Progress of Domestic Recombinant Human-Like Collagen Research and Application

By intercepting the most effective fragment of human collagen’s gene,recombinant human-like collagen is produced by genetic engineering technology and biotechnology.The collagen has good biocompatibility and can promote cell formation.Recombinant human-like collagen has great potential application value in medical biological materials,cosmetics and foods.In recent years,many specialized enterprises which are engaged in human-like collagen raw materials production have emerged.In this paper,a brief summary of the current recombinant human-like collagen raw material’s production and its latest research and development have been made.

Ⅱ型胶原蛋白的结构、功能及其最新研究进展

Ⅱ型胶原蛋白是动物体内透明软骨的主要成分,具有良好的生物相容性、可降解性、可促进细胞生长和再分化等生物学特性,可作为人体组织工程材料,也可应用于食品、日化、包装等领域。利用基因工程技术生产重组Ⅱ型胶原蛋白是该领域的研究热点。综述了Ⅱ型胶原蛋白的结构、功能及应用,阐述了基因工程技术生产重组Ⅱ型胶原蛋白的最新研究进展,对未来羟化胶原蛋白在大肠杆菌中的大规模生产进行了展望,以期为Ⅱ型胶原蛋白的进一步开发和同行研究提供指导和帮助。

bFGF增强rhBMP-2诱导成骨中Ⅰ、Ⅱ型胶原及碱性磷酸酶的表达

目的 :对bFGF增强rhBMP 2诱导成骨中CollagenⅠ、Ⅱ及碱性磷酸酶 (ALP)的表达进行研究。方法 :110只BALB/c小鼠随机分为 2组 ,每组 5 5只 ,rhBMP 2 /bFGF为实验组 ,rhBMP 2为对照组 ,分别于术后 3～ 2 1d 8个时间点取材 ,用免疫组化法对新生骨组织中的Ⅰ、Ⅱ型胶原进行检测 ;对ALP活性进行定量分析 ,观察 2组在诱导成骨中CollagenⅠ、Ⅱ及ALP的表达情况。结果 :( 1)Ⅱ型胶原和成软骨、软骨细胞的出现相伴随 ,但肥大、变性的软骨细胞并不表达Ⅱ型胶原。 ( 2 )作为成骨细胞成熟标志物的Ⅰ型胶原 ,ALP在软骨形成期即有表达 ,但随着成骨细胞的出现 ,骨组织的形成Ⅰ型胶原表现为高表达 ,而ALP的表达则呈下降趋势。 ( 3)实验组CollagenⅠ、Ⅱ及ALP的表达早于对照组。结论 :bFGF增强了rhBMP 2诱导成骨中CollagenⅠ。

TGF-β增强rhBMP-2诱导成骨中Ⅰ、Ⅱ型胶原mRNA及碱性磷酸酶的表达

目的 :对TGF β增强rhBMP 2诱导成骨中CollagenⅠ、ⅡmRNA及碱性磷酸酶 (ALP)的表达进行研究。方法 :BALB/c小鼠 110只随机分 2组 ,每组 5 5只。rhBMP 2 /TGF β为实验组 ,rhBMP 2为对照组 ,于术后 3～2 1d 8个时间点取材 ,用原位杂交方法对新生骨组织中的Ⅰ、Ⅱ型胶原mRNA进行检测 ;对ALP活性进行定量分析 ,观察 2组在诱导成骨中CollageⅠ、ⅡmRNA及ALP的表达情况。结果 :(1)Ⅱ型胶原mRNA的出现是和成软骨、软骨细胞的出现相伴随的 ;(2 )做为成骨细胞成熟标志物的Ⅰ型胶原mRNA、ALP在软骨形成期即有表达 ,随着成骨细胞的出现 ,骨组织的形成Ⅰ型胶原mRNA仍表现为高表达 ,而ALP的表达则呈下降趋势 ;(3 )实验组CollagenⅠ、ⅡmRNA及ALP的表达早于对照组。结论 :TGF β增强了rhBMP 2诱导成骨中CollagenⅠ、ⅡmRNA及ALP的表达。

rhBMP-2在体内诱导成骨中Ⅰ、Ⅱ型胶原mRNA及碱性磷酸酶的表达

目的 :研究rhBMP 2在体内诱导成骨中CollagenⅠ、ⅡmRNA及碱性磷酸酶 (ALP)的表达。方法 :将含rhBMP 2 0 .5mg的松质骨载体植入BALB/c小鼠的右股部肌袋内 ,于术后 3～ 2 1d间 8个时间点取材 ,用原位杂交法对新生骨组织中的Ⅰ、Ⅱ型胶原mRNA进行检测 ;定量分析ALP活性 ,观察rhBMP 2在诱导成骨中CollagenⅠ、ⅡmRNA及ALP的表达。结果 :( 1)Ⅱ型胶原mRNA的出现是和成软骨、软骨细胞的出现相伴随。肥大、变性的软骨细胞并不表达Ⅱ型胶原mRNA。 ( 2 )作为成骨细胞成熟标志物的Ⅰ型胶原mRNA、ALP在软骨形成期即有表达 ,随着成骨细胞的出现 ,骨组织的形成 ,Ⅰ型胶原mRNA仍表现为高表达 ,而ALP的表达则呈下降趋势。结论 :在体内诱导成骨中rhBMP 2促进了CollagenⅠ。

重组类人胶原蛋白Ⅱ的表达与纯化

研究了类人胶原蛋白Ⅱ在基因工程菌E.coliBL213.7中的表达与纯化。经高密度发酵及代谢调控,重组菌在12.8L发酵罐中的最终菌体密度约为150。菌体经高压匀浆破碎、沉淀、超滤、阳离子交换色谱纯化后,表达产物纯度达96.4%,总回收率71.6%。

类人胶原蛋白Ⅱ的离子交换吸附平衡研究

研究重组类人胶原蛋白Ⅱ(RHLCⅡ)在CM52树脂上的吸附平衡,考察pH值、NaCl浓度及温度对吸附平衡的影响。结果表明:当4.0<pH≤5.0时,随着pH值增大,吸附容量减小,解离系数Kd增大;当3.0≤pH<4.0时,随着pH值增大,吸附容量增大,解离系数Kd减小;随着NaCl浓度增大,吸附容量减小,解离系数Kd增大;温度对Langmuir方程参数的影响较小,温度每升高10℃,吸附容量增加3%左右,解离系数Kd的变化不显著。RHLCⅡ在CM52树脂上的吸附基本符合Langmuir方程,为离子交换法规模制备RHLCⅡ提供了理论依据。

重组大肠杆菌生产类人胶原蛋白Ⅱ的发酵pH优化

为了实现类人胶原蛋白（HLCⅡ）的规模化生产,对重组大肠杆菌BL21 3.7在30 L发酵罐中发酵生产类人胶原蛋白Ⅱ过程中的关键参数pH进行了系统的研究.将发酵过程中pH控制在6.0~7.8之间,监测pH对细胞生长以及类人胶原蛋白Ⅱ的产量的影响,从而确定出合理的pH控制策略增加类人胶原蛋白Ⅱ的产量.由实验数据可得,在pH7.5条件下细胞浓度达到最大,为68.5 g/L,但HCLⅡ的浓度为8.5 g/L.在pH6.8条件下,HLCⅡ浓度达到最大,为10.5 g/L,但其细胞浓度只有60.9 g/L.同时,对发酵过程中代谢副产物有机酸的含量也进行了监测,随着发酵过程pH值的升高,总有机酸的量也相应的增加,当发酵过程pH控制在7.8时,总有机酸达到最大,为15.61 g/L.为了提高目标产物的产量,采用pH两阶段控制策略控制发酵,最终类人胶原蛋白Ⅱ浓度可达到11.3 g/L,较恒pH条件下提高了7.61%.

重组类人胶原蛋白Ⅱ膜的生物相容性

目的探讨用戊二醛交联得到的重组类人胶原蛋白Ⅱ（recombinant human-like collagenⅡ,RHLCⅡ）膜的生物相容性。方法用浓度为0.005 mol/L和0.01 mol/L的戊二醛分别交联RHLCⅡ得到两组RHLCⅡ膜（0.005 mol/L组和0.01 mol/L组）;把成纤维细胞接种到两组RHLCⅡ膜上,用倒置显微镜和扫描电子显微镜观察细胞贴附情况;用MTT法分析成纤维细胞在两组RHLCⅡ膜上的生长和增殖情况;通过细胞毒性实验评价两组RHLCⅡ膜的细胞毒性。结果当成纤维细胞培养到6 h时,均能贴附于两组RHLCⅡ膜上;培养到96 h时,两组RHLCⅡ膜上的成纤维细胞均融合成片并形成多层细胞;经MTT法分析,细胞接种后96 h,成纤维细胞在两组RHLCⅡ膜上均能实现增殖;0.01 mol/L组比0.005 mol/L组细胞毒性要大,但两组在各时间段,毒性评定均在0-1级,细胞毒性实验合格。结论戊二醛浓度为0.005 mol/L和0.01 mol/L的RHLCⅡ膜具有良好的生物相容性。

重组人白细胞介素-1受体拮抗剂对大鼠胶原性关节炎的治疗作用

目的 研究重组人白细胞介素 1受体拮抗剂 (recom binanthumaninterleukin1receptorantagonist, rhIL 1ra)对大鼠胶原性关节炎 (collagen inducedarthritis,CIA)的治疗作用。方法 SD大鼠随机分为 6组:正常对照组、模型组、rhIL 1ra3个剂量组和进口IL 1ra组;采用Ⅱ型胶原(CⅡ)乳剂皮内注射诱导大鼠CIA模型;每周测体重观察体重变化;足爪容积法测量大鼠足爪肿胀度;测定CⅡ的迟发性变态反应(DTH);ELISA法检测血清中抗Ⅱ型胶原抗体水平;同时进行病理组织学的检查。结果 CIA大鼠在致炎d10,出现关节红、肿,体重减轻,血清抗CⅡ抗体水平升高,关节病理可见滑膜增生,炎性细胞浸润,血管翳形成,软骨和骨的破坏等。rhIL 1ra(7 5, 30, 120mg·kg-1 )和阳性对照组anakinra(120mg·kg-1 )皮下注射,连续 7d,能明显抑制CIA大鼠足肿胀;rhIL 1ra(30, 120mg·kg-1 )皮下注射,连续 7d,可以明显减轻CⅡ诱发的迟发性变态反应 (DTH);另外,rhIL 1ra也可明显降低CIA大鼠血清中抗CⅡ抗体的水平;病理学检查表明,rhIL 1ra大剂量能明显减轻CIA大鼠关节滑膜炎症和滑膜增生,减轻血管翳和软骨破坏。结论 rhIL 1ra对CIA具有治疗作用。

重组人Ⅱ型肿瘤坏死因子受体一抗体融合蛋白局部注射治疗胶原诱导性关节炎大鼠的疗效观察

目的 观察局部注射重组人Ⅱ型肿瘤坏死因子受体-抗体融合蛋白（RhTNFR：Fc）对胶原诱导性关节炎（CIA）大鼠的疗效.方法 将24只CIA大鼠随机分为单次治疗组（Ⅰ组）、多次治疗组（Ⅱ组）及空白对照组（Ⅲ组）.所有大鼠均选取病变较重的右踝关节进行局部注射,每周1次共4次.Ⅰ组大鼠首次注射RhTNFR：Fc,随后3次注射生理盐水,Ⅱ组及Ⅲ组大鼠则分别注射4次RhTNFR：Fc或生理盐水.在基线期及每次治疗1周后（分别定义为随访1、2、3及4）均采用关节炎指数（AI）评价大鼠右踝关节及全身炎症的活动状况.完成随访4后检测大鼠血清C反应蛋白（CRP）浓度,并分离右踝关节行X线及病理学检查.结果 Ⅰ组随访1时局部及全身AI较基线期明显降低（P＜0.05）,但随后逐渐回升.Ⅱ组各随访期局部及全身AI均逐渐下降,而Ⅲ组上述指标无下降趋势.Ⅰ、Ⅱ组放射学评分分别为（5.70±0.67）分及（4.90±0.73）分,病理学评分分别为（6.00±0.67）分及（3.80±0.91）分,血清CRP浓度分别为（7.50±0.87） μg/ml及（3.09±0.76） μg/ml,明显低于Ⅲ组的（6.60±1.26）分、（7.10±0.74）分及（12.15 ±3.47） μg/ml（P ＜0.05）,且Ⅰ组显著高于Ⅱ组（P＜0.05）.结论 RhTNFR：Fc单次及多次局部注射均能有效缓解CIA病情,降低CRP浓度、放射学及病理学评分.单次注射病情易反复,疗效不及多次注射.

腺病毒介导的内皮抑素对关节炎大鼠炎症及细胞因子的影响

目的研究重组腺病毒介导的人内皮抑素(nAD-GFP-ES)对大鼠Ⅱ型胶原诱导型关节炎(CIA)炎症及细胞因子的影响。方法首先,扩增并纯化重组腺病毒。然后,建立CIA模型,自造模次日治疗组给予rAD-GFP-ES(1×10^(11)pfu·kg^(-1)·周^(-1)×4周),各组大鼠每周进行一次关节炎指数(AI)评分,于造模第4周取血清行Western Blot检测大鼠体内内皮抑素(ES)、白细胞介素(IL)-1D、肿瘤坏死因子(TNF)-α的表达并计算相对含量。结果①纯化后的rAD-GFP-ES和rAD-GFP滴度分别为：6．6×10^(12) pfu/m1．4．8×10^(12)pfu/ml；吸光度(A)_(260nm)/A_(2180nm)均＞1．3。②感染rAD-GFP-ES的大鼠体内ES获得了稳定表达,是非模型组的2．4倍。③感染rAD-GFP-ES可以降低大鼠AI评分及IL-1β、TNF-α的表达。结论①rAD-GFP- ES注射可使ES基因在大鼠体内获得稳定表达。②感染rAD-GFP-ES能明显降低模型大鼠的AI评分。③IL-1β、TNF-α共同促进CIA大鼠炎症的形成和发展,rAD-GFP-ES可能通过抑制IL-1β、TNF-α的表达而发挥抗炎的作用。