基因重组人骨形成蛋白4成熟肽在大肠杆菌中的大规模发酵表达及纯化

含有编码人骨形成蛋白4成熟肽(Bone morphogenetic protein 4 mature peptide,hBMP-4m)cDNA表达质粒的菌株,经50代传代,质粒不丢失,仍然稳定高表达hBMP-4m。将此菌株导入15 L NBS发酵罐中进行恒溶氧高密度发酵、诱导表达,测定发酵菌液OD600值为43.5,离心收集菌体,PAGE电泳结果hBMP-4m占细菌总蛋白量的39％。悬浮所收集的菌体、裂菌,洗涤后的包涵体中hBMP-4m占蛋白量的85％。将少量包涵体用8 mol尿素缓冲液溶解分别上SP阳离子和Q阴离子交换柱,用连续盐浓度的洗脱液洗脱蛋白,收集各蛋白峰做蛋白电泳分析,找到洗脱液的最合适盐浓度。然后将全部包涵体用8 mol尿素缓冲液溶解,上阳离子交换柱SP柱,以最佳盐浓度洗脱液洗脱,获得纯度为91％的hBMP-4m。再上阴离子交换柱Q柱,最佳盐浓度洗脱液洗脱后,所得hBMP-4m纯度为98％。

重组人骨形成蛋白-4的大规模制备

含有能够高表达重组人骨形成蛋白成熟肽(recombinant human bone morphogenetic protein 4 mature peptide,rhBMP- 4m)质粒的工程菌株,导入15 L NBS发酵罐中进行恒溶氧高密度发酵和诱导表达,测定发酵菌液OD600值为30．8。离心收集菌体, PAGE电泳后光密度扫描表明hBMP-4m占细菌总蛋白量的42％。悬浮所收集的菌体,裂菌,洗涤4次后的包涵体中hBMP-4m占蛋白量的83．2％。预先取少量样品进行探索实验后,全部包涵体用8 mol尿素缓冲液溶解,上SP-Sepharose FF阳离子柱,以0.35 mol NaCl洗脱,获得纯度为96％的hBMP-4m。其收获量为1．34g/L发酵液;收得率为36．4％。结果表明:使用这套工艺流程大规模制备hBMP-4m,能够得到较好的收得率、较高的收获量和纯度。

大肠杆菌表达的重组人BMP-2和hBMP-4成熟肽大规模制备方法的比较

目的:大规模制备人骨形成蛋白成熟肽(hBMP-m):hBMP-4m和hBMP-2m.方法:两种工程菌株分别含有能够高表达hBMP-4m和hBMP-2m的质粒,分别导入15 L NBS发酵罐中进行恒溶氧高密度发酵和诱导表达,离心收集菌体,悬浮所收集的菌体,裂菌,洗涤4次.预先取少量样品进行探索实验后,全部包涵体分别用8 mol/L尿素缓冲液溶解,上Sepharose SP-FF阳离子柱.结果:发酵菌液A600 nm值分别为28.8和26.3.SOS-PAGE电泳后吸光度扫描表明hBMP-4m占细菌总蛋白量的40.0%,hBMP-2m占细菌总蛋白量的47.2%.洗涤4次后的包涵体中hBMP-4m占蛋白量的82.9%,hBMP-2m占蛋白量的84.5%.上Sepharose SP-FF阳离子柱后,分别收集0.35 mol/L NaC l和0.20 mol/L NaC l洗脱部分,获得纯度为96%的hBMP-4m及纯度为95%的hBMP-2m.其收获量分别为1.30 g/L发酵液和1.25 g/L发酵液;收得率分别为34.33%和34.81%.结论:大规模制备hBMP-4m和hBMP-2m时,使用相同的发酵程序及相近的纯化方法,都能够得到较好的收得率、较高的收获量和纯度.