比较差异有统计学意义(P<0·05、P<0·01),同时不同程度减轻肝组织病理损伤。结论rBPTI对体外CCl4诱导的小鼠急性肝损伤具有保护作用,作用效果同天然BPTI相当。

重组牛胰蛋白酶抑制剂对大鼠急性胰腺炎的治疗作用

目的:观察重组牛胰蛋白酶抑制剂(rBPTI)对大鼠急性坏死性胰腺炎(ANP)的治疗作用。方法:取大鼠60只,随机分成6组:假手术组、模型组、rBPTI的3个剂量组、抑肽酶组。注射牛磺胆酸钠建立大鼠ANP模型,股静脉注射给药48h后,测定大鼠血清和组织淀粉酶和脂肪酶含量,观察胰腺组织病理变化。结果:rBPTI治疗组可明显降低血清和组织淀粉酶、脂肪酶的浓度,与模型组比较差异有统计学意义(P<0.05,P<0.01),且使胰腺的病理变化减轻。结论:rBPTI对牛磺胆酸钠诱导大鼠ANP具有治疗作用,作用效果同天然BPTI相当。

rhKD/APPvar毕赤酵母分泌表达质粒的构建及其重组蛋白的表达和纯化

目的:构建高效分泌表达重组人淀粉样蛋白前体Kunitz型蛋白酶抑制剂结构域变异体(rhKD/APPvar)的毕氏酵母工程菌,建立适合大规模发酵、纯化rhKD/APPvar的工艺。方法:利用已构建的rhKD/APP表达质粒,在其活性中心两侧设计2个酶切位点(ApaⅠ和SacⅡ),实现人KD/APP活性中心RAM与BPTI活性中心KAR的替换,构建rhKD/APPvar表达质粒。将重组质粒转化到酵母菌X-33中,优化rhKD/APPvar表达最佳pH值,使rhKD/APPvar获得高效表达。利用阳离子交换树脂和超滤除盐对重组蛋白进行纯化。结果:酶切鉴定和测序分析显示成功构建了KD/APPvar-pPICZαC重组质粒。经电转化成功地将重组质粒转化至酵母菌X-33中。SDS-PAGE分析,甲醇诱导表达后在相对分子质量约6 700处出现蛋白条带,pH 6.0、甲醇诱导120h蛋白表达水平最高,经纯化获得纯度达95%的重组蛋白。结论:成功构建KD/APPvar-pPICZαC重组质粒,经毕赤酵母表达和纯化获得了rhKD/APPvar蛋白。