rhIL-13在毕氏酵母中的表达及生物学活性研究

目的 在甲醇营养型毕氏酵母蛋白质表达系统中高效表达重组人白介素 - 13(rhIL - 13) ,便于进一步研究开发。方法 根据酵母对密码子的偏爱性设计并人工合成了人IL - 13编码基因片段 ,经T4DNA连接酶、PCR技术连接形成IL - 13cDNA全长序列 ;将其插入 pPICZαA质粒中 ,构建成 pPICZαA -IL - 13表达载体 ;该载体经SacI线形化后以电转化法导入GS115酵母菌株中 ,经YPD平板Zeocine抗性筛选获得IL - 13表达阳性菌株 ;用WesternBlotting和ELISA检测发酵上清中IL - 13的抗原性和表达量 ,B9-11细胞株分析其生物学活性。结果 15 %SDS -PAGE显示重组人IL - 13分子量约 13kd ,Western -blotting证实为人IL - 13,ELISA测定在摇瓶培养上清表达量达 15 μg/ml,其生物学活性同标准品一样具有剂量依赖性的刺激B9-11细胞株增殖的作用。结论 成功获得IL - 13人工基因和稳定分泌蛋白的基因工程菌株 ,该重组蛋白的生物学活性达到标准品的要求。

人白介素-13对牛主动脉内皮细胞表达黏附分子的影响

目的研究人白介素-13(hIL-13)对牛主动脉内皮细胞(BAECs)表达细胞间黏附分子-1(ICAM-1)和E-选择素的影响,为hIL-13应用于诱导异种移植免疫耐受、减轻异种移植排斥反应提供实验依据. 方法用不同浓度的hIL-13(2、5、10、20及40 ng/ml)孵育 BAECs 2 h后,再与肿瘤坏死因子-α(TNF-α, 4 ng/ml)共孵育6 h或18 h; 应用细胞-酶联免疫吸附分析方法(Cell-ELISA)检测BAECs表面的E-选择素和ICAM-1的表达; 用MTT方法测定hIL-13对BAECs活性的影响. 结果用hIL-13在5～20 ng/ml浓度内预处理BAECs后,能明显抑制TNF-α诱导的E-选择素与ICAM-1的表达,并呈现一定的剂量依赖性(P＜0.01).经不同浓度hIL-13处理的BAECs活性与未经hIL-13处理者相比差异无统计学意义. 结论 hIL-13能明显抑制BAECs表达E-选择素与ICAM-1,诱导异种移植的免疫耐受,且hIL-13对BAECs无损伤作用.

瘤内注射重组人p53腺病毒对鼻咽癌组织中基质金属蛋白酶-13表达的影响及意义

目的探讨瘤内注射重组人p53腺病毒注射液(r Ad-p53)对鼻咽癌原发灶组织基质金属蛋白酶(MMP)-13蛋白表达的影响及临床意义。方法将61例确诊中晚期鼻咽癌的患者分为两组。治疗组32例给予r Ad-p53鼻咽部瘤内注射联合同步放化疗;对照组29例给予同步放化疗。收集r Ad-p53瘤内注射前后患者鼻咽部瘤体活组织标本,采用免疫组化检测标本中MMP-13的表达。结果治疗组患者治疗后MMP-13的阳性表达率下降,且存在淋巴结转移的患者MMP-13阳性表达率下降更明显,而对照组患者治疗后MMP-13阳性表达率升高;治疗后治疗组MMP-13的阳性表达率低于对照组(P<0.05)。治疗组和对照组总体生存率比较无明显差异(P>0.05)。结论 r Ad-p53明显影响鼻咽癌原发灶MMP-13蛋白表达,在淋巴结转移患者中更明显,但对总体生存率的影响尚不明确。

重组人白细胞介素-13对巨核细胞系-Dami细胞原癌基因c-mpl表达的影响

目的 :研究重组人白细胞介素 13 (rhIL 13 )对巨核细胞系 -Dami细胞原癌基因c mpl表达的影响。方法 :实验组细胞培养系统中分别加入 2 5ng/ml,5 0ng/ml,10 0ng/mlrhIL 13 ,对照组不加任何细胞因子。用RT PCR法检测c mplmRNA的表达。结果 :经 2 5ng/ml、5 0ng/ml、10 0ng/mlrhIL 13处理过的实验组Dami细胞较之对照组其c mplmRNA的表达分别提高 2 4 .8%、2 7.9%和 3 1.5 %。结论 :rhIL 13增强了Dami细胞原癌基因c mpl表达 ;rhIL 13促进Dami细胞增殖的部分机制可能是通过上调c mpl的表达来实现的。

重组人白细胞介素-13在大肠杆菌中的表达纯化及鉴定

采用大肠杆菌(Escherichia coli)作为宿主,通过300L发酵罐进行中试发酵表达重组人白细胞介素-13(rhIL-13)融合蛋白;经异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)诱导,离心发酵液收集菌体,菌体经溶解、变性、稀释复性及亲和层析捕获,获得融合蛋白;融合蛋白经肠激酶酶切后,再经亲和层析分离和分子筛精细纯化等步骤,获得高纯度rhIL-13原液.每升发酵液可获得高纯度的rhIL-13原液约30mg.通过本纯化工艺获得的rhIL-13原液经十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)法检测,纯度大于98.75%;经高效液相色谱分子排阻(HPLC-SEC)法检测,纯度为100%;质谱(MS)法测定rhIL-13分子质量为12 348u,与理论值基本一致;采用噻唑蓝(MTT)法进行比活性检测,比活大于8.0×106 IU/mg;采用HPLC-SEC法和MS法对rhIL-13二硫键数目和位置进行分析,结果显示二硫键数目和位置与理论一致.此操作方法可获得高纯度、高活性的rhIL-13原液,并且操作简单,易于放大,可实现工业化规模生产.

人重组白细胞介素-13在毕氏酵母中的表达及其体外诱导DC分化作用的研究

目的:在毕氏酵母中表达重组人IL-13并探讨其对DC的诱导作用。方法:用基因工程的方法人工合成IL-13的全长片段,并转化至毕氏酵母菌株GS115中,筛选后获得表达量相对较高且分泌稳定的rhIL-13基因工程菌株,用rhIL-13来替代IL-4体外诱导DC。结果:得到表达量达25 mg/L且分泌稳定的rhIL-13基因工程菌株;rhIL-13具有rhIL-4同样的体外诱导外周血单核细胞向DC增殖分化的作用,MHCII、CD1α、CD80、CD83、CD86等DC表型分析和混合淋巴细胞反应刺激T细胞增殖的作用与IL-4诱导得到的成熟DC并无显著差别,其所诱导的未成熟DC具有很强的摄取抗原能力。结论:获得表达量相对较高且分泌稳定的rhIL-13基因工程菌株,rhIL-13在体外可有效地诱导外周血单核细胞向DC分化。

Lys-2-rhTNFα及^(125)Ser-rhIL-2促进小鼠腹腔巨噬细胞的肿瘤杀伤活性的研究

研究了 L ys- 2 - rh TNFα(1)及 1 2 5 Ser- rh IL- 2 (2 )对小鼠腹腔巨噬细胞杀伤肿瘤的促进作用。2单用能激活小鼠巨噬细胞对小鼠肥大细胞瘤 P815的细胞毒性 ,1单独无此作用 ,但与 2联合使用能促进 2对巨噬细胞的激活作用。腹腔非粘附细胞的存在是 2或 2联合

活化Notch1信号下调Wnt信号抑制结肠癌细胞增生

目的构建重组反转录病毒载体pCLNRX-ICN,研究过度活化Notch1信号对人结肠癌细胞HT-29细胞增生的影响作用及机制。方法将人Notch1基因胞内区(ICN)克隆至反转录病毒载体pCLNRX中,与包装载体pCL-10A1共转染293细胞,制备重组病毒上清,检测病毒效价。MTT法检测稳定表达外源性ICN对细胞生长的影响,RT-PCR及Western Blot检测c-Myc、β-catenin表达水平。结果成功构建重组反转录病毒载体pCLNRX-ICN,通过共转染获得了具有较高效价的重组反转录病毒。通过表达外源性ICN而过度活化Notch1抑制HT-29的生长,并下调Wnt信号途径关键调控分子β-catenin的蛋白表达水平,但对β-catenin的mRNA水平未见明显影响。而且过度活化Notch1对c-Myc的蛋白及mRNA表达水平均无明显影响。结论过度活化Notch1信号部分通过下调Wnt信号而抑制HT-29的生长,且该作用不依赖c-Myc的抑制。

人β防御素3基因工程菌株的IPTG诱导条件优化

对人β防御素3基因工程菌株BL21-pET-hBD3的摇瓶生长和诱导条件进行了优化.对装液量、接种量和初始pH对菌种生长的影响进行了比较.结果表明,装液量对菌株生长影响最大.IPTG浓度、诱导时间和诱导温度对目的蛋白表达的试验结果显示,温度是一重要影响因素.进一步研究表明,菌株在37℃生长,在28-34℃以0.2 mmol.L-1IPTG诱导4 h对目的蛋白的表达有利,目的蛋白的含量最高可以达到总蛋白的29.8%.

重组人甲状旁腺激素（1-34）对骨质疏松患者血清Cbfa-1和MMP-13水平的影响

探讨重组人甲状旁腺素[rhPTH（1-34）]对绝经后骨质疏松患者血清核心结合因子a-1（Cbfa-1）和基质金属蛋白酶13（MMP-13）水平的影响。rhPTH（1-34）治疗6个月后，血清Cbfa-1[（54．0±2．4）对（62．2±2．8）μg／L，P〈0．05]、MMP-13[（2．51±0．15）对（3．96±0．24）μg／L，P〈0．01]显著降低；相关性分析显示治疗前血清Cbfa-1与MMP-13呈正相关（r=0．74，P〈0．01）。提示小剂量rhPTH（1-34）皮下注射能促进骨的合成，并使血清Cbfa-1和MMP-13水平下降。

吸入用布地奈德联合重组人干扰素α-1b注射液雾化干预对呼吸道合胞病毒感染幼鼠模型血清白介素13水平及CD2^(+)T淋巴细胞占比的影响

目的分析吸入用布地奈德联合重组人干扰素α-1b注射液雾化干预对呼吸道合胞病毒(RSV)感染幼鼠模型血清白介素13(IL-13)水平及CD2^(+)T淋巴细胞占比的影响。方法本实验时间为2020-07-23至2020-08-02。采用随机数字表法将32只SPF级Wistar幼鼠分为空白对照组、阳性对照组、布地奈德组及联合用药组,每组8只。除空白对照组外,其余各组采用滴鼻法建立RSV感染幼鼠模型;从实验第4天开始,空白对照组和阳性对照组幼鼠给予0.9%氯化钠溶液雾化干预,布地奈德组幼鼠给予吸入用布地奈德混悬液雾化干预,联合用药组幼鼠给予吸入用布地奈德混悬液联合重组人干扰素α-1b注射液雾化干预,各组均连续雾化干预5 d。雾化干预结束后,观察各组幼鼠的一般情况,采用酶联免疫吸附试验(ELISA)双抗体夹心法检测各组幼鼠血清IL-13水平,采用流式细胞仪检测各组幼鼠血清CD2^(+)T淋巴细胞占比。结果本实验过程中各组幼鼠均未出现死亡情况,其中空白对照组幼鼠毛发光滑、有光泽,呼吸频率正常,活动自如,精神状态良好,进食正常,体温正常;阳性对照组幼鼠毛发无光泽、竖立,呼吸急促、喘息,伴有发热、寒战,行动迟缓,精神萎靡或烦躁不安,厌食;布地奈德组和联合用药组幼鼠毛发光滑、有光泽,呼吸频率稍快,行动、饮食基本正常,精神状态一般。阳性对照组幼鼠血清IL-13水平、CD2^(+)T淋巴细胞占比高于空白对照组,布地奈德组、联合用药组幼鼠血清IL-13水平高于空白对照组(P<0.05);布地奈德组、联合用药组幼鼠血清IL-13水平、CD2^(+)T淋巴细胞占比低于阳性对照组(P<0.05);联合用药组幼鼠血清IL-13水平低于布地奈德组(P<0.05)。结论吸入用布地奈德联合重组人干扰素α-1b注射液雾化干预可降低RSV感染幼鼠模型血清IL-13水平、CD2^(+)T淋巴细胞占比,其可能通过抑制炎症反应、调节免疫功能而提高治疗效果。